Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
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Wir schätzen V. Tufano von IMM CNR für seine wertvolle technische Unterstützung und Giacomo Cozzi, Produktspezialist von Nikon Instruments, für nützliche Diskussionen und kontinuierliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von den italienischen Nationalen Operativen Programmen PONa3 00025 (BIOforIU) und dem großangelegten europaweiten Forschungsinfrastrukturprojekt Euro-Bioimaging unterstützt.

1. Inbetriebnahme des Lasersystems
<ol><li>Prüfen Sie, ob die Temperatur der Kühler bei oder unter 20 °C gehalten wird.</li>
	<li>Prüfen Sie, ob die Feuchtigkeitskontrolleinheit ordnungsgemäß funktioniert und die Luftfeuchtigkeit bei etwa 40 % gehalten wird.</li>
	<li>Schalten Sie den Ti:Sa-Laser ein und folgen Sie dabei den Anweisungen im Handbuch.</li>
	<li>Stellen Sie die Wellenlänge auf 810 nm ein.</li>
	<li>Schalten Sie den OPO und den angeschlossenen Minicomputer ein. Führen Sie die Anwendung aus, die den...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. 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A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

Die SRS-Mikroskopie hat die etikettenfreie Bildgebung in neue Höhen gehoben, insbesondere in Studien komplexer biologischer Strukturen wie Lipide, die für Zellen und zelluläre Architektur von grundlegender Bedeutung sind. Lipide sind an mehreren physiologischen Wegen wie der Produktion biologischer Membranen beteiligt und dienen als biosynthetische Vorläufer und Signalwandler10. Lipide werden in spezialisierte intrazelluläre Organellen verpackt, auch Lipidtröpfchen (LDs) genannt. Ihre Durchm...

In Life-Science-Anwendungen hat sich die SRS-Mikroskopie als leistungsfähiges Werkzeug für die etikettenfreie Bildgebung herauskristallisiert. Die Grundidee der SRS-Mikroskopie besteht darin, die Stärke des Schwingungskontrasts und seine Fähigkeit, Bilder in wenigen Sekunden zu erfassen, zu kombinieren.
SRS ist ein Prozess, bei dem der Frequenzunterschied zwischen zwei Laserstrahlenfrequenzen (Pumpensignal und Stokes-Signal bei unterschiedlichen Frequenzen) mit der molekularen Schwingung einer untersuchten Probe übereinstimmt, wodurch eine stimulierte Raman-Streuung und eine signifikante Erhöhung des Stokes-Signals. Im Gegensatz zur linearen Raman-Spektroskopie weist SRS eine nichtlineare Abhängigkeit von den eingehenden Lichtfeldern auf und erzeugt kohärente Strahlung. SRS hat zwei grundlegende Vorteile: 1) Geschwindigkeit, die Bilder weniger empfindlich gegenüber Artefakten macht, die durch Probenbewegung oder -degradation entstehen, und 2) ein ausgezeichnetes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Darüber hinaus weist SRS ein Spektrum auf, das mit dem spontanen Raman identisch ist, und das SRS-Signal ist linear proportional zur Konzentration der angeregten chemischen Bindung1,2,3,4, 5.
In unserem Mikroskop ist ein Femtosekunden-SRS-Experimentalaufbau mit einem invertierten optischen Mikroskop integriert, das mit einer schnellen Spiegel-Scaneinheit ausgestattet ist (Abbildung 1)6,7,8. Zur Implementierung dieses Mikroskops werden zwei gepulste Laserquellen verwendet. Die erste ist ein fs-Ti:Sa mit einer Pulsdauer von ca. 140 fs, einer Wiederholungsrate von 80 MHz und Emissionswellenlängen im Bereich von 680-1080 nm. Der zweite, der als Sondenstrahl verwendet und von Ti:Sa gepumpt wird, ist ein femtosekundensynchronisierter optischer parametrischer Oszillator (SOPO) mit einer Pulsdauer von ca. 200 fs, einer Wiederholungsrate von 80 MHz und Emissionswellenlängen im Bereich von 1000-1600 nm. Es sollte beachtet werden, dass die minimale Photonenenergiedifferenz zwischen dem Ti:Sa- und SOPO-Strahl 2500 cm-1beträgt. Daher kann mit dieser Kombination von Lasersystemen nur der Hochfrequenz-C-H-Bereich (2800-3200 cm-1) der Raman-Spektren 6,7,8untersucht werden.
Um ein SRS-Mikroskop einzurichten, gibt es drei entscheidende Fragen zu berücksichtigen, die in den aufeinanderfolgenden Absätzen beschrieben werden. Die erste ist die Implementierung einer Hochfrequenzmodulationsübertragungsmethode (siehe Abbildung 2 und Schritt 2.1 des Protokolls für eine Beschreibung). In einer sRS-experimentellen Untersuchung ist ein entscheidender Parameter die Empfindlichkeit des Systems. Ein SRS-Signal wird als kleine Änderung der Intensität der Anregungsstrahlen erkannt; daher kann es durch Laserintensitätsgeräusche und Schussgeräusche beschädigt werden. Dieses Problem kann durch die Integration dieses Systems in eine hochfrequente Modulationsübertragungsmethode behoben werden (Details siehe Abbildung 2 und Schritt 2.1 des Protokolls). Bei diesem Verfahren wird ein elektro-optischer Modulator (EOM) verwendet, um die Pumpe zu modulieren. Die auf den Sondenstrahl übertragene Modulation kann dann von einem PD erfasst werden, nachdem der Pumpenstrahl mit einem Stapel optischer Filter [stimulierter Raman Gain (SRG) Erkennungsmodus] blockiert wurde. Der PD-Ausgang wird über einen Tiefpassfilter mit einem Einsperrverstärker (LIA) verbunden, der das gemessene Signal demoduliert. Durch die Erhöhung der Modulationsfrequenz des Strahls auf Frequenzen über 1 MHz kann die intrinsische Grenze von PDs erreicht werden.
Das zweite zu berücksichtigende Problem ist die Installation einer mechanischen Halterung, die es ermöglicht, eine Vorwärtserkennung durchzuführen und gleichzeitig die Mikroskopbeobachtung im Hellen Feld zu erhalten. Darüber hinaus muss es das Rauschen durch mechanische Vibrationen während der Erzeugung von Bildern reduzieren und eine präzise Neupositionierung des Detektionssystems ermöglichen (siehe Abbildung 3 und Schritt 2.2 des Protokolls).
Die dritte ist die Synchronisation des signals, das durch das phasenempfindliche Detektionsschema erfasst wird, wobei der Strahl auf der Probe positioniert ist, die vom Scankopf des Mikroskops überwacht wird. Um Bilder zu realisieren, benötigen die SMs drei TTL-Signale, die über den mikroskopischen Controller zur Verfügung gestellt werden, der mit der Scankopfeinheit verbunden ist: Pixeluhr, Liniensynchronisierung und Frame-Synchronisation. Die Synchronisation erfolgt durch Steuerung über eine PCI-Karte, die drei TTL-Signale und die Erfassung eines Spannungssignals am Ausgangskanal von LIA6,7,8. Eine hausgemachte Software wurde zuvor entwickelt und beschrieben6,7,8, während die Hardware des Synchronisationssystems in Abbildung 4berichtet wird.
Ein grundlegendes Verfahren bei der Durchführung der SRS-Bildgebung ist die Mikroskopausrichtung. Es wird im Laufe von vier Schritten realisiert, die in den aufeinanderfolgenden Absätzen beschrieben werden. Der erste ist die räumliche Überlappung zweier Balken (siehe Schritt 3.1 des Protokolls). In diesem Versuchsaufbau wurden die beiden Strahlen räumlich durch einen dichroitischen Spiegel miteinander kombiniert. Der vorläufige Schritt ist die Ausrichtung von OPO und Ti:Sa, so dass jeder das Mikroskop erreicht. Wenn man dann OPO als Referenzstrahl betrachtet und einen positionsempfindlichen Detektor ausnutzt, wird der Ti:Sa räumlich mit OPO überlappt.
Der zweite entscheidende Aspekt ist die zeitliche Überlappung zweier Strahlen (siehe Schritt 3.2 des Protokolls). Auch wenn die Pumpe und OPO-Träger perfekt synchronisiert sind9, da sie leicht unterschiedlichen Strahlwegen innerhalb des OPO-Gehäuses folgen, haben sie am OPO-Ausgang eine Zeitverzögerung von ca. 5 ns und eine räumliche Differenz von 5 cm. Daher müssen Ti:Sa und OPO optisch neu getaktet werden, um eine zeitliche Überlappung an der Probe zu gewährleisten. Dies wird in der Regel mit einer fein einstellbaren optischen Verzögerungslinie erreicht, die in diesem Fall zwischen Ti:Sa und Mikroskop eingefügt wird (siehe Abbildung 1). Um die zeitliche Überlappung zweier Strahlen zu erhalten, werden zwei Techniken verwendet. Die erste wird mit einem schnellen PD und Oszilloskop durchgeführt, während die zweite auf auto- und queroptischen Korrelationen basiert. Mit der ersten Technik wird eine grobe Überlappung von zwei Strahlen erhalten (Unsicherheit von 10 ps), während eine genaue zeitliche Überlappung von zwei Strahlen mit einem Kreuzkorrelator (Auflösung von 1 fs) erreicht wird.
Der dritte entscheidende Aspekt ist die Ausrichtung der beiden Strahlen im Mikroskop (siehe Schritt 3.3 des Protokolls). Eine vorläufige Weißlichtbeobachtung der Probe ermöglicht es, das gewünschte Sichtfeld (FOV) zu individualisieren. Anschließend werden Laserstrahlen, die über einen Seitenanschluss des Mikroskops in das Mikroskop gelangen, ausgerichtet, um das am oberen Teil montierte PD zu erreichen (Abbildung 3). Für eine korrekte Bildaufnahme ist jedoch das Festlegen einer Reihe von Parametern erforderlich (z. B. Pixeldimension und Pixelverweilzeit). Die Sampling-Frequenz muss die Durchdrungen von Nyquist-Theorem auferlegte Einschränkung respektieren, um alle Informationen in einem Bild zu erhalten, während für eine korrekte Übereinstimmung zwischen den räumlichen Koordinaten der Pixel und dem sRS-Wert, der in jedem Pixel gemessen wird, die Integrationszeit LIA sollte gleich oder vergleichbar mit der Pixelverweilzeit sein.
Im letzten Schritt der Mikroskopausrichtung werden zahlreiche Tests zur Optimierung der räumlichen und zeitlichen Ausrichtung durchgeführt (siehe Schritt 3.4 des Protokolls). Zur Optimierung der räumlichen Überlappung werden eine Reihe von Übertragungsbildern (TI) für Ti:Sa und OPO erfasst. In einem TI wird ein einzelner Strahl verwendet, und die übertragene Strahlintensität aus der Probe wird durch eine PD gemessen. Im Falle von TI, die von OPO realisiert werden, wird das PD-Ausgangssignal direkt an die PCI-Karte angeschlossen, während im Fall von TI:Sa das PD-Ausgangssignal an LIA und der analoge Ausgang von LIA an die PCI-Karte angeschlossen ist. Die Übertragungsbilder sind sehr nützlich, um den FOV, die Beleuchtung, die Brennposition von Mikroskopobjektiven zu optimieren und zu überprüfen, ob die beiden Strahlen räumlich überlappend sind6,7,8.
Die Optimierung der zeitlichen Überlappung von Pumpe und Sondenstrahl wird durch Scannen der Verzögerungslinie mit Schritten von 0,001 mm, die einer 3,3-fs-Zeitverschiebung entsprechen, und Durchführung einer SRS-Messung an einem einzigen Punkt einer Polystyrol-Perlenprobe mit einem Durchmesser von 3 m erreicht. Die Amplitude eines SRS-Signals misst in Abhängigkeit von der Sonden-Pumpen-Verzögerung Werte aus LIA und liefert eine maximale zeitliche Überlappung der beiden Strahlen6,7,8. Vor dem Abschluss ist zu beachten, dass alle diskutierten Schritte obligatorisch sind, um ein qualitativ hochwertiges Bild zu erhalten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

Stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) verwendet Nahinfrarot-Anregungslicht; Daher hat es viele mikroskopische Bildgebungseigenschaften mit mehreren Photonen. Die SRS-Bildgebungsmodalität kann mit kommerziellen Laser-Scanning-Mikroskopen erreicht werden, indem ein nicht gescannter Vorwärtsdetektor mit richtigen Bandpassfiltern und einem Lock-in-Verstärker (LIA)-Erkennungsschema ausgestattet wird. Ein schematisches Layout eines typischen SRS-Mikroskops umfasst Folgendes: zwei gepulste Laserstrahlen (d. h. die Pumpe und sonde, die in einem Rastermikroskop gerichtet sind), die sowohl in Raum als auch Zeit auf der Bildebene überlappen und dann durch ein Mikroskopobjektiv in das Beispiel durch zwei Scanspiegel (SMs), die den Brennpunkt über eine x-y-Ebene rastern. Nach Interaktion mit der Probe werden die übertragenen Ausgangsimpulse durch ein oberes Objektiv erfasst und durch ein Vorwärtsdetektionssystem gemessen, das in ein invertiertes Mikroskop eingesetzt wird. Pumpenimpulse werden durch einen Stapel optischer Filter entfernt, während die Sondenimpulse, die das Ergebnis des SRS-Prozesses im Brennvolumen der Probe sind, mit einer Photodiode (PD) gemessen werden. Die Auslesung der PD wird von der LIA demoduliert, um die Modulationstiefe zu extrahieren. Ein zweidimensionales (2D) Bild wird durch Synchronisieren der Vorwärts-Erkennungseinheit mit der Mikroskop-Scaneinheit erhalten. In diesem Beitrag wird die Implementierung eines SRS-Mikroskops beschrieben und erfolgreich demonstriert, ebenso wie die Meldung von etikettenfreien Bildern von Polystyrolperlen mit Durchmessern von 3 m. Es ist erwähnenswert, dass SRS Mikroskope nicht kommerziell erhältlich sind, so dass, um diese Eigenschaften zu nutzen, die hausgemachte Konstruktion die einzige Option ist. Da die SRS-Mikroskopie in vielen Bereichen immer beliebter wird, wird angenommen, dass diese sorgfältige Beschreibung der Implementierung des SRS-Mikroskops für die wissenschaftliche Gemeinschaft sehr nützlich sein kann.

Ein Beispiel für die SRS-Messung (d. h. die SRS-Messung an einem einzelnen Punkt der Stichprobe) ist in Abbildung 7dargestellt. Wenn die Balken nicht zeitlich oder räumsfrei überlappen, wird das erhaltene Ergebnis in Abbildung 8adargestellt. Bei Off-Resonanz ist die von LIA gemessene Amplitude des Signals Null, während die von LIA gemessene Signalphase zwischen negativen und positiven Werten springt. Während die Balken im Raum überlappen und die Ver...

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Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Implementierung eines nichtlinearen Mikroskops auf Basis der stimulierten Raman-Streuung

In diesem Manuskript wird die Implementierung eines stimulierten Raman-Streumikroskops (SRS) beschrieben, das durch die Integration eines SRS-Experimentalaufbaus mit einem Laser-Scanning-Mikroskop gewonnen wurde. Das SRS-Mikroskop basiert auf zwei Femtosekunden (fs) Laserquellen, einem Ti-Sapphire (Ti:Sa) und einem synchronisierten optischen parametrischen Oszillator (OPO).

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Dieses Protokoll kann Wissenschaftlern, die an nichtlinearer Mikroskopie interessiert sind, helfen, die wichtigsten Komponenten, die Einrichtung und das Ausrichtungsverfahren eines Mikroskops auf der Grundlage der stimulierten Raman-Streuung zu verstehen. Die Hauptvorteile der SRS-Mikroskopie sind ihre Fähigkeiten, eine etikettenfreie Bildgebung auf der Grundlage des Vibrationskontrasts durchzuführen und ein Bild in wenigen Sekunden zu erfassen. Die SRS-Mikroskopie hat die etikettenfreie Bildgebung in neue Höhen getrieben, insbesondere Studien komplexer biologischer Strukturen wie Lipide, die für Zellen und zelluläre Architektur von grundlegender Bedeutung sind.SRS-Signal wird als eine kleine Änderung in der Intensität des Sondenstrahls erkannt und kann durch Rauschen beschädigt werden. Daher ist ein genaues Zeichen entscheidend. Richten Sie zunächst den OPO und die Titan-Saphir-Laserstrahlen so aus, dass beide das Mikroskop erreichen.Als nächstes platzieren Sie die Detektoren des Laserstrahlpositionssensors in zwei Positionen zwischen dem dichroitischen Spiegel eins und dem Spiegel sechs. Die erste Position befindet sich in der Nähe von dichroitischem Spiegel eins und die zweite ist in der Nähe von Spiegel sechs. Verwenden Sie für jede Position die Sensoren, um die X- und Y-Koordinaten des OPO-Strahls zu erkennen.Wichtig ist, dass die X- und Y-Koordinaten des Titan-Saphir-Laserstrahls in beiden Positionen der Detektoren des Sensors vom gleichen OPO sind. Wenn in einigen Positionen die Koordinaten nicht übereinstimmen, stimmen Sie die Neigung des angrenzenden Spiegels zum Ausgleich ab. Befolgen Sie das gleiche Verfahren, um die Titan-Saphir-Strahlpositionen in Bezug auf OPO für den Pfad zwischen den Sechs- und Siebener-Pfaden des Spiegels auszurichten.Installieren Sie einen zusätzlichen Spiegel auf einer Flip-Flop-Halterung zwischen Spiegel sechs und sieben und kippen Sie die Halterung des Spiegels, um den Strahl in den Autokorrelator zu lenken. Schalten Sie den Autokorrelator-Controller ein, starten Sie die Softwareanwendung auf dem Computer, der ihn steuert, und stellen Sie die Strahlabstandseinstellungsschraube des Autokorrelators auf 8,35 Millimeter in die normale Position. Stoppen Sie dann den Titan-Saphir-Strahl und lösen Sie den OPO-Strahl vom zusätzlichen Spiegel auf den Eingangsspiegel des Autokorrelators.Versuchen Sie, den Eingangsspiegel einzustellen, um das Laserpulssignal zu maximieren, wie hier gezeigt. Als nächstes stoppen Sie den OPO-Strahl und lösen Sie den Titan-Saphir-Strahl vom Flip-Flop-Spiegel auf den Eingangsspiegel und in den Autokorrelator. Wiederholen Sie die optimale Strahleinstellung, bis das hier gezeigte Autokorrelatorsignal erreicht ist.Stellen Sie nun die Strahlabstandseinstellungsschraube auf die Kreuzposition auf 7,30 Millimeter ein. Lösen Sie beide Träger und scannen Sie die verzögerte Linie, um die beiden Träger zu überlappen. Erhalten Sie das resultierende Kreuzkorrelatorsignal, wie hier gezeigt.Drehen Sie dann den Flip-Flop-Spiegel, so dass die Strahlen Spiegel sieben und den Scankopf des Mikroskops erreichen können. Entfernen Sie den Kondensator und verwenden Sie die Escape-Taste, um die 60-fache subjektive Linse vorübergehend zurückzuziehen. Drehen Sie dann das Nasenstück, um die 60x subjektive Linse vom optischen Pfad zu entfernen.Als nächstes montieren Sie den Detektor mit der externen mechanischen Halterung am oberen Teil des Mikroskops. Verbinden Sie den Ausgang des Detektors über einen 50 Ohm Low Pass Filter mit einem Oszilloskop. Schalten Sie nun den Prozessor ein, der den Scannerkopf steuert, und projizieren Sie den OPO-Strahl in den Scannerkopf des Mikroskops.Überwachen Sie das OPO-Signal und maximieren Sie die vom Detektor gemessene Leistung mit einem XY-Übersetzer. Wechseln Sie dann den Strahl vom OPO-Laser zum Titan-Saphir-Laser und stellen Sie sicher, dass auch für den Titan-Saphir-Laser ein Signal erhalten ist. Dies weist darauf hin, dass beide Träger gut ausgerichtet sind.Finalisieren Sie die Strahlausrichtung, indem Sie das Nasenstück zurückdrehen, um das 60x subjektive einzuführen. Verwenden Sie dann die Refokus-Taste am Mikroskop, um den endgültigen Fokus auf die 60-fache Mikroskopobjektivlinse wiederzuerlangen. Platzieren Sie schließlich das Ziel mit einer Vergrößerung von 40x anstelle des Kondensators, ohne die Probe zu berühren oder zu stören.Stellen Sie die Leistung der vor dem Mikroskop gemessenen Titan-Saphir- und OPO-Laser auf 30 Milliwatt für beide Strahlen ein. Stellen Sie dann die Wellenlänge des OPO-Lasers auf einen anderen Wert gegenüber dem vorherigen ein, so dass Pumpe und Sonde nicht in Resonanz mit der Schwingungsfrequenz der Perlen sind. Lassen Sie als Nächstes beide Strahlen los, so dass sie in das Mikroskop gelangen.Führen Sie die Computer-Übersetzung scanngesteuert aus, und zeichnen Sie die gemessene Intensität mit dem Sperrverstärker für jede Position der Verzögerungsleitung auf. Warten Sie, bis der Scan der Verzögerungszeile abgeschlossen ist. Stellen Sie nun die Wellenlänge des OPO wieder auf 1076 Nanometer ein, so dass Pumpe und Sonde mit der Schwingungsfrequenz der Perlen in Resonanz sind.Führen Sie die Computer-Übersetzer-Scanverzögerungszeile aus, und warten Sie, bis die Scan-Verzögerungszeile abgeschlossen ist. Schließlich legen Sie die erhaltene Überlappungsstrahlposition und die Verzögerungslinie für die nächste Erfassung von stimulierten Raman-Streubildern fest. Um die räumliche Synchronisation der Strahlen zu optimieren, beginnen Sie mit dem Anhalten des Titan-Saphirstrahls und reduzieren Sie die OPO-Leistung auf acht Milliwatt.Schließen Sie als Nächstes den Auslese-Detektor an die Datenerfassungskarte an. Führen Sie das Datenerfassungsprogramm zusammen mit der Rasterkonsole des Mikroskops aus. Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Datei und verarbeiten Sie die Daten, um ein Bild wie das hier gezeigte zu erhalten.Als nächstes stoppen Sie den OPO-Strahl und reduzieren Sie die Titan-Saphir-Leistung auf 2,5 bis 4,5 Milliwatt. Verbinden Sie den Detektor mit dem Einsperrverstärker und dessen Auslesungen mit der Datenerfassungskarte. Führen Sie dann das Datenerfassungsprogramm zusammen mit der Rasterkonsole des Mikroskops erneut aus.Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Datei und verarbeiten Sie die Daten, um ein Bild wie das hier gezeigte zu erhalten. Führen Sie einen Stapel von Filtern zwischen dem 40-fachen Objektiv und der Photodiode ein, um die Pumpenimpulse zu entfernen und nur das Stoke-Signal zu erfassen. Stellen Sie dann das Pumpensignal auf 810 Nanometer mit einer fokussierten Leistung von acht Milliwatt ein.Stellen Sie das Sondensignal auf 1076 Nanometer mit der gleichen fokussierten Leistung von acht Milliwatt ein, um eine typische Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung von Polystyrol mit einer Raman-Verschiebung von 3054 inversen Zentimetern zu untersuchen. Schließen Sie den Detektor mit dem Einsperrverstärker und dem Auslesen des Einsperrverstärkers an die Datenerfassungskarte an. Legen Sie schließlich das Pixelformat und die Erfassungszeit im Mikroskopprogramm fest und führen Sie es und das Datenerfassungssystem aus, wodurch die Matrixdatei gespeichert wird, sobald sie abgeschlossen ist.Hier wird eine Beispielmessung von einem einzelnen Punkt der Probe angezeigt. Wenn der Strahl nicht in Zeit oder Raum überlappt ist, ist das erhaltene Ergebnis aus Resonanz, wobei die Amplitude des Signals, gemessen durch einen Einsperrverstärker, Null ist. Die Phase dieses Signals springt jedoch zwischen negativen und positiven Werten.Wenn die Balken im Raum überlappen, erhöht sich das Signal und erreicht sein Maximum, wenn die Strahlen in der Zeit perfekt überlappen, während die Phase beginnt, einen festen Wert während der Zeit zu erreichen, in der die Strahlen überlappen. In einem Übertragungsbild wird ein einzelner Strahl verwendet und die übertragene Strahlintensität aus der Probe wird durch eine Photodiode gemessen. Auf der linken Seite wurde das Übertragungsbild mit OPO erhalten, während auf der rechten Seite das Übertragungsbild mit Titan-Saphir erhalten wurde.Hier wird ein typisches Beispiel für ein SRS-Bild gezeigt, in dem etikettenfreie Bilder von Polystyrolperlen mit durchmessern von drei Mikrometern berichtet werden. Um ein hochwertiges Bild auf Basis der SRS-Mikroskopie zu erhalten, ist die Ausrichtung eines Mikroskops entscheidend. Daher müssen alle im Protokoll angegebenen Schritte sorgfältig durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Engineering

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

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Forschung

Ingenieurwesen

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