Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

אנו מעריכים V. Tufano מ IMM CNR עבור סיוע טכני יקר שלו ג'אקומו Cozzi, מומחה מוצר ממכשירים ניקון, עבור דיונים שימושיים תמיכה רציפה. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי האיטלקי הלאומי תוכניות PONa3 00025 (BIOforIU) ועל ידי היורו-Bioדימות פרויקט בקנה מידה גדול של תשתית מחקר panEuropean.

1. מפעיל את מערכת הלייזר
<ol><li>בדקו אם הטמפרטורה של הצ נשמרת בשעה או מתחת ל-20 ° c.</li>
	<li>בדוק אם יחידת בקרת הלחות פועלת כהלכה והלחות נשמרת בערך סביב 40%.</li>
	<li>הפעל את לייזר Ti: Sa באופן מדויק, בהתאם להוראות שבמדריך.</li>
	<li>הגדר את אורך הגל כדי 810 ננומטר.</li>
	<li>הפעל את ה-פופו ואת המחשב המצומצם המחובר. הפ?...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy:+a+tutorial.">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).</li><li>Camp, C. H., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators.">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li><li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology.">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li><li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets:+Size+matters.">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li><li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells:+size+and+optical+density+distribution.">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li><li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage.">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li><li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+distribution+in+living+cells:+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog.">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li><li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples.">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li><li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells:+A+precautionary+note.">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging:+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes.">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li><li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser.">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography.">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117 (2017).</li><li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

מיקרוסקופ SRS לקח הדמיה ללא תווית לגבהים חדשים, במיוחד במחקרים של מבנים ביולוגיים מורכבים כגון שומנים, שהם בסיסיים לתאים ולארכיטקטורה סלולרית. שומנים מעורבים במסלולים פיזיולוגיים מרובים כגון ייצור של ממברנות ביולוגיים, והם משמשים כלסמנים biosynthetic ו מתמרים אותות10. שומנים הם ארו...

ביישומי מדעי החיים, מיקרוסקופ SRS התפתחה ככלי רב עוצמה עבור דימות ללא תווית. הרעיון הבסיסי של מיקרוסקופ SRS הוא לשלב את עוצמת הניגודיות התנובותית ואת יכולתה להשיג תמונות בתוך שניות ספורות.
SRS הוא תהליך שבו הפרש התדירות בין שני תדרי קרני לייזר (אות משאבה ואות סטוקס בתדרים שונים) מתאים את הרטט המולקולרי של דגימת נחקר, וגורם מגורה פיזור ראמאן ומשמעותי עליה. באות של סטוקס בניגוד ליניארי ספקטרוסקופית ראמאן, SRS מציג תלות לא לינארית על שדות האור הנכנסות ומייצרת קרינה קוהרנטית. ל-SRS יש שני יתרונות בסיסיים: 1) מהירות, מה שהופך את התמונות לרגישות פחות לחפצי אמנות הנובעים מתנועה לדוגמה או השפלה, ו-2) יחס מעולה של אות לרעש (SNR). בנוסף, srs מציג ספקטרום זהה ראמאן ספונטנית, ואת האות SRS הוא פרופורציונלי ליניארי לריכוז של הקשר הכימי נרגש1,2,3,4, 5. המשך
במיקרוסקופ שלנו, הגדרת שנייה (fs) SRS ניסיוני משולב עם מיקרוסקופ אופטי הפוך מצויד מראות מהירה יחידת סריקה (איור 1)6,7,8. שני מקורות לייזר פעמו משמשים ליישום מיקרוסקופ זה. הראשון הוא fs-Ti: Sa עם משך פעימה של כ 140 fs, קצב חזרה של 80 MHz, ואורכי גל פליטה בטווח של 680-1080 nm. השני, המשמש כקרן בדיקה ושאוב על ידי Ti: Sa, היא מתנד פרמטרית מסונכרן האופטי השני (SOPO), עם משך הדופק של כ 200 fs, שיעור חזרה של 80 MHz, ואורכי גל פליטה בטווח של 1000-1600 nm. יצוין כי ההבדל אנרגיית פוטון המינימלי בין Ti: Sa ו-SOPO קורה הוא 2500 ס"מ-1. לכן, באמצעות שילוב זה של מערכות לייזר, רק בתדירות גבוהה C-H אזור (2800-3200 ס"מ-1) של ראמאן ספקטרום ניתן לחקור6,7,8.
כדי להקים מיקרוסקופ SRS יש שלושה נושאים קריטיים לשקול, המתוארים בפסקאות העוקבות. הראשון הוא יישום של שיטת העברת אפנון בתדר גבוה (ראה איור 2 וצעד 2.1 של הפרוטוקול לתיאור). בחקירה ניסויית של SRS, פרמטר חיוני הוא רגישות המערכת. אות SRS מזוהה כשינוי קטן בעוצמת קורות העירור; לכן, זה יכול להיות פגום על ידי רעש לייזר בעוצמה ורעש ירה. ניתן להתגבר על בעיה זו על-ידי שילוב מערכת זו עם שיטת העברת אפנון בתדר גבוה (ראה איור 2 וצעד 2.1 של הפרוטוקול לקבלת פרטים). בשיטה זו, מאופנן אלקטרו-אופטיים (EOM) משמש לווסת את המשאבה. אפנון הועבר קרן בדיקה לאחר מכן ניתן לזהות על ידי משטרת לאחר חסימת קרן המשאבה עם ערימה של מסננים אופטיים [גירוי לצבור ראמאן (SRG) מצב זיהוי]. פלט ה-PD מחובר באמצעות מסנן מעבר נמוך למגבר מנעול (LIA), אשר מדגיש את האות הנמדד. על-ידי הגברת תדירות האפנון של הקרן לתדרים מעל 1 MHz, ניתן להשיג את המגבלה הפנימית של PDs.
הסוגיה השנייה לשקול הוא התקנה של הר מכני אשר מאפשר לבצע זיהוי קדימה באותו זמן כדי לשמר את ההתבוננות במיקרוסקופ ברייטפילד. בנוסף, הוא צריך להפחית את הרעש עקב רטט מכני במהלך הדור של תמונות ולאפשר מיקום מדויק של מערכת האיתור (ראה איור 3 וצעד 2.2 של הפרוטוקול).
השלישי הוא סנכרון האות שנרכש על ידי ערכת האיתור התלויית-פאזה, כאשר הקרן ממוקמת על המדגם הנמצא במעקב על-ידי ראש הסורק של המיקרוסקופ. כדי להגשים תמונות, ה-SMs דורש שלושה אותות TTL שנעשים זמינים על-ידי בקר המיקרוסקופ המחובר ליחידת ראש הסריקה: שעון פיקסל, סנכרון קו, וסנכרון מסגרת. הסנכרון מושג על ידי שליטה באמצעות כרטיס PCI, שלושת אותות הTTL, ורכישת אות מתח בערוץ הפלט של LIA6,7,8. תוכנה תוצרת בית פותחה ותוארה בעבר6,7,8, בעוד החומרה של מערכת הסינכרון מדווחת באיור 4.
הליך בסיסי בעת ביצוע הדמיה SRS הוא יישור מיקרוסקופ. היא ממומשת במהלך ארבעת השלבים, המתוארים בפסקאות העוקבות. הראשון הוא חפיפה מרחבית של שתי קורות (ראה שלב 3.1 של הפרוטוקול). בערכה ניסיונית זו, שתי הקורות היו משולבים באופן קוליניארי בשילוב על ידי מראה דיקרואיק. הצעד הראשוני הוא היישור של פופו ו-Ti: Sa כך שכל אחד מהם מגיע למיקרוסקופ. אז, בהתחשב ב-פופו כקרן התייחסות וניצול של גלאי מיקום רגיש, Ti: Sa הוא חופף באופן מהותי ל-פופו.
ההיבט המכריע השני הוא החפיפה הטמפורלית של שתי קורות (ראה שלב 3.2 של הפרוטוקול). גם אם המשאבה ו-פופו קורות מסונכרנים באופן מושלם9, מאז הם בעקבות שבילים מעט שונים הקורה בתוך הדיור פופו, ביציאה פופו יש להם עיכוב זמן של כ 5 ns והבדל מרחבי של 5 ס מ. לכן, Ti: Sa ו-פופו דורשות לבצע מחדש את הזמן הקצוב באופן מתוזמן כדי להבטיח חפיפה זמנית במדגם. הדבר מתבצע בדרך כלל עם קו השהיה אופטי הניתן לפעולה דק, אשר במקרה זה מוכנס בין Ti: Sa ומיקרוסקופ (ראה איור 1). על מנת להשיג חפיפה זמנית של שתי קורות, נעשה שימוש בשתי טכניקות. הראשונה מבוצעת באמצעות משטרת מהירה והאוסילוסקופ, בעוד השני מבוסס על מערכת יחסים אוטומטית ומחוצה אופטי. באמצעות הטכניקה הראשונה, חפיפה מחוספס של שתי קורות מושגת (אי ודאות של 10 ps), בעוד החפיפה הזמני מדויק של שתי קורות מושגת באמצעות משתמש חוצה (רזולוציה של 1 fs).
ההיבט העיקרי השלישי הוא יישור של שתי הקורות בתוך המיקרוסקופ (ראה שלב 3.3 של הפרוטוקול). התבוננות מוקדמת באור לבן של המדגם מאפשרת לאינדיבידוקה את השדה הרצוי (FOV). לאחר מכן, קרני לייזר, כניסה למיקרוסקופ על ידי נמל צדדי של מיקרוסקופ, מיושרים על מנת להגיע למשטרה רכוב על החלק העליון (איור 3). עם זאת, עבור רכישת תמונה נכונה, הגדרת מספר פרמטרים נדרש (לדוגמה, מימד פיקסל ופיקסל זמן לשכון). תדר הדגימה חייב לכבד את האילוץ שהוטל על ידי משפט נייקוויסט על מנת לשמר את כל המידע בתמונה, ובמקביל לתכתובת נכונה בין הקואורדינטות המרחבית של פיקסלים לבין ערך SRS הנמדד בכל פיקסל, זמן האינטגרציה של LIA צריכה להיות שווה או דומה לזמן לשכון פיקסל.
בשלב האחרון של יישור מיקרוסקופ, בדיקות רבות מתבצעות כדי לייעל את היישור המרחבי והזמני (ראה שלב 3.4 של הפרוטוקול). מספר תמונות שידור (TI) עבור שתיהן Ti: Sa ו-פופו נרכשים כדי לייעל את החפיפה המרחבית. ב-TI, נעשה שימוש בקרן בודדת, ועוצמת הקרן המועברת מהמדגם נמדדת על-ידי משטרה. במקרה של TI הבינה על-ידי פופו, אות הפלט של PD מחובר ישירות לכרטיס PCI, ואילו במקרה של TI הבינה על-ידי Ti: Sa, אות הפלט של PD מחובר ל-LIA ופלט אנלוגי של LIA מחובר לכרטיס PCI. תמונות השידור שימושיות מאוד כדי למטב את fov, את התאורה, את המיקום המוקד של מטרות מיקרוסקופ וכדי לבדוק אם שתי הקורות הם בעלי שליטת חופפים6,7,8.
אופטימיזציה של המשאבה ובדיקת חפיפה הזמני של קרן מושגת על ידי סריקת קו ההשהיה עם שלבים של 0.001 מ"מ המתאימים 3.3 fs זמן משמרת וביצוע מדידה SRS בנקודה אחת של מדגם חרוז בפוליסטירן 3 יקרומטר קוטר. השרעת של אות SRS מודדת ערכים מליה, כפונקציה של עיכוב בדיקת המשאבה, והיא מספקת המקבילה המדויקת לחפיפה בזמן המדויק של שתי הקורות6,7,8. לפני הסיכום, יש לציין כי כל הצעדים הנדונים הם חובה כדי לקבל תמונה באיכות גבוהה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

מיקרוסקופית פיזור ראמאן (SRS) משתמש באור עירור הקרוב לאינפרא-אדום; לפיכך, היא חולקת הרבה תכונות הדמיה רב-פוטון מיקרוסקופיים. מודאליות של הדמיה SRS ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ מסחרי סריקת לייזר על ידי הציוד עם גלאי הקדמי לא מסורק עם מסננים הנכון bandpass ו נעל-in מגבר (LIA) זיהוי תוכנית. פריסה סכמטית של מיקרוסקופ SRS אופייני כולל את הפרטים הבאים: שני קרני לייזר פעמו, (כלומר, המשאבה והבדיקה מכוונת במיקרוסקופ סריקה), אשר חייב להיות חופפים בחלל ובזמן במישור התמונה, ואז ממוקד על ידי מטרה מיקרוסקופ לתוך המדגם דרך שתי מראות סריקה (SMs), אשר רסטר את הנקודה המוקד על פני מטוס x-y. לאחר האינטראקציה עם המדגם, פולסים פלט ששודרו נאספים על ידי המטרה העליונה נמדדת על ידי מערכת זיהוי קדימה שנוספה במיקרוסקופ הפוך. פולסים משאבה מוסרים על ידי ערימה של מסננים אופטיים, ואילו פולסים בדיקה כי הם תוצאה של תהליך SRS המתרחשים נפח המוקד של הדגימה נמדדת על ידי פוטודיודה (PD). הבדיקה של המשטרה היא מאוד מדולמת על ידי ה-LIA כדי לחלץ את עומק האפנון. תמונה דו-ממדית (דו-ממדית) מתקבלת על ידי סנכרון יחידת הזיהוי הקדמי עם יחידת סריקת המיקרוסקופ. במאמר זה, היישום של מיקרוסקופ SRS מתואר והפגינו בהצלחה, כמו גם את הדיווח של תמונות ללא תווית של חרוזי פוליסטירן עם קטרים של 3 μm. ראוי לציין כי מיקרוסקופים SRS אינם זמינים מסחרית, כך על מנת לנצל את המאפיינים הללו, הבנייה ביתית היא האפשרות היחידה. מאז מיקרוסקופ SRS הופך פופולרי בתחומים רבים, הוא האמין כי תיאור זה זהיר של יישום מיקרוסקופ SRS יכול להיות מאוד שימושי עבור הקהילה המדעית.

דוגמה למדידה SRS (כלומר, מדידת SRS בנקודה אחת של המדגם) מדווחת באיור 7. כאשר הקורות אינם חופפים בזמן או במרחב, התוצאה המתקבלת מדווחת באיור 8a. בתהודה מרחוק, משרעת האות הנמדדת על ידי LIA היא אפס, בעוד שהשלב של האות שנמדד על ידי לוליה מדלג בין ערכים שליליים וחיוביי...

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

יישום של מיקרוסקופ לא לינארית על בסיס פיזור ראמאן מגורה

בכתב יד זה, היישום של מיקרוסקופ ראמאן מגורה (SRS), המתקבל על ידי שילוב של הגדרת הניסוי SRS הערכה עם מיקרוסקופ סריקת לייזר, מתואר. מיקרוסקופ SRS מבוסס על שני מקורות לייזר (שניים), טי-ספיר (Ti: Sa) ומתנד פרמטרי אופטי מסונכרן (פופו).

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

פרוטוקול זה יכול לסייע למדען המעוניין במיקרוסקופיה לא ליניארית להבין את מרכיבי המפתח, את ההגדרה ואת הליך היישור של מיקרוסקופ המבוסס על פיזור אמן מגורה. היתרונות העיקריים של מיקרוסקופיית SRS הם היכולות שלה לבצע הדמיה ללא תווית המבוססת על ניגודיות רטט ולרכוש תמונה תוך שניות ספורות. מיקרוסקופיית SRS לקחה הדמיה ללא תווית לגבהים חדשים במיוחד מחקרים של מבנים ביולוגיים מורכבים כגון שומנים, שהם היסוד לתאים וארכיטקטורה תאית.אות SRS מזוהה כשינוי קטן בעוצמת קרן הגשוש והוא יכול להיפגם על ידי רעש. לכן סימן מדויק הוא קריטי. כדי להתחיל, ליישר את OPO ואת קרני לייזר ספיר טיטניום כך ששניהם מגיעים למיקרוסקופ.לאחר מכן, מקם את הגלאים של חיישן מיקום קרן הלייזר בשתי עמדות בין מראה דיכרוית אחת ומראה שש. המיקום הראשון ממוקם קרוב למראה dichroic אחד והשני קרוב מראה שש. עבור כל מיקום, השתמש בחיישנים כדי לזהות את קואורדינטות X ו- Y של קרן OPO.חשוב לציין, ודא כי קואורדינטות X ו- Y של קרן הלייזר טיטניום ספיר הם מאותו OPO בשתי המיקומים של גלאי החיישן. אם, במיקומים מסוימים, הקואורדינטות לא לחפוף, לכוון את ההטיה של המראה הסמוכה כדי לפצות. בצע הליך זה כדי ליישר את עמדות קרן ספיר טיטניום ביחס OPO לנתיב בין שש ושבע של המראה.התקינו מראה נוספת על הר כפכפים בין מראה 6 ל-7 והפכו את הר המראה כדי לכוון את הקרן לתוך התיקון האוטומטי. הפעל את בקר התיקון האוטומטי, הפעל את יישום התוכנה במחשב השולט בו והגדר את בורג כוונון מרחק הקרן של התיקון האוטומטי למיקום הרגיל שלו ב- 8.35 מילימטרים. לאחר מכן, עצרו את קרן טיטניום ספיר ושחררו והקרנו את קרן OPO מהמראה הנוסף למראה הקלט של התיקון האוטומטי.נסה לכוונן את מראה הקלט כדי למקסם את אות הדופק בלייזר כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, עצרו את קרן OPO ושחררו והקרנו את קרן ספיר טיטניום מהמראה המותקנת כפכפים למראה הקלט ולתוך התיקון האוטומטי. חזור על התאמת הקרן האופטימלית עד שאות התיקון האוטומטי, המוצג כאן, מתקבל.עכשיו, להגדיר את בורג התאמת מרחק הקרן למיקום הצלב ב 7.30 מילימטרים. שחררו את שתי הקורות וסרקו את הקו המעוכב כדי לחפוף את שתי הקורות. השג אות מתאם צולב שנוצר, כפי שמוצג כאן.לאחר מכן, להפוך את המראה רכוב כפכף כך הקורות יכול להגיע מראה שבע ואת ראש הסריקה של המיקרוסקופ. הסר את המרכז ולהשתמש בלחצן escape כדי לחזור בו באופן זמני את העדשה הסובייקטיבית 60x. לאחר מכן סובבו את חתיכת האף כדי להזיז את העדשה הסובייקטיבית 60x מהנתיב האופטי.לאחר מכן, הר את הגלאי לחלק העליון של המיקרוסקופ באמצעות ההר המכאני החיצוני. חבר את פלט הגלאי באמצעות מסנן מעבר נמוך של 50 אום לאוצילוסקופ. עכשיו, הפעל את המעבד ששולט בראש הסורק והקרן את קרן OPO לתוך ראש הסורק של המיקרוסקופ.נטר את אות ה- OPO והגדל את העוצמה הנמדדת על-ידי הגלאי באמצעות מתרגם XY. לאחר מכן, להעביר את הקרן מלייזר OPO ללייזר ספיר טיטניום ולוודא כי אות מתקבל גם עבור לייזר ספיר טיטניום. הדבר מצביע על כך ששתי הקורות מיושרות היטב.לסיים את יישור הקרן על ידי סיבוב בחזרה את חתיכת האף כדי להציג את 60x סובייקטיבי. לאחר מכן, השתמשו בלחצן המיקוד מחדש במיקרוסקופ כדי להחזיר את המיקוד הסופי לעדשת המטרה של מיקרוסקופ 60x. לבסוף, למקם את המטרה, עם הגדלה של 40x, במקום מעובה מבלי לגעת או להפריע את המדגם.הגדר את העוצמה של לייזרים טיטניום ספיר OPO נמדד לפני המיקרוסקופ ל 30 מילי וואט עבור שתי הקורות. לאחר מכן, הגדר את אורך הגל של לייזר OPO לערך אחר, ביחס לקודמו, כך המשאבה והגשוש אינם תהודה עם תדר הרטט של חרוזים. לאחר מכן, שחררו את שתי הקורות, כך שהן ייכנסו למיקרוסקופ.הפעל את מתרגם ממוחשב קו עיכוב סריקה ולתזמן את העוצמה הנמדדת באמצעות מגבר הנעילה עבור כל מיקום של קו ההשהיה. המתן עד להשלמת סריקת קו ההשהיה. עכשיו, להגדיר את אורך הגל של OPO בחזרה 1076 ננומטר, כך המשאבה והגשוש נמצאים תהודה עם תדר הרטט של חרוזים.הפעל את מתרגם ממוחשב קו עיכוב סריקה ולהמתין עד סריקת קו ההשהיה הושלמה. לבסוף, הגדר את מיקום קרן החפיפה המתקבל ואת קו העיכוב לרכישה הבאה של תמונות פיזור ראמאן מגורה. כדי לייעל את הסנכרון המרחבי של הקורות, התחל על ידי עצירת קרן ספיר טיטניום, והפחתת כוח OPO לשמונה מילי וואט.לאחר מכן, חבר את קריאת הגלאי לכרטיס איסוף הנתונים. הפעל את תוכנית רכישת הנתונים יחד עם מסוף סריקת המיקרוסקופים. לאחר שתסיים, שמור את הקובץ ועבד את הנתונים כדי לקבל תמונה כמו זו המוצגת כאן.לאחר מכן, עצרו את קרן OPO והפחיתו את כוח הספיר של טיטניום ל-2.5 עד 4.5 מילי-וואט. חבר את הגלאי עם מגבר הנעילה והקריאות שלו באמצעות כרטיס איסוף הנתונים. לאחר מכן, הפעל שוב את תוכנית רכישת הנתונים יחד עם מסוף סריקת המיקרוסקופים.לאחר שתסיים, שמור את הקובץ ועבד את הנתונים כדי לקבל תמונה כמו זו המוצגת כאן. הצג ערימה של מסננים בין המטרה 40x ואת photodiode כדי להסיר את פולסים משאבה לרכוש רק את אות סטוק. לאחר מכן, להגדיר את אות המשאבה ל 810 ננומטר עם כוח ממוקד של שמונה מילי וואט.הגדר את אות החללית ל-1076 ננומטר עם אותו כוח ממוקד של שמונה מילי-וואט כדי לחקור קשר פחמן-מימן טיפוסי של פוליסטירן עם תזוזת אמן של 3054 סנטימטרים הפוכים. חבר את הגלאי עם מגבר הנעילה וקריאת מגבר הנעילה לכרטיס איסוף הנתונים. לבסוף, הגדר את פורמט הפיקסל ואת זמן הרכישה בתוכנית המיקרוסקופ והפעל אותו ואת מערכת רכישת הנתונים, שמירת קובץ המטריצה לאחר השלמתו.מדידת דוגמה מנקודה אחת של המדגם מוצגת כאן. כאשר הקרן אינה חופפת בזמן או בחלל, התוצאה המתקבלת היא תהודה כבויה, כאשר משרעת האות, כפי שהיא נמדדת על ידי מגבר נעילה, היא אפס. השלב של אות זה, לעומת זאת, קופץ בין ערכים שליליים וחיוביים.אם הקורות חופפות בחלל, האות גדל ומגיע למקסימום כאשר הקורות חופפות באופן מושלם בזמן, בעוד השלב מתחיל להשיג ערך קבוע בזמן שבו הקורות חופפות. בתדמית שידור, נעשה שימוש בקרן אחת ועוצמת הקרן המשודרת מהדגימה נמדדת על ידי פוטודיודה. בצד שמאל, תמונת השידור הושגה באמצעות OPO, ואילו בצד ימין, תמונת השידור הושגה באמצעות טיטניום ספיר.דוגמה אופיינית לתדמית SRS מוצגת כאן, שבה מדווחים תמונות ללא תווית של חמוזי פוליסטירן בקוטר של שלושה מיקרומטרים. על מנת לקבל תמונה באיכות גבוהה, המבוססת על מיקרוסקופ SRS, היישור של מיקרוסקופ הוא קריטי. לכן, כל הצעד המצוין בפרוטוקול צריך להתבצע בזהירות.

Research

JoVE Journal

Engineering

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

יישום של אינטרפרומטר הפניה לNanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Coherent anti-Stokes Raman Scattering CARS Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

פיזור ראמאן (CARS) טבליות קוהרנטית אנטי סטוקס מדמיין מיקרוסקופית תרופות במהלך פירוק

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

מדידת פיזור אי-לינאריות מNanoparticle Plasmonic יחיד

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Automation of Mode Locking in a Nonlinear Polarization Rotation Fiber Laser through Output Polarization Measurements

אוטומציה של מצב נעילה בתוך לייזר סיב סיבוב קוי קיטוב באמצעות מדידות קיטוב פלט

When a laser is mode-locked, it emits a train of ultra-short pulses at a repetition rate determined by the laser cavity length. This article outlines a ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

המאולץ סטוקס Antistokes פיזור ראמאן ב Microspherical Whispering גלרית מצב מההודים

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

סריקה אור מפזר Profiler (SLPS) מתודולוגיה מבוססת כדי להעריך כמותית קדימה ואחורה אור פיזור מ עדשות עדשות

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

ספקטרומטר פיזור מהיר ברילואן מגורה מכ לניתוח גשמי

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

Experimental Implementation of a New Composite Fabrication Method: Exposing Bare Fibers on the Composite Surface by the Soft Layer Method

יישום ניסיוני של שיטת ייצור ללא הפרדות צבע חדשה: חשיפת סיבי חשופות על פני השטח Composite בשיטת שכבה רכה

The bipolar plate is a key component in proton exchange membrane fuel cells (PEMFCs) and vanadium redox flow batteries (VRFBs). It is a multi-functional ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

הפגנה של מיקרוסקופ משולבת Hyperlens וכן הדמיה ברזולוציה סופר

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Predicting Catalyst Extrudate Breakage Based on the Modulus of Rupture

שבירה Extrudate זרז נבואה על סמך המודולוס של קרע

The mechanical strength of extruded catalysts and their natural or forced breakage by either collision against a surface or by a compressive load in a ...