Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Nous apprécions V. Tufano de l'IMM CNR pour sa précieuse assistance technique et Giacomo Cozzi, spécialiste des produits chez Nikon Instruments, pour des discussions utiles et un soutien continu. Ce travail a été partiellement soutenu par les programmes nationaux d'exploitation italiens PONa3 00025 (BIOforIU) et par le projet d'infrastructure de recherche paneuropéenne à grande échelle Euro-Bioimaging.

1. Démarrage du système laser
<ol><li>Vérifiez si la température des refroidisseurs est maintenue à 20 oC ou en dessous.</li>
	<li>Vérifiez si l'unité de contrôle de l'humidité fonctionne correctement et si l'humidité est maintenue à une valeur d'environ 40 %.</li>
	<li>Allumez le laser Ti:Sa, en suivant strictement les instructions dans le manuel.</li>
	<li>Définir la longueur d'onde à 810 nm.</li>
	<li>Allumez l'OPO et le mini-ordinateur connecté. Exécutez l'application qui contrôle le laser OPO.</li>...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy:+a+tutorial.">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).</li><li>Camp, C. H., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators.">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li><li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology.">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li><li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets:+Size+matters.">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li><li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells:+size+and+optical+density+distribution.">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li><li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage.">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li><li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+distribution+in+living+cells:+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog.">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li><li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples.">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li><li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells:+A+precautionary+note.">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging:+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes.">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li><li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser.">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography.">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117 (2017).</li><li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

La microscopie SRS a porté l'imagerie sans étiquette à de nouveaux sommets, en particulier dans les études de structures biologiques complexes telles que les lipides, qui sont fondamentales pour les cellules et l'architecture cellulaire. Les lipides sont impliqués dans de multiples voies physiologiques telles que la production de membranes biologiques, et ils servent de précurseurs biosynthétiques et de transducteurs de signaux10. Les lipides sont emballés dans des organites intracellulair...

Dans les applications des sciences de la vie, la microscopie SRS est devenue un outil puissant pour l'imagerie sans étiquette. L'idée de base de la microscopie SRS est de combiner la force du contraste vibratoire et sa capacité à acquérir des images en quelques secondes.
SRS est un processus dans lequel la différence de fréquence entre deux fréquences de faisceaux laser (signal de pompe et signaux de stokes à différentes fréquences) correspond à la vibration moléculaire d'un échantillon étudié, provoquant une diffusion raman stimulée et une augmentation du signal Stokes. Contrairement à la spectroscopie linéaire de Raman, SRS présente une dépendance non linéaire aux champs lumineux entrants et produit un rayonnement cohérent. Le SRS présente deux avantages fondamentaux : 1) la vitesse, qui rend les images moins sensibles aux artefacts résultant du mouvement ou de la dégradation de l'échantillon, et 2) un excellent rapport signal-bruit (RsN). En outre, SRS présente un spectre identique à la spontanée Raman, et le signal SRS est linéairement proportionnelle à la concentration de la liaison chimique excitée1,2,3,4, 5.
Dans notre microscope, une mise en place expérimentale SRS femtoseconde (fs) est intégrée à un microscope optique inversé équipé d'une unité de balayage de miroirs rapides (Figure 1)6,7,8. Deux sources laser pulsées sont utilisées pour mettre en œuvre ce microscope. Le premier est un fs-Ti:Sa avec une durée d'impulsion d'environ 140 fs, un taux de répétition de 80 MHz, et des longueurs d'onde d'émission de l'ordre de 680-1080 nm. Le second, utilisé comme faisceau de sonde et pompé par Ti:Sa, est un oscillateur paramétrique optique synchronisé femtoseconde (SOPO), avec une durée d'impulsion d'environ 200 fs, un taux de répétition de 80 MHz et des longueurs d'onde d'émission de l'ordre de 1000-1600 nm. Il convient de noter que la différence minimale d'énergie du photon entre le faisceau Ti:Sa et SOPO est de 2500 cm-1. Par conséquent, en utilisant cette combinaison de systèmes laser, seule la région à haute fréquence C-H (2800-3200 cm-1) de spectres Raman peut être exploré6,7,8.
Afin de mettre en place un microscope SRS, il ya trois questions cruciales à considérer, qui sont décrits dans les paragraphes successifs. La première est la mise en œuvre d'une méthode de transfert de modulation à haute fréquence (voir la figure 2 et l'étape 2.1 du protocole pour une description). Dans une enquête expérimentale SRS, un paramètre crucial est la sensibilité du système. Un signal SRS est détecté comme un petit changement dans l'intensité des faisceaux d'excitation; par conséquent, il peut être corrompu par le bruit d'intensité laser et le bruit de tir. Ce problème peut être surmonté en intégrant ce système avec une méthode de transfert de modulation à haute fréquence (voir la figure 2 et l'étape 2.1 du protocole pour plus de détails). Dans cette méthode, un modulateur électro-optique (EOM) est utilisé pour moduler la pompe. La modulation transférée au faisceau de la sonde peut alors être détectée par un après avoir bloqué le faisceau de la pompe avec une pile de filtres optiques [mode de détection de gain Raman stimulé (SRG)]. La sortie est reliée par un filtre de passage bas à un amplificateur de verrouillage (LIA), qui démodule le signal mesuré. En augmentant la fréquence de modulation du faisceau à des fréquences supérieures à 1 MHz, la limite intrinsèque des peut être obtenue.
La deuxième question à considérer est l'installation d'une monture mécanique qui permet d'effectuer la détection vers l'avant et en même temps de préserver l'observation au microscope dans brightfield. En outre, il doit réduire le bruit dû aux vibrations mécaniques lors de la génération d'images et permettre le repositionnement précis du système de détection (voir la figure 3 et l'étape 2.2 du protocole).
Le troisième est la synchronisation du signal acquis par le système de détection sensible à la phase, le faisceau positionné sur l'échantillon surveillé par la tête de balayage du microscope. Afin de réaliser des images, les SM nécessitent trois signaux TTL qui sont mis à disposition par le contrôleur de microscope connecté à l'unité de tête de balayage: horloge de pixel, synchronisation de ligne, et synchronisation de cadre. La synchronisation est réalisée en contrôlant à l'aide d'une carte PCI, les trois signaux TTL, et l'acquisition d'un signal de tension au canal de sortie de LIA6,7,8. Un logiciel fait maison a été développé et décrit précédemment6,7,8, tandis que le matériel du système de synchronisation est rapporté dans la figure 4.
Une procédure fondamentale lors de l'exécution de l'imagerie SRS est l'alignement au microscope. Il est réalisé au cours de quatre étapes, qui sont décrites dans les paragraphes successifs. Le premier est le chevauchement spatial de deux faisceaux (voir l'étape 3.1 du protocole). Dans cette configuration expérimentale, les deux faisceaux ont été spatialement collinaux combinés par un miroir dichroïque. L'étape préliminaire est l'alignement de oPO et Ti:Sa de sorte que chacun atteint le microscope. Ensuite, considérant l'OPO comme un faisceau de référence et profitant d'un détecteur sensible à la position, le Ti:Sa est spatialement superposé à l'OPO.
Le deuxième aspect crucial est le chevauchement temporel de deux faisceaux (voir l'étape 3.2 du protocole). Même si la pompe et les faisceaux OPO sont parfaitement synchronisés9, puisqu'ils suivent des chemins de faisceau légèrement différents à l'intérieur du boîtier de l'OPO, à la sortie de l'OPO, ils ont un délai d'environ 5 ns et une différence spatiale de 5 cm. Par conséquent, Ti:Sa et OPO doivent être réchronométrés optiquement pour assurer un chevauchement temporel à l'échantillon. Ceci est généralement accompli avec une ligne de retard optique finement réglable, qui dans ce cas est insérée entre le Ti:Sa et le microscope (voir Figure 1). Afin d'obtenir le chevauchement temporel de deux faisceaux, deux techniques sont utilisées. Le premier est réalisé à l'aide d'un rapide et d'un oscilloscope, tandis que le second est basé sur des corrélations auto- et interoptiques. À l'aide de la première technique, un chevauchement approximatif de deux faisceaux est obtenu (incertitude de 10 ps), tandis qu'un chevauchement temporel précis de deux faisceaux est obtenu à l'aide d'un corrélateur croisé (résolution de 1 fs).
Le troisième aspect crucial est l'alignement des deux faisceaux à l'intérieur du microscope (voir l'étape 3.3 du protocole). Une observation préliminaire de la lumière blanche de l'échantillon permet d'individualiser le champ de vision souhaité (FOV). Ensuite, les faisceaux laser, entrant au microscope par un port latéral du microscope, sont alignés afin d'atteindre la montée sur la partie supérieure (Figure 3). Toutefois, pour une acquisition d'image correcte, la définition d'un certain nombre de paramètres est nécessaire (par exemple, la dimension pixel et le temps d'habiter le pixel). La fréquence d'échantillonnage doit respecter la contrainte imposée par le théorème de Nyquist afin de préserver toutes les informations dans une image, tandis que pour une correspondance correcte entre les coordonnées spatiales des pixels et la valeur SRS mesurée dans chaque pixel, le temps d'intégration de LIA doit être égal ou comparable au temps d'arrêt pixel.
Dans la dernière étape de l'alignement au microscope, de nombreux tests sont effectués pour optimiser l'alignement spatial et temporel (voir l'étape 3.4 du protocole). Un certain nombre d'images de transmission (TI) pour Ti:Sa et OPO sont acquises afin d'optimiser le chevauchement spatial. Dans un TI, un seul faisceau est utilisé, et l'intensité du faisceau transmis de l'échantillon est mesurée par un. Dans le cas de TI réalisé par OPO, le signal de sortie est directement connecté à la carte PCI, tandis que dans le cas de TI réalisé par Ti:Sa, le signal de sortie est connecté à LIA et la sortie analogique de LIA est connectée à la carte PCI. Les images de transmission sont très utiles pour optimiser le FOV, l'éclairage, la position focale des objectifs du microscope et pour vérifier si les deux faisceaux sont spatialement superposés6,7,8.
L'optimisation du chevauchement temporel de la pompe et du faisceau de la sonde est obtenue en scannant la ligne de retard à l'avance à l'avance à l'avance de 0,001 mm correspondant à un décalage temporel de 3,3 fs et en effectuant une mesure SRS en un seul point d'un échantillon de perles de polystyrène de 3 m de diamètre. L'amplitude d'un signal SRS mesure les valeurs de LA LIA, en fonction du retard de la pompe à sonde, et fournit un maximum correspondant à un chevauchement temporel exact des deux faisceaux6,7,8. Avant de conclure, il convient de noter que toutes les étapes discutées sont obligatoires pour obtenir une image de haute qualité.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

La microscopie de diffusion Raman stimulée (SRS) utilise la lumière d'excitation proche infrarouge; par conséquent, il partage de nombreuses propriétés d'imagerie microscopique multiphoton. La modalité d'imagerie SRS peut être obtenue à l'aide de microscopes à balayage laser commerciaux en équipant d'un détecteur avant non descanné avec des filtres de bande passet appropriés et un système de détection des amplificateurs de verrouillage (LIA). Une disposition schématique d'un microscope SRS typique comprend ce qui suit : deux faisceaux laser pulsés (c.-à-d., la pompe et la sonde dirigées dans un microscope à balayage), qui doivent être superposés dans l'espace et le temps au plan d'image, puis concentrés par un objectif de microscope dans l'échantillon à travers deux miroirs de balayage (SM), qui ratins la tache focale à travers un plan x-y. Après interaction avec l'échantillon, les impulsions de sortie transmises sont recueillies par un objectif supérieur et mesurées par un système de détection vers l'avant inséré dans un microscope inversé. Les impulsions de pompe sont enlevées par une pile de filtres optiques, tandis que les impulsions de sonde qui sont le résultat du processus de SRS se produisant dans le volume focal du spécimen sont mesurées par un photodiode (PD). La lecture de la DP est démoduée par la LIA pour extraire la profondeur de modulation. Une image bidimensionnelle (2D) est obtenue en synchronisant l'unité de détection avant avec l'unité de balayage au microscope. Dans cet article, la mise en œuvre d'un microscope SRS est décrite et démontrée avec succès, ainsi que la déclaration d'images sans étiquette de perles de polystyrène d'un diamètre de 3 m. Il est à noter que les microscopes SRS ne sont pas disponibles dans le commerce, donc afin de profiter de ces caractéristiques, la construction maison est la seule option. Étant donné que la microscopie SRS est de plus en plus populaire dans de nombreux domaines, on croit que cette description minutieuse de la mise en œuvre du microscope SRS peut être très utile pour la communauté scientifique.

Un exemple de mesure du SRS (c.-à-d. mesure Du SRS dans un seul point de l'échantillon) est rapporté à la figure 7. Lorsque les faisceaux ne se chevauchent pas dans le temps ou l'espace, le résultat obtenu est rapporté à la figure 8a. En hors résonance, l'amplitude du signal mesurée par LIA est nulle, tandis que la phase de signal mesurée par LIA saute entre les valeurs négatives et positives. Considérant que, lorsque les faisceaux se chevauch...

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Mise en œuvre d'un microscope non linéaire basé sur la diffusion stimulée de Raman

Dans ce manuscrit, la mise en œuvre d'un microscope à diffusion Raman (SRS) stimulé, obtenue par l'intégration d'un sER expérimental avec un microscope à balayage laser, est décrite. Le microscope SRS est basé sur deux sources laser femtoseconde (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) et un oscillateur paramétrique optique synchronisé (OPO).

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Ce protocole peut aider les scientifiques intéressés par la microscopie non ligneuse à comprendre les composants clés, la mise en place et la procédure d’alignement d’un microscope basé sur la diffusion raman stimulée. Les principaux avantages de la microscopie SRS sont ses capacités à effectuer une imagerie sans étiquette basée sur le contraste vibratoire et à acquérir une image en quelques secondes. La microscopie SRS a conduit l’imagerie sans étiquette à de nouveaux sommets, en particulier les études de structures biologiques complexes telles que les lipides, qui sont fondamentales pour les cellules et l’architecture cellulaire.Le signal SRS est détecté comme un petit changement dans l’intensité du faisceau de sonde et il peut être corrompu par le bruit. Par conséquent, un signe précis est crucial. Pour commencer, alignez les faisceaux laser OPO et Titanium-saphir afin qu’ils atteignent tous les deux le microscope.Ensuite, placez les détecteurs du capteur de position du faisceau laser en deux positions entre le miroir dichroïque un et le miroir six. La première position est située près du miroir dichroïque un et la seconde est proche du miroir six. Pour chaque position, utilisez les capteurs pour détecter les coordonnées X et Y du faisceau OPO.Fait important, vérifiez que les coordonnées X et Y du faisceau laser titane-saphir sont du même OPO dans les deux positions des détecteurs du capteur. Si, dans certaines positions, les coordonnées ne coïncident pas, réglez l’inclinaison du miroir adjacent pour compenser. Suivez cette même procédure pour aligner les positions du faisceau titane-saphir par rapport à l’OPO pour le chemin entre les six et sept du miroir.Installez un miroir supplémentaire sur une monture flip-flop entre le miroir six et sept et retournez la monture du miroir pour diriger le faisceau dans l’autocorrelateur. Puissance sur le contrôleur autocorrelateur, démarrer l’application logicielle sur l’ordinateur qui le contrôle, et définir la vis de réglage de distance de faisceau de l’autocorrelator à sa position normale à 8,35 millimètres. Ensuite, arrêtez le faisceau titane-saphir et relâchez et projetez le faisceau OPO du miroir supplémentaire au miroir d’entrée de l’autocorrelateur.Essayez d’ajuster le miroir d’entrée pour maximiser le signal d’impulsion laser comme indiqué ici. Ensuite, arrêtez le faisceau OPO et relâchez et projetez le faisceau titane-saphir du miroir monté sur tong au miroir d’entrée et dans l’autocorrelateur. Répétez le réglage optimal du faisceau jusqu’à ce que le signal autocorrelateur, indiqué ici, soit obtenu.Maintenant, réglez la vis d’ajustement de distance de faisceau à la position transversale à 7.30 millimètres. Relâchez les deux poutres et numérisez la ligne retardée pour chevaucher les deux poutres. Obtenez le signal trans-corrélateur qui en résulte, comme le montre ici.Ensuite, retournez le miroir monté sur tongs afin que les poutres puissent atteindre le miroir sept et la tête de balayage du microscope. Retirez le condenseur et utilisez le bouton d’échappement pour retirer temporairement l’objectif subjectif 60x. Faites ensuite pivoter le morceau de nez pour déplacer l’objectif subjectif 60x hors du chemin optique.Ensuite, montez le détecteur dans la partie supérieure du microscope à l’aide de la monture mécanique externe. Connectez la sortie du détecteur à travers un filtre de passage bas de 50 Ohm à un oscilloscope. Maintenant, allumez le processeur qui contrôle la tête du scanner et projetez le faisceau OPO dans la tête du scanner du microscope.Surveillez le signal OPO et maximisez la puissance mesurée par le détecteur à l’aide d’un traducteur XY. Ensuite, passez du laser OPO au laser Titanium-saphir et vérifiez qu’un signal est également obtenu pour le laser titane-saphir. Cela indique que les deux poutres sont bien alignées.Finaliser l’alignement du faisceau en faisant pivoter le morceau de nez pour introduire le subjective 60x. Ensuite, utilisez le bouton de recentrage sur le microscope pour retrouver la mise au point finalisée à la lentille objectif microscope 60x. Enfin, placez l’objectif, avec un grossissement de 40x, à la place du condenseur sans toucher ni déranger l’échantillon.Réglez la puissance des lasers Titanium-saphir et OPO mesurés avant le microscope à 30 milliwatts pour les deux faisceaux. Ensuite, réglez la longueur d’onde du laser OPO à une valeur différente, par rapport à la précédente, de sorte que la pompe et la sonde ne sont pas en résonance avec la fréquence vibratoire des perles. Ensuite, relâchez les deux faisceaux, de sorte qu’ils entrent dans le microscope.Exécutez le traducteur informatisé de la ligne de délai de numérisation et enregistrez l’intensité mesurée à l’aide de l’amplificateur de verrouillage pour chaque position de la ligne de retard. Attendez que la numérisation de la ligne de retard soit terminée. Maintenant, réglez la longueur d’onde de l’OPO à 1076 nanomètres, de sorte que la pompe et la sonde sont en résonance avec la fréquence vibratoire des perles.Exécutez le traducteur informatisé de la ligne de délai de numérisation et attendez que la numérisation de la ligne de retard soit terminée. Enfin, définissez la position obtenue du faisceau de chevauchement et la ligne de retard pour la prochaine acquisition d’images de diffusion Raman stimulées. Pour optimiser la synchronisation spatiale des faisceaux, commencez par arrêter le faisceau titane-saphir et réduisez la puissance de l’OPO à huit milliwatts.Ensuite, connectez la lecture du détecteur à la carte d’acquisition de données. Exécutez le programme d’acquisition de données avec la console de numérisation au microscope. Une fois terminé, enregistrez le fichier et traiter les données pour obtenir une image comme celle affichée ici.Ensuite, arrêtez le faisceau OPO et réduisez la puissance titane-saphir à 2,5 à 4,5 milliwatts. Connectez le détecteur avec l’amplificateur de verrouillage et ses réadages avec la carte d’acquisition de données. Ensuite, encore une fois exécuter le programme d’acquisition de données avec la console de numérisation microscope.Une fois terminé, enregistrez le fichier et traiter les données pour obtenir une image comme celle affichée ici. Introduisez une pile de filtres entre l’objectif 40x et le photodiode pour enlever les impulsions de la pompe et n’acquérir que le signal de charge. Ensuite, réglez le signal de la pompe à 810 nanomètres avec une puissance focalisée de huit milliwatts.Réglez le signal de la sonde à 1076 nanomètres avec la même puissance focalisée de huit milliwatts pour étudier une liaison carbone-hydrogène typique de polystyrène avec un décalage Raman de 3054 centimètres inverses. Connectez le détecteur à l’amplificateur de verrouillage et à la lecture de l’amplificateur de verrouillage à la carte d’acquisition de données. Enfin, définissez le format pixel et le temps d’acquisition dans le programme microscope et exécutez-le et le système d’acquisition de données, en sauvant le fichier matricielle une fois qu’il est terminé.Une mesure d’exemple à partir d’un seul point de l’échantillon est affichée ici. Lorsque le faisceau ne se chevauche pas dans le temps ou l’espace, le résultat obtenu est hors résonance, où l’amplitude du signal, mesurée par un amplificateur de verrouillage, est nulle. La phase de ce signal, cependant, saute entre les valeurs négatives et positives.Si les faisceaux se chevauchent dans l’espace, le signal augmente et atteint son maximum lorsque les faisceaux se chevauchent parfaitement dans le temps, tandis que la phase commence à atteindre une valeur fixe pendant le temps où les faisceaux se chevauchent. Dans une image de transmission, un seul faisceau est utilisé et l’intensité du faisceau transmis à partir de l’échantillon est mesurée par une photodiode. Sur la gauche, l’image de transmission a été obtenue à l’aide d’OPO, tandis qu’à droite, l’image de transmission a été obtenue à l’aide de titane-saphir.Un exemple typique d’une image SRS est montré ici, dans lequel des images sans étiquette de perles de polystyrène avec des diamètres de trois micromètres sont rapportées. Afin d’obtenir une image de haute qualité, basée sur la microscopie SRS, l’alignement d’un microscope est essentiel. Par conséquent, toutes les étapes indiquées du protocole doivent être effectuées avec soin.

Research

JoVE Journal

Engineering

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

La mise en œuvre d&#39;un interféromètre de référence pour Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Recherche

Ingénierie

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Coherent anti-Stokes Raman Scattering CARS Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Anti-Stokes cohérente Raman Scattering (CARS) Microscopie visualise pharmaceutiques comprimés lors de la dissolution

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Mesure de la diffusion non-linéarités d&#39;une nanoparticule plasmonique Simple

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Automation of Mode Locking in a Nonlinear Polarization Rotation Fiber Laser through Output Polarization Measurements

Automatisation du mode de verrouillage dans un Nonlinear Polarisation Rotation fibre laser par Polarisation sortie Mesures

When a laser is mode-locked, it emits a train of ultra-short pulses at a repetition rate determined by the laser cavity length. This article outlines a ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

Stimulé Stokes et antistokes Raman Scattering dans microsphériques Galerie Whispering mode Resonators

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Méthodologie basée sur le Profiler de diffusion de lumière de balayage (SLPS) pour évaluer quantitativement la diffusion de lumière vers l&#39;avant et vers l&#39;arrière à partir de lentilles intraoculaires

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

Spectromètre à diffusion Brillouin stimulée onde continue à grande vitesse pour l’analyse des matériaux

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

Experimental Implementation of a New Composite Fabrication Method: Exposing Bare Fibers on the Composite Surface by the Soft Layer Method

Mise en œuvre expérimentale d’une nouvelle méthode de Fabrication Composite : exposer nus fibres sur la Surface Composite par la méthode de la couche molle

The bipolar plate is a key component in proton exchange membrane fuel cells (PEMFCs) and vanadium redox flow batteries (VRFBs). It is a multi-functional ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

Démonstration d’un Microscope intégré Hyperlens et Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Predicting Catalyst Extrudate Breakage Based on the Modulus of Rupture

Predicting catalyseur extrudat rupture basé sur le module de Rupture

The mechanical strength of extruded catalysts and their natural or forced breakage by either collision against a surface or by a compressive load in a ...