Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
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IMM CNRのV.Tufano氏は、貴重な技術支援を受け、ニコンインスツルメンツの製品スペシャリストであるジャコモ・コッツィ氏に対し、有益な議論と継続的なサポートを提供し、感謝しています。この研究は、イタリア国立手術プログラムPONa3 00025(BIOforIU)とユーロバイオイメージング大規模な汎ヨーロッパ研究インフラプロジェクトによって部分的にサポートされました。

1. レーザーシステムの起動
<ol><li>チラーの温度が20°C以下に保たがあるかどうかを確認します。</li>
	<li>湿度制御ユニットが正常に動作し、湿度が約40%の値で維持されているかどうかを確認します。</li>
	<li>Ti:Saレーザーをオンにし、マニュアルの指示に厳密に従ってください。</li>
	<li>波長を 810 nm に設定します。</li>
	<li>OPO と接続されているミニコンピュータの電源を入れます。OPO レーザ?...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy:+a+tutorial.">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).</li><li>Camp, C. H., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators.">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li><li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology.">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li><li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets:+Size+matters.">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li><li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells:+size+and+optical+density+distribution.">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li><li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage.">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li><li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+distribution+in+living+cells:+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog.">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li><li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples.">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li><li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells:+A+precautionary+note.">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging:+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes.">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li><li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser.">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography.">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117 (2017).</li><li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

SRS顕微鏡は、特に細胞や細胞構造の基礎である脂質などの複雑な生物学的構造の研究において、ラベルフリーイメージングを新たな高みに引き上げました。脂質は、生体膜の産生などの複数の生理学的経路に関与し、生合成前駆体およびシグナルトランスデューサ10として機能する。脂質は、脂質液滴(LD)とも呼ばれる特殊な細胞内小器官に包装されています。その直径は数?...

ライフサイエンスアプリケーションでは、SRS顕微鏡検査はラベルフリーイメージングのための強力なツールとして登場しました。SRS顕微鏡検査の基本的な考え方は、振動コントラストの強さと数秒で画像を取得する能力を組み合わせることです。
SRSは、2つのレーザービーム周波数(ポンプ信号とストーク信号が異なる周波数で信号をストーク)と一致し、ラマン散乱を刺激し、有意な結果を引き起こすプロセスです。ストークス信号の増加。線形ラマン分光法とは異なり、SRSは入射光場に非線形依存性を示し、一貫した放射線を生成します。SRSには、1)速度、サンプルの動きや劣化に起因するアーティファクトに対する画像の感度が低くなる、2)優れた信号対雑音比(SNR)の2つの基本的な利点があります。さらに、SRSは自発的なラマンと同一のスペクトルを示し、SRS信号は、励起1、2、3、4、化学結合の濃度に直線的に比例する。5.
私たちの顕微鏡では、フェムト秒(fs)SRS実験セットアップは、高速ミラースキャンユニット(図1)6、7、8を装備した反転光学顕微鏡と統合されています。この顕微鏡を実装するために2つのパルスレーザー源が使用されます。1つ目は、パルス持続時間が約140fs、繰り返し速度が80MHz、発光波長が680~1080nmのfs-Ti:Saです。第2は、プローブビームとして使用され、Ti:Saによってポンピングされたフェムト秒同期光学パラメトリック発振器(SOPO)で、パルス持続時間は約200fs、繰り返し速度は80MHz、発光波長は1000~1600nmです。なお、Ti:SaとSOPOビームの間の最小光子エネルギー差は2500cm-1である。従って、このレーザーシステムの組み合わせを用いて、ラマンスペクトルの高周波C-H領域(2800-3200cm-1)のみを探索することができる6、7、8。
SRS顕微鏡をセットアップするためには、連続する段落に記載されている3つの重要な問題を考慮する必要があります。1 つ目は、高周波変調転送方式の実装です (説明については、プロトコルの図 2およびステップ 2.1 を参照)。SRSの実験的調査では、重要なパラメータはシステムの感度です。SRS信号は励起ビームの強度の小さな変化として検出されます。したがって、レーザー強度ノイズやショットノイズによって破損する可能性があります。この問題は、このシステムを高周波変調転送方式と統合することで解決できます (詳細については、プロトコルの図 2およびステップ 2.1 を参照してください)。この方法では、ポンプを調節するために電気光学変調器(EOM)が使用されます。プローブビームに転送された変調は、光学フィルタのスタックでポンプビームを遮断した後にPDによって検出することができる[刺激されたラマンゲイン(SRG)検出モード]。PD出力はローパスフィルタでロックインアンプ(LIA)に接続され、測定された信号を復調します。ビームの変調周波数を1MHz以上の周波数に増やすことで、PDの本質的な限界を得ることができます。
考慮すべき第二の問題は、前方検出を行うことを可能にする機械マウントの設置と同時に、明るい分野での顕微鏡観察を維持することです。さらに、画像の生成時に機械的振動による騒音を低減し、検出システムの正確な再配置を可能にする必要があります(プロトコルの図3およびステップ2.2を参照)。
第3は、位相感受性検出スキームによって得られた信号の同期であり、ビームは顕微鏡のスキャンヘッドによって監視されるサンプルに置かれる。画像を実現するためには、スキャンヘッドユニットに接続された顕微鏡コントローラが利用できる3つのTTL信号(ピクセルクロック、ライン同期、フレーム同期)が必要です。同期は、PCIカード、3つのTTL信号、およびLIA6、7、8の出力チャネルでの電圧信号の取得を使用して制御することによって達成される。自家製ソフトウェアが開発され、前述の6,7,8, 同期システムのハードウェアが図4で報告されています。
SRSイメージングを行う際の基本的な手順は、顕微鏡アライメントです。これは、連続する段落に記載されている4つのステップの過程で実現されます。1 つ目は、2 つの梁の空間的な重なりです(プロトコルの手順 3.1 を参照)。この実験セットアップでは、2つのビームをダイクロイックミラーによって空間的に結合した。予備ステップは、それぞれが顕微鏡に到達できるように、OPOとTi:Saの位置合わせです。次に、OPOを基準ビームとして考え、位置感度検出器を利用して、Ti:Saを空間的にOPOと重なります。
2 番目の重要な側面は、2 つのビームの時間的な重なりです (プロトコルの手順 3.2 を参照)。ポンプとOPOビームが完全に同期している場合でも9、OPOハウジング内のわずかに異なるビームパスに従うため、OPO出口では約5nsの時間遅延と5cmの空間差があります。したがって、Ti:Sa と OPO は、サンプルで時間的な重複を確実にするために、光学的に再タイミングを行う必要があります。これは通常、Ti:Saと顕微鏡の間に挿入される微細に微調整可能な光遅延ラインで達成されます(図1参照)。2 つのビームの時間的な重なりを得るために、2 つの手法が使用されます。1つ目は高速PDとオシロスコープを使用して行い、2つ目は自動およびクロスオプティカル相関に基づいています。最初の技術を使用して、2つのビームの大まかな重なり(10psの不確実性)、2つのビームの正確な時間的な重なりはクロスコリレータ(1 fsの分解能)を使用して得られます。
第3の重要な側面は、顕微鏡内の2つのビームの位置合わせです(プロトコルのステップ3.3を参照)。サンプルの予備的な白色光観察は、所望の視野(FOV)を分割することを可能にする。その後、レーザー光は、顕微鏡の側面ポートによって顕微鏡に入り、上部に取り付けられたPDに到達するために整列される(図3)。ただし、正しい画像集録を行うには、いくつかのパラメータ(ピクセル寸法やピクセルの所要時間など)を設定する必要があります。サンプリング周波数は、画像内のすべての情報を保持するためにナイキストの合理士によって課される制約を尊重する必要がありますが、各ピクセルで測定されたピクセルの空間座標とSRS値の間の正しい対応のために、統合時間LIA は、ピクセルのドウェル時間と等しいか同等である必要があります。
顕微鏡アライメントの最終段階では、空間的および時間的な位置合わせを最適化するために多数の試験が行われます(プロトコルのステップ3.4を参照)。空間的な重なりを最適化するために、Ti:Sa と OPO の両方に対して多数の伝送イメージ (TI) が取得されます。TIでは、単一のビームが使用され、サンプルからの透過ビーム強度がPDによって測定されます。OPOで実現したTIの場合、PD出力信号はPCIカードに直接接続され、Ti:Saで実現したTIの場合は、PD出力信号がLIAに接続され、LIAのアナログ出力がPCIカードに接続されます。透過画像は、FOV、照明、顕微鏡目的の焦点位置を最適化し、2つのビームが空間的に重なっているかどうかを確認するのに非常に有用である6、7、8。
ポンプとプローブビームの時間的な重なりの最適化は、3.3fsのタイムシフトに対応する0.001mmのステップで遅延ラインをスキャンし、直径3μmのポリスチレンビーズサンプルの単一点でSRS測定を行うことによって得られます。SRS信号の振幅は、プローブポンプ遅延の関数としてLIAからの値を測定し、2つのビーム6、7、8の正確な時間的な重なりに対応する最大値を提供する。結論を出す前に、すべての議論された手順は、高品質の画像を得るために必須であることに留意すべきです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡は近赤外線励起光を使用する;したがって、それは多くのマルチフォトン顕微鏡イメージング特性を共有しています。SRSイメージングモダリティは、適切なバンドパスフィルタとロックインアンプ(LIA)検出スキームを備えた非スキャンフォワードディテクタを装備することにより、市販のレーザー走査顕微鏡を使用して得ることができます。典型的なSRS顕微鏡の概略レイアウトには、2つのパルスレーザービーム(すなわち、走査顕微鏡で向けられたポンプとプローブ)が含まれており、これは画像面の空間と時間の両方で重なり合う必要があり、その後、顕微鏡の目的によって焦点を合わせます。サンプルは、X-y 平面を横切る焦点をラスターする 2 つのスキャン ミラー (SM) を介して行います。サンプルとの相互作用の後、送信された出力パルスは上の目的によって集められ、反転された顕微鏡に挿入される前方検出システムによって測定される。ポンプパルスは光学フィルターの積み重ねによって除去され、一方、試料の焦点体積で起こるSRSプロセスの結果であるプローブパルスはフォトダイオード(PD)によって測定される。PD の読み出しは、変調深度を抽出するために LIA によって復調されます。前方検出部を顕微鏡走査ユニットと同期させることにより、2次元(2D)画像を得ることができます。本論文では、SRS顕微鏡の実装について説明し、実証に成功し、直径3μmのポリスチレンビーズのラベルフリー画像の報告に成功した。SRS顕微鏡は市販されていないので、これらの特性を利用するために、自家製の構造が唯一の選択肢です。SRS顕微鏡検査は多くの分野で普及しつつあるため、SRS顕微鏡の実装に関するこの注意深い記述は、科学界にとって非常に有用であると考えられています。

SRS測定の例(すなわち、試料の単一点におけるSRS測定)が図7に報告されている。ビームが時間または空間で重なっていない場合、得られた結果は図8aに報告される。オフレゾナンスでは、LIAによって測定される信号の振幅はゼロであり、LIAによって測定された信号の位相は負の値と正の値の間でジャンプします。一方、ビームが空間内で重なり?...

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Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

刺激されたラマン散乱に基づく非線形顕微鏡の実施

本原稿では、レーザー走査顕微鏡とのSRS実験セットアップの統合により得られる刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡の実装について説明する。SRS顕微鏡は2つのフェムト秒(fs)レーザー源、Ti-Sapphire(Ti:Sa)および同期光学パラメトリック発振器(OPO)に基づいている。

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

このプロトコルは、非線形顕微鏡に興味を持つ科学者が、刺激されたラマン散乱に基づく顕微鏡の主要な構成要素、セットアップ、およびアライメント手順を理解するのに役立ちます。SRS顕微鏡の主な利点は、振動コントラストに基づいてラベルフリーイメージングを実行し、数秒で画像を取得する能力です。SRS顕微鏡は、細胞や細胞アーキテクチャの基本である脂質などの複雑な生物学的構造の研究を特に新たな高みにラベルフリーイメージングしました。SRS信号は、プローブビームの強度の小さな変化として検出され、ノイズによって破損する可能性があります。したがって、正確な符号が重要です。まず、OPOとチタンサファイアレーザービームを顕微鏡に合わせて調整します。次に、レーザービーム位置センサーの検出器を、二色鏡1とミラー6の間の2つの位置に配置します。最初の位置は二色性鏡1の近くに位置し、2番目の位置はミラー6に近い。位置ごとに、センサーを使用して OPO ビームの X 座標と Y 座標を検出します。重要なのは、チタンサファイアレーザービームのX座標とY座標が、センサーの検出器の両方の位置で同じOPOであることを確認することです。一部の位置で座標が一致しない場合は、隣接するミラーの傾きを調整して補正します。同じ手順に従って、ミラーの6と7の間のパスのOPOに関してチタンサファイアビーム位置を整列させます。ミラー6と7の間のフリップフロップマウントに追加のミラーを取り付け、ミラーのマウントを反転してビームを自動調整器に向ける。自動調整器コントローラの電源を入れ、制御するコンピュータでソフトウェアアプリケーションを起動し、オートコレータのビーム距離調整ネジを通常位置の8.35ミリメートルに設定します。次に、チタンサファイアビームを停止し、追加のミラーからオートコレータの入力ミラーにOPOビームを放出して投影します。ここに示すように、レーザーパルス信号を最大にするために入力ミラーを調整してみてください。次に、OPOビームを停止し、フリップフロップマウントミラーから入力ミラーにオートコレータにチタンサファイアビームを放出して投影します。ここに示す自動調整器信号が得られるまで、最適なビーム調整を繰り返します。次に、ビーム距離調整ネジを、7.30ミリメートルの十字位置に設定します。両方の梁を解放し、遅延ラインをスキャンして 2 つの梁をオーバーラップします。ここに示すように、得られたクロス相関信号を得る。次に、フリップフロップマウントミラーを反転して、ビームがミラー7と顕微鏡のスキャンヘッドに到達できるようにします。コンデンサーを取り外し、エスケープボタンを使用して60倍の主観レンズを一時的に引き込みます。その後、ノーズピースを回転させて、60倍の主観レンズを光学路から移動させます。次に、外部機械マウントを用いて検出器を顕微鏡の上部に取り付ける。50オームローパスフィルタを介して検出器の出力をオシロスコープに接続します。次に、スキャナーヘッドを制御するプロセッサの電源を入れ、OPOビームを顕微鏡のスキャナーヘッドに投影します。OPO信号を監視し、XY変換器を使用して検出器で測定された電力を最大にします。次に、OPOレーザーからチタンサファイアレーザーにビームを切り替え、チタンサファイアレーザーの信号も得られるかどうかを確認します。これは、両方の梁が適切に整列していることを示します。60x主観を導入するために、鼻片を後ろに回転させることでビームアライメントを完成。次に、顕微鏡の再焦点ボタンを使用して、最終的に60倍の顕微鏡対物レンズにフォーカスを取り戻します。最後に、サンプルに触れたり邪魔したりすることなく、凝縮器の代わりに40倍の倍率で目的を置きます。顕微鏡前に測定したチタンサファイアとOPOレーザーのパワーを、両方のビームで30ミリワットに設定します。そして、OPOレーザーの波長を、前の値に対して、ポンプとプローブがビーズの振動周波数と共振しないように設定する。次に、両方のビームを解放し、顕微鏡に入るようにします。スキャン遅延ラインのコンピュータ化されたトランスレータを実行し、遅延線の各位置に対してロックインアンプを使用して測定された強度を記録します。遅延行スキャンが完了するまで待ちます。今度は、OPOの波長を1076ナノメートルに戻し、ポンプとプローブがビーズの振動周波数と共振するようにします。スキャン遅延ラインのコンピュータ化されたトランスレータを実行し、遅延行のスキャンが完了するまで待ちます。最後に、得られた重なりビーム位置と、刺激されたラマン散乱画像の次の取得のための遅延線を設定する。ビームの空間同期を最適化するには、まずチタンサファイアビームを停止し、OPO電力を8ミリワットに減らすことから始めます。次に、検出器の読み出しをデータ取得カードに接続します。顕微鏡の走査コンソールと一緒にデータ収集プログラムを実行します。完了したら、ファイルを保存し、データを処理して、ここに示すような画像を取得します。次に、OPOビームを停止し、チタンサファイアの電力を2.5〜4.5ミリワットに減らします。データ取得カードを使用して、検知器をロックインアンプと読み出しに接続します。次に、顕微鏡走査コンソールとともにデータ収集プログラムを再度実行する。完了したら、ファイルを保存し、データを処理して、ここに示すような画像を取得します。40x目的とフォトダイオードの間にフィルターのスタックを導入して、ポンプパルスを除去し、ストーク信号のみを取得します。次に、ポンプ信号を8ミリワットの焦点を合わせて810ナノメートルに設定します。プローブ信号を8ミリワットの同じ焦点を合わせる力で1076ナノメートルに設定し、3054逆センチメートルのラマンシフトを持つポリスチレンの典型的な炭素水素結合を調査します。データ取得カードに、ロックインアンプとロックインアンプの読み出しを使用して検出器を接続します。最後に、顕微鏡プログラムでピクセル形式と取得時間を設定し、それをデータ取得システムと実行し、それが完了したらマトリックスファイルを保存します。サンプルの単一点からの測定例をここに示します。ビームが時間や空間で重なっていない場合、得られた結果は、ロックイン増幅器で測定される信号の振幅がゼロである、共振をオフにします。ただし、このシグナルの位相は負の値と正の値の間でジャンプします。ビームが空間で重なっている場合、ビームが完全に重なっているときに信号が増えて最大に達し、位相はビームが重なっている間に固定値を達成し始めます。透過画像では、単一のビームが使用され、サンプルからの送信されたビーム強度はフォトダイオードによって測定されます。左はOPOを用いて伝送画像を取得し、右側にはチタンサファイアを用いて伝送画像を取得した。SRS画像の典型的な例をここに示し、直径3マイクロメートルのポリスチレンビーズのラベルフリー画像が報告されています。SRS顕微鏡に基づいて、高品質の画像を得るためには、顕微鏡のアライメントが重要です。したがって、プロトコル内で示された全てのステップは注意深く行わなければならない。

Research

JoVE Journal

Engineering

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