Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
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Apprezziamo V. Tufano di IMM CNR per la sua preziosa assistenza tecnica e Giacomo Cozzi, product specialist di Nikon Instruments, per discussioni utili e supporto continuo. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dai programmi operativi nazionali italiani PONa3 00025 (BIOforIU) e dal progetto euro-Bioimaging sulle infrastrutture di ricerca paneuropee.

1. Avvio del sistema laser
<ol><li>Controllare se la temperatura dei refrigeratori è mantenuta a o al di sotto dei 20 gradi centigradi.</li>
	<li>Controllare se l'unità di controllo dell'umidità funziona correttamente e l'umidità viene mantenuta a un valore intorno al 40%.</li>
	<li>Accendere il laser Ti:Sa, seguendo rigorosamente le istruzioni nel manuale.</li>
	<li>Impostare la lunghezza d'onda su 810 nm.</li>
	<li>Accendere l'OPO e il mini-computer collegato. Eseguire l'applicazione che controlla il laser OPO.</...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy:+a+tutorial.">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).</li><li>Camp, C. H., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators.">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li><li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology.">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li><li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets:+Size+matters.">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li><li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells:+size+and+optical+density+distribution.">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li><li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage.">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li><li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+distribution+in+living+cells:+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog.">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li><li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples.">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li><li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells:+A+precautionary+note.">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging:+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes.">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li><li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser.">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography.">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117 (2017).</li><li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

La microscopia SRS ha portato l'imaging senza etichette a nuove altezze, in particolare negli studi di strutture biologiche complesse come i lipidi, fondamentali per le cellule e l'architettura cellulare. I lipidi sono coinvolti in molteplici percorsi fisiologici come la produzione di membrane biologiche, e servono come precursori biosintetici e trasduttori di segnale10. I lipidi sono confezionati in organelli intracellulari specializzati, chiamati anche goccioline lipidiche (LD). I loro diametri ...

Nelle applicazioni nel campo delle scienze biologiche, la microscopia SRS è emersa come un potente strumento per l'imaging senza etichette. L'idea di base della microscopia SRS è quella di combinare la forza del contrasto vibrazionale e la sua capacità di acquisire immagini in pochi secondi.
SRS è un processo in cui la differenza di frequenza tra due frequenze di raggi laser (segnale pompa e segnale stokes a frequenze diverse) corrisponde alla vibrazione molecolare di un campione studiato, causando dispersione Raman stimolata e un significativo aumento del segnale Stokes. A differenza della spettroscopia raman lineare, sRS presenta una dipendenza non lineare dai campi luminosi in entrata e produce radiazioni coerenti. SRS ha due vantaggi fondamentali: 1) velocità, che rende le immagini meno sensibili agli artefatti derivanti dal movimento o dalla degradazione del campione, e 2) un eccellente rapporto segnale-rumore (SNR). Inoltre, SRS presenta uno spettro identico al Raman spontaneo, e il segnale SRS è linearmente proporzionale alla concentrazione del legame chimico eccitato1,2,3,4, 5.
Nel nostro microscopio, un set-up sperimentale femtosecondo (fs) SRS è integrato con un microscopio ottico invertito dotato di un'unità di scansione a specchi veloci (Figura 1)6,7,8. Per implementare questo microscopio vengono utilizzate due sorgenti laser pulsate. Il primo è un fs-Ti:Sa con una durata dell'impulso di circa 140 fs, una frequenza di ripetizione di 80 MHz e lunghezze d'onda di emissione nell'intervallo di 680-1080 nm. Il secondo, utilizzato come fascio di sonda e pompato da Ti:Sa, è un oscillatore parametrico ottico sincronizzato a femtosecondo (SOPO), con una durata dell'impulso di circa 200 fs, una frequenza di ripetizione di 80 MHz e lunghezze d'onda di emissione nell'intervallo di 1000-1600 nm. Va notato che la differenza minima di energia fotone tra il fascio Ti:Sa e SOPO è di 2500 cm-1. Pertanto, utilizzando questa combinazione di sistemi laser, solo la regione Ad alta frequenza C-H (2800-3200 cm-1) di spettri Raman può essere esplorata6,7,8.
Al fine di istituire un microscopio SRS, ci sono tre questioni cruciali da considerare, che sono descritte nei paragrafi successivi. Il primo è l'implementazione di un metodo di trasferimento di modulazione ad alta frequenza (vedere Figura 2 e passaggio 2.1 del protocollo per una descrizione). In un'indagine sperimentale SRS, un parametro cruciale è la sensibilità del sistema. Un segnale SRS viene rilevato come un piccolo cambiamento nell'intensità dei raggi di eccitazione; pertanto, può essere danneggiato dal rumore di intensità del laser e dal rumore delle riprese. Questo problema può essere risolto integrando questo sistema con un metodo di trasferimento di modulazione ad alta frequenza (vedere Figura 2 e passaggio 2.1 del protocollo per i dettagli). In questo metodo, un modulatore elettro-ottico (EOM) viene utilizzato per modulare la pompa. La modulazione trasferita al fascio di sonda può quindi essere rilevata da un PD dopo aver bloccato il fascio di pompaggio con una pila di filtri ottici [modalità di rilevamento Raman guadagno Raman stimolato (SRG)]. L'uscita PD è collegata da un filtro passa-basso a un amplificatore lock-in (LIA), che demolazza il segnale misurato. Aumentando la frequenza di modulazione del fascio a frequenze superiori a 1 MHz, è possibile ottenere il limite intrinseco di PD.
La seconda questione da considerare è l'installazione di un supporto meccanico che permette di effettuare il rilevamento in avanti e allo stesso tempo di preservare l'osservazione al microscopio in campo luminoso. Inoltre, deve ridurre il rumore dovuto alle vibrazioni meccaniche durante la generazione di immagini e consentire il riposizionamento preciso del sistema di rilevamento (vedere la Figura 3 e il passaggio 2.2 del protocollo).
Il terzo è la sincronizzazione del segnale acquisito dallo schema di rilevamento sensibile alla fase, con il fascio posizionato sul campione monitorato dalla testina di scansione del microscopio. Per realizzare le immagini, le SM richiedono tre segnali TTL che vengono resi disponibili dal controller del microscopio collegato all'unità di scansione: pixel clock, line sync e frame sync. La sincronizzazione si ottiene controllando utilizzando una scheda PCI, i tre segnali TTL e l'acquisizione di un segnale di tensione sul canale di uscita di LIA6,7,8. Un software fatto in casa è stato sviluppato e descritto in precedenza6,7,8, mentre l'hardware del sistema di sincronizzazione è riportato in Figura 4.
Una procedura fondamentale durante l'esecuzione dell'imaging SRS è l'allineamento al microscopio. Si realizza nel corso di quattro fasi, descritte nei paragrafi successivi. Il primo è la sovrapposizione spaziale di due fasci (vedere il passaggio 3.1 del protocollo). In questo set-up sperimentale, i due fasci sono stati spazialmente collitrati combinati da uno specchio dicroico. La fase preliminare è l'allineamento di OPO e Ti:Sa in modo che ognuno raggiunga il microscopio. Quindi, considerando l'OPO come una trave di riferimento e sfruttando un rilevatore sensibile alla posizione, il Ti:Sa è sovrapposto spazialmente a OPO.
Il secondo aspetto cruciale è la sovrapposizione temporale di due fasci (vedere il passaggio 3.2 del protocollo). Anche se la pompa e le travi OPO sono perfettamente sincronizzate9, dal momento che seguono percorsi di fascio leggermente diversi all'interno dell'alloggiamento OPO, all'uscita OPO hanno un ritardo di tempo di circa 5 ns e differenza spaziale di 5 cm. Pertanto, Ti:Sa e OPO richiedono di essere riprogrammati otticamente per garantire la sovrapposizione temporale sul campione. Questa operazione viene in genere eseguita con una linea di ritardo ottica finemente regolabile, che in questo caso viene inserita tra il Ti:Sa e il microscopio (vedere la figura 1). Per ottenere la sovrapposizione temporale di due travi, vengono utilizzate due tecniche. Il primo viene effettuato utilizzando una PD veloce e oscilloscopio, mentre il secondo si basa su correlazioni auto e cross-ottiche. Utilizzando la prima tecnica, si ottiene una sovrapposizione approssimativa di due travi (incertezza di 10 ps), mentre una sovrapposizione temporale accurata di due travi si ottiene utilizzando un correlato recorrelato incrociato (risoluzione di 1 fs).
Il terzo aspetto cruciale è l'allineamento dei due fasci all'interno del microscopio (vedere la fase 3.3 del protocollo). Un'osservazione preliminare a luce bianca del campione permette di individuare il campo visivo desiderato (FOV). Successivamente, i raggi laser, che entrano nel microscopio da una porta laterale del microscopio, sono allineati per raggiungere il PD montato sulla parte superiore (Figura 3). Tuttavia, per una corretta acquisizione dell'immagine, è necessario impostare una serie di parametri (ad esempio, dimensione in pixel e tempo di peritura dei pixel). La frequenza di campionamento deve rispettare il vincolo imposto dal teorema di Nyquist al fine di conservare tutte le informazioni in un'immagine, mentre per una corretta corrispondenza tra le coordinate spaziali dei pixel e il valore SRS misurato in ogni pixel, il tempo di integrazione di LIA dovrebbe essere uguale o paragonabile al tempo di dimora dei pixel.
Nella fase finale dell'allineamento al microscopio, vengono effettuati numerosi test per ottimizzare l'allineamento spaziale e temporale (vedere il passaggio 3.4 del protocollo). Un certo numero di immagini di trasmissione (TI) sia per Ti:Sa che per OPO vengono acquisite al fine di ottimizzare la sovrapposizione spaziale. In un TI, viene utilizzato un singolo fascio e l'intensità del fascio trasmesso dal campione viene misurata da una PD. Nel caso di TI realizzato da OPO, il segnale di uscita PD è collegato direttamente alla scheda PCI, mentre nel caso di TI realizzato da Ti:Sa, il segnale di uscita PD è collegato a LIA e l'uscita analogica di LIA è collegata alla scheda PCI. Le immagini di trasmissione sono molto utili per ottimizzare il FOV, l'illuminazione, la posizione focale degli obiettivi del microscopio e per verificare se i due fasci sono sovrapposti spazialmente6,7,8.
L'ottimizzazione della sovrapposizione temporale della pompa e della trave della sonda si ottiene scansionando la linea di ritardo con passi di 0,001 mm corrispondenti a uno spostamento temporale di 3,3 fs ed effettuando una misurazione SRS in un unico punto di un campione di perline di polistirolo di 3 m di diametro. L'ampiezza di un segnale SRS misura i valori di LIA, in funzione del ritardo sonda-pompa, e fornisce un massimo corrispondente con l'esatta sovrapposizione temporale delle due travi6,7,8. Prima di concludere, va notato che tutti i passaggi discussi sono obbligatori per ottenere un'immagine di alta qualità.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) utilizza la luce di eccitazione vicino all'infrarosso; pertanto, condivide molte proprietà di imaging microscopico multi-fotonico. La modalità di imaging SRS può essere ottenuta utilizzando microscopi a scansione laser commerciali equipaggiando un rilevatore in avanti non sottoposto a scansione con filtri a banda e uno schema di rilevamento dell'amplificatore lock-in (LIA). Un layout schematico di un tipico microscopio SRS include quanto segue: due fasci laser pulsati (cioè la pompa e la sonda diretta in un microscopio a scansione), che devono essere sovrapposti sia nello spazio che nel tempo sul piano dell'immagine, quindi focalizzati da un obiettivo del microscopio il campione attraverso due specchi di scansione (SM), che raster il punto focale attraverso un piano x-y. Dopo l'interazione con il campione, gli impulsi di uscita trasmessi vengono raccolti da un obiettivo superiore e misurati da un sistema di rilevamento in avanti inserito in un microscopio invertito. Gli impulsi della pompa vengono rimossi da una pila di filtri ottici, mentre gli impulsi della sonda che sono il risultato del processo SRS che si verificano nel volume focale del campione sono misurati da un fotodiode (PD). La lettura del PD è demodulata dal LIA per estrarre la profondità di modulazione. Un'immagine bidimensionale (2D) viene ottenuta sincronizzando l'unità di rilevamento in avanti con l'unità di scansione al microscopio. In questo articolo, l'implementazione di un microscopio SRS è descritta e dimostrata con successo, così come la segnalazione di immagini prive di etichette di perline di polistirolo con diametri di 3 m. Vale la pena notare che i microscopi SRS non sono disponibili in commercio, quindi per sfruttare queste caratteristiche, la costruzione fatta in casa è l'unica opzione. Poiché la microscopia SRS sta diventando popolare in molti campi, si ritiene che questa attenta descrizione dell'implementazione del microscopio SRS possa essere molto utile per la comunità scientifica.

Un esempio di misurazione SRS (cioè la misurazione SRS in un singolo punto del campione) è riportato nella figura 7. Quando le travi non sono sovrapposte nel tempo o nello spazio, il risultato ottenuto è riportato nella figura 8a. In off-resonance, l'ampiezza del segnale misurata da LIA è pari a zero, mentre la fase del segnale misurata da LIA salta tra valori negativi e positivi. Mentre, quando le travi sono sovrapposte nello spazio, spostando la lin...

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Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Implementazione di un microscopio non lineare basato sullo scattering Raman stimolato

In questo manoscritto, viene descritta l'implementazione di un microscopio stimolato Raman scattering (SRS), ottenuto dall'integrazione di un set-up sperimentale SRS con un microscopio a scansione laser. Il microscopio SRS si basa su due sorgenti laser femtosecondo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) e un oscillatore parametrico ottico sincronizzato (OPO).

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Questo protocollo può aiutare lo scienziato interessato alla microscopia non lineare a comprendere i componenti chiave, l'impostazione e la procedura di allineamento di un microscopio basato sullo scattering Raman stimolato. I principali vantaggi della microscopia SRS sono le sue capacità di eseguire immagini senza etichette basate sul contrasto vibrazionale e di acquisire un'immagine in pochi secondi. La microscopia SRS ha portato l'imaging senza etichette a nuovi livelli, in particolare studi su strutture biologiche complesse come i lipidi, che sono fondamentali per le cellule e l'architettura cellulare.Il segnale SRS viene rilevato come un piccolo cambiamento nell'intensità del fascio della sonda e può essere danneggiato dal rumore. Pertanto, un segnale accurato è fondamentale. Per iniziare, allineare l'OPO e i raggi laser titanio-zaffiro in modo che entrambi raggiungano il microscopio.Quindi, posizionare i rivelatori del sensore di posizione del raggio laser in due posizioni tra lo specchio dicroico uno e lo specchio sei. La prima posizione si trova vicino allo specchio dicroico uno e la seconda è vicina allo specchio sei. Per ogni posizione, utilizzare i sensori per rilevare le coordinate X e Y del fascio OPO.È importante sottolineare che le coordinate X e Y del raggio laser titanio-zaffiro sono dello stesso OPO in entrambe le posizioni dei rivelatori del sensore. Se, in alcune posizioni, le coordinate non coincidono, sintonizzate l'inclinazione dello specchio adiacente per compensare. Seguire questa stessa procedura per allineare le posizioni del fascio di titanio-zaffiro rispetto all'OPO per il percorso tra i sei e i sette dello specchio.Installare uno specchio aggiuntivo su un supporto flip-flop tra lo specchio sei e sette e capovolgere il supporto dello specchio per dirigere la trave nell'autocorrelatore. Accensione del controller autocorrelatore, avviare l'applicazione software sul computer che la controlla e impostare la vite di regolazione della distanza del fascio dell'autocorrelatore sulla sua posizione normale a 8,35 millimetri. Quindi, arrestare il fascio di zaffiro di titanio e rilasciare e proiettare il fascio OPO dallo specchio aggiuntivo allo specchio di ingresso dell'autocorrelatore.Prova a regolare lo specchio di ingresso per massimizzare il segnale di impulso laser come mostrato qui. Quindi, arrestare il fascio OPO e rilasciare e proiettare la trave in titanio zaffiro dallo specchio montato in infradito allo specchio di ingresso e all'autocorrelatore. Ripetere la regolazione ottimale del fascio fino a ottenere il segnale di autocorrelatore, mostrato qui.Ora, impostare la vite di regolazione della distanza del fascio sulla posizione trasversale a 7,30 millimetri. Rilasciare entrambe le travi e scansionare la linea ritardata per sovrapporre le due travi. Ottenere il segnale cross-correlatore risultante, come mostrato qui.Quindi, capovolgere lo specchio montato sulle infradito in modo che le travi possano raggiungere lo specchio sette e la testa di scansione del microscopio. Rimuovere il condensatore e utilizzare il pulsante di fuga per ritrarre temporaneamente l'obiettivo soggettivo 60x. Quindi ruotare il nasello per spostare la lente soggettiva 60x dal percorso ottico.Quindi, montare il rilevatore nella parte superiore del microscopio utilizzando il supporto meccanico esterno. Collegare l'uscita del rilevatore tramite un filtro passa basso da 50 Ohm a un oscilloscopio. Ora, accendi il processore che controlla la testa dello scanner e proietta il fascio OPO nella testa dello scanner del microscopio.Monitorare il segnale OPO e massimizzare la potenza misurata dal rilevatore utilizzando un traduttore XY. Quindi, passare il raggio dal laser OPO al laser titanium-zaffiro e verificare che si ottiene anche un segnale per il laser titanium-zaffiro. Ciò indica che entrambe le travi sono ben allineate.Finalizzare l'allineamento del fascio ruotando indietro il nasello per introdurre il 60x soggettivo. Quindi, utilizzare il pulsante di rifocalizzare sul microscopio per recuperare la messa a fuoco finalizzata sull'obiettivo del microscopio 60x. Infine, posizionare l'obiettivo, con un ingrandimento di 40x, al posto del condensatore senza toccare o disturbare il campione.Impostare la potenza dei laser Titanium-sapphire e OPO misurati prima del microscopio su 30 milliwatt per entrambi i raggi. Quindi, impostare la lunghezza d'onda del laser OPO su un valore diverso, rispetto al precedente, in modo che la pompa e la sonda non siano in risonanza con la frequenza vibrazionale delle perline. Quindi, rilasciare entrambe le travi, in modo che entrino nel microscopio.Eseguire il traduttore computerizzato della linea di ritardo di scansione e registrare l'intensità misurata utilizzando l'amplificatore lock-in per ogni posizione della linea di ritardo. Attendere il completamento della scansione della riga di ritardo. Ora, impostate la lunghezza d'onda dell'OPO su 1076 nanometri, in modo che la pompa e la sonda siano in risonanza con la frequenza vibrazionale delle perline.Eseguire il traduttore computerizzato della riga di ritardo della scansione e attendere il completamento della scansione della riga di ritardo. Infine, impostare la posizione del fascio di sovrapposizione ottenuta e la linea di ritardo per la successiva acquisizione di immagini di scattering Raman stimolate. Per ottimizzare la sincronizzazione spaziale delle travi, iniziare arrestando il fascio di titanio-zaffiro e riducendo la potenza OPO a otto milliwatt.Quindi, collegare la lettura del rilevatore alla scheda di acquisizione dati. Eseguire il programma di acquisizione dati insieme alla console di scansione del microscopio. Al termine, salva il file ed elabora i dati per ottenere un'immagine come quella mostrata qui.Quindi, arrestare il fascio OPO e ridurre la potenza dello zaffiro di titanio a 2,5-4,5 milliwatt. Collegare il rilevatore con l'amplificatore lock-in e le sue letture con la scheda di acquisizione dati. Quindi, eseguire nuovamente il programma di acquisizione dati insieme alla console di scansione del microscopio.Al termine, salva il file ed elabora i dati per ottenere un'immagine come quella mostrata qui. Introdurre una pila di filtri tra l'obiettivo 40x e il fotodiodo per rimuovere gli impulsi della pompa e acquisire solo il segnale di stoke. Quindi, impostare il segnale della pompa su 810 nanometri con una potenza focalizzata di otto milliwatt.Impostare il segnale della sonda su 1076 nanometri con la stessa potenza focalizzata di otto milliwatt per studiare un tipico legame carbonio-idrogeno del polistirolo con uno spostamento raman di 3054 centimetri inversi. Collegare il rilevatore con l'amplificatore lock-in e la lettura dell'amplificatore lock-in alla scheda di acquisizione dati. Infine, impostare il formato pixel e il tempo di acquisizione nel programma del microscopio ed eseguito e il sistema di acquisizione dati, salvando il file della matrice una volta completato.Qui viene visualizzata una misurazione di esempio da un singolo punto del campione. Quando il fascio non è sovrapposto nel tempo o nello spazio, il risultato ottenuto è fuori risonanza, dove l'ampiezza del segnale, misurata da un amplificatore lock-in, è zero. La fase di questo segnale, tuttavia, salta tra valori negativi e positivi.Se le travi sono sovrapposte nello spazio, il segnale aumenta e raggiunge il suo massimo quando le travi sono perfettamente sovrapposte nel tempo, mentre la fase inizia a raggiungere un valore fisso durante il periodo in cui le travi sono sovrapposte. In un'immagine di trasmissione, viene utilizzato un singolo fascio e l'intensità del fascio trasmesso dal campione viene misurata da un fotodiodo. A sinistra, l'immagine di trasmissione è stata ottenuta utilizzando OPO, mentre a destra, l'immagine di trasmissione è stata ottenuta utilizzando titanio-zaffiro.Un tipico esempio di immagine SRS è mostrato qui, in cui sono riportate immagini senza etichette di perline di polistirolo con diametri di tre micrometri. Al fine di ottenere un'immagine di alta qualità, basata sulla microscopia SRS, l'allineamento di un microscopio è fondamentale. Pertanto, tutti i gradini indicati nel protocollo devono essere eseguiti con attenzione.

Research

JoVE Journal

Engineering

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