Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Wij waarderen V. Tufano van IMM CNR voor zijn waardevolle technische assistentie en Giacomo Cozzi, product specialist van Nikon Instruments, voor nuttige discussies en voortdurende ondersteuning. Dit werk werd deels gesteund door Italiaanse nationale operatieve Programma's PONa3 00025 (BIOforIU) en door euro-Bioimaging grootschalig panEuropean onderzoeksinfrastructuurproject.

1. het lasersysteem opstarten
<ol><li>Controleer of de temperatuur van de koelmachines bij of onder 20 °C wordt gehandhaafd.</li>
	<li>Controleer of de vochtigheids regeleenheid goed werkt en of de luchtvochtigheid bij een waarde van ongeveer 40% blijft.</li>
	<li>Zet de TI: sa-laser aan, Volg strikt de instructies in de handleiding.</li>
	<li>Stel de golflengte in op 810 nm.</li>
	<li>Schakel de OPO en de aangesloten mini-computer in. Voer de toepassing die de OPO-Laser bestuurt.</li>
	<li>Selecteer bypass</s...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy:+a+tutorial.">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).</li><li>Camp, C. H., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators.">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li><li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology.">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li><li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets:+Size+matters.">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li><li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells:+size+and+optical+density+distribution.">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li><li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage.">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li><li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+distribution+in+living+cells:+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog.">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li><li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples.">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li><li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells:+A+precautionary+note.">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging:+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes.">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li><li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser.">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography.">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117 (2017).</li><li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

SRS microscopie heeft label-vrije beeldvorming naar nieuwe hoogten, vooral in studies van complexe biologische structuren zoals lipiden, die fundamenteel zijn voor cellen en cellulaire architectuur. Lipiden zijn betrokken bij meerdere fysiologische trajecten zoals productie van biologische membranen, en ze dienen als biosynthetische precursoren en signaal transducers10. Lipiden zijn verpakt in gespecialiseerde intracellulaire organellen, ook wel lipide druppeltjes (LDs). Hun diameters variëren va...

In Life Science-toepassingen is SRS microscopie een krachtig hulpmiddel voor label vrije beeldvorming. Het basisidee van SRS microscopie is het combineren van de sterkte van trillational contrast en de mogelijkheid om beelden te verwerven in een paar seconden.
SRS is een proces waarbij het frequentieverschil tussen twee laserstralen frequenties (pomp signaal en Stokes signaal op verschillende frequenties) overeenkomt met de moleculaire trilling van een onderzocht monster, waardoor gestimuleerd Raman verstrooiing en een aanzienlijke verhoging van het Stokes signaal. In tegenstelling tot lineaire Raman-spectroscopie vertoont SRS een niet-lineaire afhankelijkheid van de binnenkomende licht velden en produceert het samenhangende straling. SRS heeft twee fundamentele voordelen: 1) snelheid, waardoor afbeeldingen minder gevoelig zijn voor artefacten die voortvloeien uit monster beweging of degradatie, en 2) een uitstekende signaal-ruis verhouding (SRV). Bovendien vertoont SRS een spectrum dat identiek is aan de spontane Raman, en het SRS-signaal is lineair evenredig aan de concentratie van de chemische obligatie die opgewonden is1,2,3,4, 5.
In onze Microscoop is een femtosecondelaser (FS) SRS experimentele set-up geïntegreerd met een omgekeerde optische Microscoop uitgerust met een snelle spiegels Scanning Unit (Figuur 1)6,7,8. Twee gepulseerde laserbronnen worden gebruikt om deze Microscoop te implementeren. De eerste is een FS-TI: SA met een puls duur van ongeveer 140 FS, herhalingssnelheid van 80 MHz, en emissie golflengten in het bereik van 680-1080 nm. De tweede, gebruikt als sonde straal en gepompt door TI: SA, is een femtosecondelaser gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (SOPO), met een puls duur van ongeveer 200 FS, herhalingssnelheid van 80 MHz, en emissie golflengten in het bereik van 1000-1600 nm. Opgemerkt moet worden dat de minimale foton energieverschil tussen de TI: SA en Sopo Beam is 2500 cm-1. Daarom, met behulp van deze combinatie van lasersystemen, kan alleen de hoge frequentie C-H regio (2800-3200 cm-1) Raman spectra worden verkend6,7,8.
Om een SRS-Microscoop op te zetten, zijn er drie cruciale punten die in de opeenvolgende paragrafen worden beschreven. De eerste is de implementatie van een High-Frequency modulatie overdrachtsmethode (Zie Figuur 2 en stap 2,1 van het protocol voor een beschrijving). In een SRS-experimenteel onderzoek is een cruciale parameter de gevoeligheid van het systeem. Een SRS-signaal wordt gedetecteerd als een kleine verandering in de intensiteit van excitatie balken; Daarom kan het worden beschadigd door laserintensiteit ruis en schot ruis. Dit probleem kan worden overwonnen door de integratie van dit systeem met een High-Frequency modulatie overdrachtsmethode (Zie Figuur 2 en stap 2,1 van het protocol voor meer informatie). Bij deze methode wordt een elektro-optische modulator (EOM) gebruikt om de pomp te moduleren. De modulatie overgebracht naar de sonde straal kan vervolgens worden gedetecteerd door een PD na het blokkeren van de pomp balk met een stapel optische filters [gestimuleerd Raman Gain (SRG) detectiemodus]. De PD-uitgang wordt met een low pass-filter verbonden aan een lock-in versterker (LIA), die het gemeten signaal demoduleert. Door de modulatie frequentie van de straal naar frequenties boven 1 MHz te verhogen, kan de intrinsieke limiet van PDs worden verkregen.
Het tweede punt dat u moet overwegen is de installatie van een mechanische steun die het mogelijk maakt om voorwaartse detectie uit te voeren en tegelijkertijd de observatie van de Microscoop in brightfield te behouden. Daarnaast moet het geluid verminderen door mechanische trillingen tijdens het genereren van beelden en om de precieze herpositionering van het detectiesysteem mogelijk te maken (Zie Figuur 3 en stap 2,2 van het Protocol).
De derde is de synchronisatie van het signaal dat door het fase gevoelige detectie schema wordt verkregen, waarbij de straal op het monster wordt geplaatst dat door de scan kop van de Microscoop wordt bewaakt. Om afbeeldingen te realiseren, hebben de SMs drie TTL-signalen nodig die beschikbaar worden gesteld door de Microscoop-controller die is aangesloten op de scan hoofdeenheid: pixel klok, lijn synchronisatie en frame synchronisatie. De synchronisatie wordt bereikt door het besturen van een PCI-kaart, de drie TTL-signalen en het verkrijgen van een spanningssignaal op het uitgangskanaal van Lia6,7,8. Een zelfgemaakte software is ontwikkeld en beschreven eerder6,7,8, terwijl de hardware van het synchronisatie systeem wordt gerapporteerd in Figuur 4.
Een fundamentele procedure bij het uitvoeren van SRS Imaging is Microscoop uitlijning. Het wordt gerealiseerd in de loop van vier stappen, die in de opeenvolgende alinea's worden beschreven. De eerste is de ruimtelijke overlapping van twee stralen (zie stap 3,1 van het Protocol). In deze experimentele opstelling, de twee balken waren ruimtelijk collinearly gecombineerd door een dichroïde spiegel. De voorbereidende stap is de uitlijning van OPO en TI: sa zodat elk de Microscoop bereikt. Dan, gezien OPO als een referentie straal en gebruik te maken van een positie gevoelige detector, de TI: SA is ruimtelijk overlapt naar OPO.
Het tweede cruciale aspect is de temporele overlapping van twee stralen (zie stap 3,2 van het Protocol). Zelfs als de pomp en OPO balken zijn perfect gesynchroniseerd9, omdat ze iets verschillende straal paden in de OPO behuizing volgen, bij de OPO exit hebben ze een tijdvertraging van ongeveer 5 NS en ruimtelijke verschil van 5 cm. Daarom moeten TI: SA en OPO worden opnieuw getimede met optisch om te zorgen voor tijdelijke overlapping op het voorbeeld. Dit wordt meestal bereikt met een fijnaftunable optische vertragings lijn, die in dit geval tussen de TI: SA en Microscoop wordt ingebracht (Zie Figuur 1). Om de temporele overlap van twee stralen te verkrijgen, worden twee technieken gebruikt. De eerste wordt uitgevoerd met behulp van een snelle PD en oscilloscoop, terwijl de tweede is gebaseerd op auto-en cross-optische correlaties. Met behulp van de eerste techniek wordt een ruwe overlapping van twee stralen verkregen (onzekerheid van 10 PS), terwijl een nauwkeurige temporele overlap van twee stralen wordt verkregen met behulp van een kruis correlator (resolutie van 1 FS).
Het derde cruciale aspect is de uitlijning van de twee stralen in de Microscoop (zie stap 3,3 van het Protocol). Een voorlopige witte licht observatie van het monster maakt het mogelijk om het gewenste gezichtsveld (FOV) te individueren. Daarna worden laserstralen, die de Microscoop door een zijpoort van de Microscoop binnenkomen, uitgelijnd om de PD te bereiken die op het bovenste deel is gemonteerd (Figuur 3). Voor een correcte beeld verwerving is het instellen van een aantal parameters echter vereist (bijvoorbeeld pixeldimensie en pixel dwelltijd). De bemonsteringsfrequentie moet de door de stelling van Nyquist opgelegde beperking respecteren om alle informatie in een afbeelding te behouden, terwijl voor een juiste correspondentie tussen de ruimtelijke coördinaten van pixels en SRS-waarde, gemeten in elke pixel, de integratie tijd van LIA moet gelijk zijn aan of vergelijkbaar zijn met de pixel dwelltijd.
In de laatste stap van de Microscoop-uitlijning worden tal van tests uitgevoerd om de ruimtelijke en temporele uitlijning te optimaliseren (zie stap 3,4 van het Protocol). Een aantal transmissie beelden (TI) voor zowel TI: SA en OPO worden verworven om de ruimtelijke overlap te optimaliseren. In een TI wordt een enkele straal gebruikt, en de uitgezonden straal intensiteit van het monster wordt gemeten door een PD. In het geval van TI gerealiseerd door OPO, het PD-uitgangssignaal is direct verbonden met PCI-kaart, terwijl in het geval van TI gerealiseerd door TI: SA, het PD-uitgangssignaal is aangesloten op LIA en analoge uitgang van LIA is aangesloten op PCI-kaart. De transmissie beelden zijn zeer nuttig voor het optimaliseren van de FOV, de verlichting, de focale positie van de Microscoop doelstellingen en om te controleren of de twee stralen ruimtelijk overlapt6,7,8.
De optimalisering van de tijds overlap van de pomp en de sonde straal wordt verkregen door het scannen van de vertragings lijn met stappen van 0,001 mm overeenkomend met een 3,3 FS tijdverschuiving en het uitvoeren van een SRS-meting in één punt van een polystyreen kraal monster 3 μm in diameter. De amplitude van een SRS-signaal meetwaarden van Lia, als een functie van de sonde-pomp vertraging, en biedt een maximum overeenkomend met exacte temporele overlapping van de twee stralen6,7,8. Voordat u afsluit, moet worden opgemerkt dat alle besproken stappen verplicht zijn om een beeld van hoge kwaliteit te verkrijgen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

Gestimuleerd Raman verstrooiing (SRS) microscopie maakt gebruik van near-infrarood excitatie licht; Daarom deelt het veel multi-photon microscopische Imaging-eigenschappen. SRS Imaging modaliteit kan worden verkregen met behulp van commerciële laserscannende microscopen door het uitrusten met een niet-gedescande voorwaartse detector met de juiste band pass-filters en het detectie schema van de lock-in versterker (LIA). Een schematische lay-out van een typische SRS-Microscoop omvat de volgende: twee gepulseerde laserstralen, (d.w.z. de pomp en sonde in een scan Microscoop), die moet worden overlapt in zowel ruimte en tijd op het beeldvlak, vervolgens gericht door een Microscoop doelstelling in het monster door twee scan spiegels (SMs), die de brandpunt in een x-y-vlak raster. Na interactie met het monster worden verzonden uitgangs pulsen opgevangen door een bovenobjectief en gemeten door een voorwaartse detectiesysteem dat in een omgekeerde Microscoop is ingebracht. Pomp pulsen worden verwijderd door een stapel optische filters, terwijl de sonde pulsen die het resultaat zijn van het SRS-proces dat zich voordoet in het brand volume van het preparaat, worden gemeten met een fotodiode (PD). De aflezen van de PD wordt door de LIA gedemoduleerd om de Modulatiediepte te extraheren. Een tweedimensionale (2D) afbeelding wordt verkregen door de voorwaartse detectie-eenheid te synchroniseren met de Microscoop Scaneenheid. In dit document wordt de implementatie van een SRS-Microscoop beschreven en met succes gedemonstreerd, evenals de rapportage van etiketten vrije beelden van polystyreen kralen met diameters van 3 μm. Het is vermeldenswaard dat SRS microscopen zijn niet commercieel beschikbaar, dus om te profiteren van deze kenmerken, de zelfgemaakte constructie is de enige optie. Aangezien SRS microscopie populair wordt op veel gebieden, wordt aangenomen dat deze zorgvuldige beschrijving van de implementatie van de SRS-Microscoop zeer nuttig kan zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap.

Een voorbeeld van SRS-meting (d.w.z. SRS-meting in één punt van het monster) wordt gerapporteerd in Figuur 7. Wanneer de balken niet in tijd of ruimte worden overlapt, wordt het verkregen resultaat gerapporteerd in figuur 8a. In Off-Resonance, de amplitude van het signaal gemeten door LIA is nul, terwijl de fase van het signaal gemeten door LIA springt tussen negatieve en positieve waarden. Overwegende dat, wanneer de liggers in de ruimte worden overlap...

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing

In dit manuscript wordt de implementatie beschreven van een gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) Microscoop, verkregen door de integratie van een SRS experimentele opstelling met een laser scanning microscoop. De SRS-Microscoop is gebaseerd op twee femtosecondelaser (FS) laserbronnen, een TI-Sapphire (TI: SA) en gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (OPO).

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Dit protocol kan wetenschappers die geïnteresseerd zijn in niet-lineaire microscopie helpen om de belangrijkste componenten, het opzetten en de uitlijningsprocedure van een microscoop op basis van gestimuleerde Raman-verstrooiing te begrijpen. De belangrijkste voordelen van SRS-microscopie zijn de mogelijkheden om labelvrije beeldvorming uit te voeren op basis van trillingscontrast en om binnen enkele seconden een beeld te verwerven. SRS microscopie heeft genomen label-vrije beeldvorming naar nieuwe hoogten vooral studies van complexe biologische structuren zoals lipiden, die fundamenteel zijn voor cellen en cellulaire architectuur.SRS signaal wordt gedetecteerd als een kleine verandering in de intensiteit van de sonde straal en het kan worden beschadigd door ruis. Daarom is een nauwkeurig teken cruciaal. Om te beginnen, lijn de OPO en de Titanium-saffier laserstralen, zodat ze beide de microscoop te bereiken.Plaats vervolgens de detectoren van de laserstraalpositiesensor in twee standen tussen de dichroic mirror one en spiegel zes. De eerste positie bevindt zich dicht bij dichroic spiegel één en de tweede is dicht bij spiegel zes. Gebruik voor elke positie de sensoren om de X- en Y-coördinaten van de OPO-straal te detecteren.Belangrijk is dat de X- en Y-coördinaten van de Titanium-saffierlaserstraal in beide posities van de detectoren van de sensor van dezelfde OPO zijn. Als, in sommige posities, de coördinaten niet samenvallen, stem dan de kanteling van de aangrenzende spiegel af om te compenseren. Volg dezelfde procedure om de Titanium-saffierbalkposities ten opzichte van OPO uit te lijnen voor het pad tussen de zes en zeven spiegel.Installeer een extra spiegel op een flip-flop mount in-tussen spiegel zes en zeven en flip de berg van de spiegel om de balk direct in de autocorrelatie. Power op de autocorrrelator controller, start de software-applicatie op de computer die het bestuurt, en stel de bundel afstand aanpassing schroef van de autocorrrelator op zijn normale positie op 8,35 millimeter. Stop vervolgens de Titanium-saffierbalk en laat de OPO-balk los van de extra spiegel naar de ingangsspiegel van de autocoreerder.Probeer de ingangsspiegel aan te passen om het laserpulssignaal te maximaliseren, zoals hier wordt weergegeven. Stop vervolgens de OPO-balk en laat de Titanium-sapphire balk los van de flip-flop gemonteerde spiegel naar de ingangsspiegel en in de autocorrelatieator. Herhaal de optimale bundelverstelling totdat het hier getoonde autocorrelatiesignaalsignaal is verkregen.Stel nu de balkafstandverstellingsschroef in op de kruispositie op 7,30 millimeter. Laat beide balken los en scan de vertraagde lijn om de twee balken te overlappen. Verkrijg resulterend cross-correlator signaal, zoals hier getoond.Draai vervolgens de flip-flop gemonteerde spiegel, zodat de balken kunnen bereiken spiegel zeven en de scan hoofd van de microscoop. Verwijder de condensor en gebruik de ontsnappingsknop om de 60x subjectieve lens tijdelijk in te trekken. Draai vervolgens de neus-stuk om de 60x subjectieve lens te verplaatsen van het optische pad.Monteer vervolgens de detector aan het bovenste deel van de microscoop met behulp van de externe mechanische bevestiging. Sluit de output van de detector via een 50 Ohm Low Pass Filter aan op een oscilloscoop. Zet nu de processor aan die de scannerkop bestuurt en projecteer de OPO-straal in de scannerkop van de microscoop.Controleer het OPO-signaal en maximaliseer het door de detector gemeten vermogen met behulp van een XY-vertaler. Schakel vervolgens de straal van de OPO-laser in op de Titanium-sapphire laser en controleer of er ook een signaal wordt verkregen voor de Titanium-sapphire laser. Dit geeft aan dat beide balken goed zijn uitgelijnd.Rond de bundel uitlijning door het draaien terug de neus-stuk om de 60x subjectief te introduceren. Gebruik vervolgens de refocus-knop op de microscoop om de definitieve focus op de 60x microscoop objectieve lens te herwinnen. Plaats ten slotte het doel, met een vergroting van 40x, in plaats van de condensor zonder het monster aan te raken of te verstoren.Stel de kracht van de Titanium-sapphire en OPO lasers gemeten voor de microscoop op 30 milliwatt voor beide balken. Stel vervolgens de golflengte van de OPO-laser in op een andere waarde, ten opzichte van de vorige, zodat de pomp en sonde niet in resonantie zijn met de trillingsfrequentie van de kralen. Laat vervolgens beide balken los, zodat ze in de microscoop terechtkomen.Voer de computervertaler voor scanvertragingslijn uit en noteer de gemeten intensiteit met behulp van de lock-in versterker voor elke positie van de vertragingslijn. Wacht tot het scannen van de vertragingslijn is voltooid. Stel nu de golflengte van de OPO terug op 1076 nanometer, zodat de pomp en sonde resonantie zijn met de trillingsfrequentie van de kralen.Voer de computervertaler voor het scannen van vertragingslijn uit en wacht tot het scannen van de vertragingslijn is voltooid. Ten slotte, stel de verkregen overlappende bundel positie en de vertraging lijn voor de volgende verwerving van gestimuleerd Raman verstrooiing beelden. Om de ruimtelijke synchronisatie van de balken te optimaliseren, begint u met het stoppen van de Titanium-saffierbalk en het verminderen van het OPO-vermogen tot acht milliwatt.Sluit vervolgens de uitlezing van de detector aan op de gegevensacquisitiekaart. Voer het data-acquisitieprogramma samen met de microscoopscanconsole uit. Sla het bestand op en verwerkt de gegevens om een afbeelding te krijgen zoals hier wordt weergegeven.Stop vervolgens de OPO-balk en verlaag het Titanium-saffiervermogen tot 2,5 tot 4,5 milliwatt. Sluit de detector aan met de lock-in versterker en de uitlezing met de data-acquisitiekaart. Voer vervolgens opnieuw het data-acquisitieprogramma uit samen met de microscoopscanconsole.Sla het bestand op en verwerkt de gegevens om een afbeelding te krijgen zoals hier wordt weergegeven. Introduceer een stapel filters tussen de 40x doelstelling en de fotodiode om de pomppulsen te verwijderen en alleen het stokesignaal te verkrijgen. Stel vervolgens het pompsignaal in op 810 nanometer met een geconcentreerd vermogen van acht milliwatt.Stel het sondesignaal in op 1076 nanometer met dezelfde gerichte kracht van acht milliwatt om een typische Koolstof-Waterstof binding van polystyreen te onderzoeken met een Raman-verschuiving van 3054 omgekeerde centimeters. Sluit de detector aan met de lock-in versterker en de uitlezing van de lock-in versterker op de data-acquisitiekaart. Ten slotte stelt u het pixelformaat en de aanschaftijd in het microscoopprogramma in en voer deze uit en het systeem voor gegevensverwerving, waarbij het matrixbestand wordt opgeslagen zodra het is voltooid.Een voorbeeldmeting vanaf één punt van het monster wordt hier weergegeven. Wanneer de bundel niet overlapt in tijd of ruimte, is het verkregen resultaat off resonance, waarbij de amplitude van het signaal, gemeten door een lock-in versterker, nul is. De fase van dit signaal, echter, springt tussen negatieve en positieve waarden.Als de balken in de ruimte overlappen, neemt het signaal toe en bereikt het het maximum wanneer de balken perfect overlappen in de tijd, terwijl de fase begint te bereiken een vaste waarde tijdens de tijd waarin de balken worden overlapt. In een transmissiebeeld wordt een enkele straal gebruikt en wordt de overgebrachte straalintensiteit van het monster gemeten door een fotodiode. Aan de linkerkant werd het transmissiebeeld verkregen met behulp van OPO, terwijl aan de rechterkant het transmissiebeeld werd verkregen met behulp van Titanium-saffier.Een typisch voorbeeld van een SRS-afbeelding wordt hier getoond, waarin labelvrije afbeeldingen van polystyreenkralen met diameters van drie micrometer worden gerapporteerd. Om een beeld van hoge kwaliteit te verkrijgen, gebaseerd op SRS-microscopie, is de uitlijning van een microscoop van cruciaal belang. Daarom moeten alle aangegeven stappen in het protocol zorgvuldig worden uitgevoerd.

Research

JoVE Journal

Engineering

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

Implementatie van een Reference Interferometer voor NanoDetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Coherent anti-Stokes Raman Scattering CARS Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) Microscopie Visualiseert Farmaceutische Tabletten tijdens het oplossen

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Meting van Verstrooiing lineariteiten van een Single Plasmonische Nanodeeltje

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Automation of Mode Locking in a Nonlinear Polarization Rotation Fiber Laser through Output Polarization Measurements

Automatisering van Mode Locking in een lineaire Polarisatie Rotatie Fiber Laser tot Uitvoer Polarisatie Metingen

When a laser is mode-locked, it emits a train of ultra-short pulses at a repetition rate determined by the laser cavity length. This article outlines a ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

Gestimuleerde Stokes en Antistokes Raman Scattering in microsferische Whispering Gallery Mode Resonators

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) gebaseerde methodologie om kwantitatief te evalueren voorwaartse en achterwaartse lichtverspreiding van intraculaire objectieven

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

High-Speed Continuous-wave gestimuleerd Brillouin verstrooiing Spectrometer voor materiaal analyse

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

Experimental Implementation of a New Composite Fabrication Method: Exposing Bare Fibers on the Composite Surface by the Soft Layer Method

Experimentele implementatie van een nieuwe methode van de samengestelde Fabrication: bloot blote vezels op het samengestelde oppervlak door de zachte laag-methode

The bipolar plate is a key component in proton exchange membrane fuel cells (PEMFCs) and vanadium redox flow batteries (VRFBs). It is a multi-functional ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

Demonstratie van een Hyperlens-geïntegreerd Microscoop en super resolutie beeldvorming

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Predicting Catalyst Extrudate Breakage Based on the Modulus of Rupture

Voorspellende katalysator Extrudate breuk op basis van de absolute waarde van de breuk

The mechanical strength of extruded catalysts and their natural or forced breakage by either collision against a surface or by a compressive load in a ...