Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Vi setter pris på V. Tufano fra IMM CNR for hans verdifulle tekniske assistanse og Giacomo Cozzi, produkt spesialist fra Nikon Instruments, for nyttige diskusjoner og kontinuerlig støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av italienske nasjonale operative programmer PONa3 00025 (BIOforIU) og av euro-Bioimaging stor skala Europas forskning infrastruktur prosjektet.

1. oppstart av Lasersystemet
<ol><li>Sjekk om temperaturen på kjølere opprettholdes ved eller under 20 ° c.</li>
	<li>Sjekk om luftfuktigheten kontrollenheten fungerer og fuktighet opprettholdes til en verdi rundt 40%.</li>
	<li>Slå på ti: sa laser, strengt følge instruksjonene i manualen.</li>
	<li>Sett bølgelengden til 810 NM.</li>
	<li>Slå på OPO og den tilkoblede mini-datamaskin. Kjør programmet som styrer OPO laser.</li>
	<li>Velg bypass hvis 100% av ti: sa laser utgang er nødvendig ved...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy:+a+tutorial.">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).</li><li>Camp, C. H., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators.">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li><li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology.">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li><li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets:+Size+matters.">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li><li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells:+size+and+optical+density+distribution.">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li><li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage.">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li><li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+distribution+in+living+cells:+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog.">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li><li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples.">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li><li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells:+A+precautionary+note.">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging:+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes.">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li><li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser.">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography.">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117 (2017).</li><li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

SRS mikroskopi har tatt etikett fri avbildning til nye høyder, spesielt i studier av komplekse biologiske strukturer som lipider, som er grunnleggende for celler og cellulær arkitektur. Lipider er involvert i flere fysiologiske veier som produksjon av biologiske membraner, og de fungerer som biosyntetiske forløpere og signal transdusere10. Lipider er pakket inn i spesialiserte intracellulære organeller, også kalt lipid dråper (LDs). Deres diameter varierer fra noen titalls nanometer til tita...

Inne livet vitenskap søknadene, SRS mikroskopi har smaragd idet kraftfull verktøyet for avmerke-ledig tenkelig. Den grunnleggende ideen om SRS mikroskopi er å kombinere styrken på vibrasjonsmedisin kontrast og dens evne til å tilegne seg bilder i løpet av få sekunder.
SRS er en prosess hvor frekvens forskjellen mellom to laserstråler frekvenser (pumpe signal og Stokes signal ved forskjellige frekvenser) matcher den molekylære vibrasjon av en undersøkt prøve, forårsaker stimulert Raman spredning og en betydelig økningen i Stokes-signalet. I motsetning til lineær Raman spektroskopi, viser SRS en ikke-lineær avhengighet av innkommende lys felt og produserer sammenhengende stråling. SRS har to grunnleggende fordeler: 1) hastighet, noe som gjør bildene mindre følsomme for gjenstander som oppstår fra prøve bevegelse eller-degradering, og 2) et utmerket signal-til-støy-forhold (SNR). I tillegg viser SRS et spektrum som er identisk med den spontane Raman, og SRS-signalet er lineært proporsjonal med konsentrasjonen av det kjemiske båndet spent1,2,3,4, fempå.
I vårt mikroskop er en femtosecond (FS) SRS eksperimentell oppsett integrert med en invertert optisk mikroskop utstyrt med en rask speil skanning enhet (figur 1)6,7,8. To pulserende laser kilder brukes til å implementere dette mikroskopet. Den første er en FS-ti: sa med en puls varighet på ca 140 FS, repetisjon rate på 80 MHz, og utslipps bølgelengder i området 680-1080 NM. Den andre, brukes som sonde strålen og pumpes av ti: sa, er en femtosecond synkronisert optisk parametrisk oscillator (SOPO), med en puls varighet på ca 200 FS, repetisjon rate på 80 MHz, og utslipps bølgelengder i området 1000-1600 NM. Det bør bemerkes at minimum Foton energi forskjellen mellom ti: sa og SOPO strålen er 2500 cm-1. Derfor bruker denne kombinasjonen av laser systemer, bare høy frekvens C-H region (2800-3200 cm-1) av Raman Spectra kan utforskes6,7,8.
For å sette opp et SRS-mikroskop, er det tre viktige problemer å vurdere, som er beskrevet i de etterfølgende avsnittene. Den første er gjennomføringen av en høyfrekvent modulerings metode (se figur 2 og trinn 2,1 av protokollen for en beskrivelse). I en SRS eksperimentell undersøkelse er en avgjørende parameter følsomheten til systemet. En SRS-signal oppdages som en liten endring i intensiteten av eksitasjon bjelker; Derfor kan det bli ødelagt av laser intensitet støy og skjøt støy. Dette problemet kan overvinnes ved å integrere dette systemet med en høyfrekvent modulerings metode (se figur 2 og trinn 2,1 av protokollen for detaljer). I denne metoden brukes en elektro-optikk (EOM) til å modulere pumpen. Moduleringen overført til sonden strålen kan deretter oppdages av en PD etter blokkering av pumpen strålen med en stabel av optiske filtre [stimulert Raman Gain (SRG) deteksjon modus]. PD-utgangen er koblet sammen med et low pass-filter til en låse forsterker (LIA), som demodulerer det målte signalet. Ved å øke modulerings frekvensen til strålen til frekvenser over 1 MHz, kan den iboende grensen for PDs skaffes.
Det andre problemet å vurdere er installasjon av en mekanisk montere som tillater å utføre fremover deteksjon og samtidig å bevare mikroskop observasjon i brightfield. I tillegg har det å redusere støyen på grunn av mekanisk vibrasjon under generering av bilder og for å tillate nøyaktig omplassering av deteksjonssystemet (se Figur 3 og trinn 2,2 av protokollen).
Den tredje er synkronisering av signalet ervervet av fase-sensitive deteksjon ordningen, med strålen plassert på prøven overvåkes av skanningen hodet av mikroskopet. For å realisere bilder krever SMs tre TTL-signaler som gjøres tilgjengelig av mikroskop kontrolleren som er koblet til skannehodet heten: Pikselklokke, linje synkronisering og ramme synkronisering. Synkroniseringen oppnås ved å kontrollere ved hjelp av et PCI-kort, de tre TTL-signalene, og oppkjøpet av et spenningssignal ved utgangs kanalen til Lia6,7,8. En hjemmelaget programvare er utviklet og beskrevet tidligere6,7,8, mens maskinvaren i synkroniseringen systemet er rapportert i Figur 4.
En grunnleggende prosedyre ved utføring av SRS-avbildning er justering av mikroskop. Det er realisert i løpet av fire trinn, som er beskrevet i de påfølgende avsnittene. Den første er den romlige overlapping av to bjelker (se trinn 3,1 av protokollen). I denne eksperimentelle satt opp, de to bjelkene var romlig collinearly kombinert med en dichroic speil. Det foreløpige trinnet er justeringen av OPO og ti: sa slik at hver når mikroskopet. Så, vurderer OPO som en referanse bjelke og dra nytte av en posisjon følsom detektor, ti: sa er romlig overlappes til OPO.
Det andre avgjørende aspektet er den timelige overlapping av to bjelker (se trinn 3,2 av protokollen). Selv om pumpen og OPO bjelker er perfekt synkronisert9, siden de følger litt annerledes stråle stier inne i OPO bolig, ved OPO exit de har en tidsforsinkelse på ca 5 NS og romlig forskjell på 5 cm. Derfor krever ti: sa og OPO å bli re-timet optisk for å sikre timelig overlapping ved prøven. Dette oppnås vanligvis med en fin tunable optisk forsinkelses linje, som i dette tilfellet er satt inn mellom ti: sa og mikroskopet (se figur 1). For å oppnå den timelige overlapping av to bjelker, er to teknikker som brukes. Den første er utført ved hjelp av en rask PD og oscilloskop, mens den andre er basert på auto-og kryss-optiske sammenhenger. Ved hjelp av den første teknikken, en grov overlapping av to bjelker er oppnådd (usikkerhet på 10 PS), mens en nøyaktig Temporal overlapping av to bjelker er innhentet ved hjelp av en Cross-multibane korrelator (oppløsning på 1 FS).
Det tredje avgjørende aspektet er justeringen av de to bjelkene inne i mikroskopet (se trinn 3,3 av protokollen). En foreløpig hvit lys observasjon av prøven gjør det mulig å individuate ønsket synsfelt (FOV). Deretter justeres laserstråler, som går inn i mikroskopet med en side port på mikroskopet, for å nå PD montert på den øvre delen (Figur 3). Hvis du vil ha riktig bilde anskaffelse, må du imidlertid angi en rekke parametere (for eksempel pikseldimensjon og piksel levetid). Sampling frekvensen må respektere begrensningen pålagt av Nyquist ' s setning for å bevare all informasjon i et bilde, mens for en riktig korrespondanse mellom romlige koordinater piksler og SRS-verdien målt i hver piksel, integreringen tid av LIA bør være lik eller sammenlignes med Pixel botid.
I det siste trinnet av mikroskop justering, utføres en rekke tester for å optimalisere den romlige og timelige justeringen (se trinn 3,4 av protokollen). En rekke overføring bilder (TI) for både ti: sa og OPO er ervervet for å optimalisere romlig overlapping. I en TI brukes en enkelt stråle, og den overførte stråle intensiteten fra prøven måles av en PD. I tilfelle av TI realisert ved OPO, PD utgangssignalet er direkte koblet til PCI-kort, mens i tilfelle av TI realisert av ti: sa, er PD utgangssignalet koblet til LIA og analog utgang av LIA er koblet til PCI-kort. Overføring bildene er svært nyttig for å optimalisere FOV, belysningen, fokus plasseringen av mikroskop mål og for å kontrollere om de to bjelkene er romlig overlappes6,7,8.
Optimaliseringen av pumpen og sonden strålen timelige overlapping oppnås ved å skanne forsinkelsen linje med trinn på 0,001 mm som tilsvarer en 3,3 FS tidsforskyvning og utføre en SRS-måling i et enkelt punkt av en polystyren perle sample 3 μm i diameter. Amplituden til et SRS-Signalmåler verdier fra lia, som en funksjon av sonden-pumpen forsinkelse, og gir en maksimal tilsvarende med eksakt Temporal overlapping av de to bjelkene6,7,8. Før avsluttende, bør det bemerkes at alle diskuterte trinnene er obligatoriske for å få et bilde av høy kvalitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

Stimulert Raman spredning (SRS) mikroskopi bruker nær-infrarød eksitasjon lys; Derfor, det aksjer mange multi-Foton mikroskopisk Imaging egenskaper. SRS Imaging modalitet kan fås ved hjelp av kommersielle laser-skanning mikroskop ved å utstyre med en ikke-descanned forover detektor med riktig bånd pass filtre og lock-in forsterker (LIA) deteksjon ordningen. Et skjematisk oppsett av et typisk SRS-mikroskop inkluderer følgende: to pulserende laserstråler (dvs. pumpen og sonden som er rettet i et skanne mikroskop), som må overlappes i både rom og tid på bildet flyet, deretter fokusert av et mikroskop objektiv i prøven gjennom to skanning speil (SMs), som raster fokus stedet over et x-y fly. Etter interaksjon med prøven, er overført utgang pulser samlet av en øvre mål og målt ved et fremover deteksjon system satt inn i et invertert mikroskop. Pumpe pulser fjernes av en stabel med optiske filtre, mens sonde pulser som er resultatet av SRS-prosessen som forekommer i det sentrale volumet i prøven måles av en PHOTODIODE (PD). Den avlesning av PD er demodulerte av LIA å trekke ut moduleringshjul dybden. Det oppnås et todimensjonal (2D) bilde ved å synkronisere den fremre deteksjons enheten med skanne enheten i mikroskopet. I dette dokumentet er implementeringen av et SRS-mikroskop beskrevet og vellykket demonstrert, samt rapportering av etikett frie bilder av polystyren perler med diameter på 3 μm. Det er verdt å merke seg at SRS mikroskop ikke er kommersielt tilgjengelig, så for å dra nytte av disse egenskapene, er hjemmelaget konstruksjonen det eneste alternativet. Siden SRS mikroskopi er blitt populær i mange felt, er det antatt at denne nøye beskrivelse av SRS mikroskop gjennomføringen kan være svært nyttig for det vitenskapelige samfunnet.

Et eksempel på SRS-måling (dvs. SRS-måling i ett enkelt punkt av prøven) rapporteres i figur 7. Når bjelkene ikke overlappes i tid eller rom, det oppnådde resultatet er rapportert i figur 8a. I off-resonans, amplituden av signalet målt ved LIA er null, mens den fasen av signalet målt ved LIA hopper mellom negative og positive verdier. Mens, når bjelkene er overlappet i rommet, flytte forsinkelsen linjen i et passende område, de oppnådde resulta...

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Implementering av et ikke-lineær mikroskop basert på stimulert Raman spredning

I dette manuskriptet, er implementeringen av en stimulert Raman spredning (SRS) mikroskop, fremstilt ved integrering av en SRS eksperimentell oppsett med en laserskanning mikroskop, beskrevet. SRS-mikroskopet er basert på to femtosecond (FS) laser kilder, en ti-Sapphire (ti: sa) og synkronisert optisk parametrisk oscillator (OPO).

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Denne protokollen kan hjelpe forskeren som er interessert i ikke-lineær mikroskopi for å forstå nøkkelkomponentene, oppsettet og justeringsprosedyren til et mikroskop basert på stimulert Raman-spredning. De viktigste fordelene med SRS mikroskopi er dens evner til å utføre etikettfri bildebehandling basert på vibrasjonskontrast og å skaffe seg et bilde om noen få sekunder. SRS mikroskopi har tatt etikettfri avbildning til nye høyder, spesielt studier av komplekse biologiske strukturer som lipider, som er grunnleggende for celler og cellulær arkitektur.SRS-signalet oppdages som en liten endring i intensiteten av probestrålen, og det kan bli ødelagt av støy. Derfor er et nøyaktig tegn avgjørende. For å begynne, juster OPO og Titanium-sapphire laserstråler slik at de begge når mikroskopet.Deretter plasserer du laserstråleposisjonssensorens detektorer i to posisjoner mellom det dichroic speil en og speil seks. Den første posisjonen ligger nær dichroic speil en og den andre er nær speil seks. For hver posisjon bruker du sensorene til å oppdage X- og Y-koordinatene til OPO-strålen.Det er viktig å kontrollere at X- og Y-koordinatene til Titanium-sapphire-laserstrålen er av samme OPO i begge posisjoner av sensorens detektorer. Hvis koordinatene i noen posisjoner ikke faller sammen, stiller du inn vippet på det tilstøtende speilet for å kompensere. Følg den samme fremgangsmåten for å justere Titanium-sapphire beam-posisjonene med hensyn til OPO for banen mellom speilets seks og syv.Monter et ekstra speil på en flip-flop mount mellom speil seks og syv og snu fjellet av speilet for å lede strålen inn i autokorrelatoren. Slå på autokorrelatorkontrolleren, start programmet på datamaskinen som kontrollerer den, og sett stråleavstandsjusteringsskruen til autokorrelatoren til normal posisjon på 8,35 millimeter. Deretter stopper du Titanium-sapphire-strålen og slipper ut og projiserer OPO-strålen fra det ekstra speilet til inngangsspeilet til autokorrelatoren.Prøv å justere inngangsspeilet for å maksimere laserpulssignalet som vist her. Deretter stopper du OPO-strålen og slipper ut og projiserer Titanium-sapphire-strålen fra det flip-flop monterte speilet til inngangsspeilet og inn i autokorrelatoren. Gjenta den optimale strålejusteringen til autokorrelatorsignalet, vist her, er oppnådd.Sett nå stråleavstandsjusteringsskruen til kryssposisjonen på 7,30 millimeter. Slipp begge bjelkene og skann den forsinkede linjen for å overlappe de to bjelkene. Få resulterende krysskorrelatorsignal, som vist her.Deretter vender du flip-flop montert speil slik at bjelkene kan nå speil syv og skannehodet på mikroskopet. Fjern kondensatoren og bruk escape-knappen til å trekke tilbake 60x subjektiv linse midlertidig. Roter deretter nesestykket for å flytte den 60x subjektive linsen av den optiske banen.Deretter monterer du detektoren til den øvre delen av mikroskopet ved hjelp av den eksterne mekaniske braketten. Koble detektorens utgang gjennom et 50 Ohm Low Pass-filter til et oscilloskop. Slå på prosessoren som styrer skannerhodet og projiserer OPO-strålen inn i skannerhodet på mikroskopet.Overvåk OPO-signalet og maksimer kraften målt av detektoren ved hjelp av en XY-oversetter. Deretter bytter du strålen fra OPO-laseren til Titanium-sapphire laseren og kontrollerer at et signal også er oppnådd for Titanium-sapphire laser. Dette indikerer at begge bjelkene er godt justert.Fullføre strålejusteringen ved å rotere tilbake nesestykket for å introdusere 60x subjektiv. Deretter bruker du refokusknappen på mikroskopet for å gjenvinne det endelige fokuset til 60x mikroskop objektivobjektiv. Til slutt plasserer du målet, med en forstørrelse på 40x, i stedet for kondensatoren uten å berøre eller forstyrre prøven.Sett kraften til Titanium-sapphire- og OPO-lasere målt før mikroskopet til 30 milliwatt for begge bjelkene. Deretter setter du bølgelengden til OPO-laseren til en annen verdi, med hensyn til den forrige, slik at pumpen og sonden ikke er i resonans med vibrasjonsfrekvensen til perlene. Deretter slipper du begge bjelkene, slik at de kommer inn i mikroskopet.Kjør skanneforsinkelseslinjen datastyrt oversetter og registrer den målte intensiteten ved hjelp av innlåsingsforsterkeren for hver posisjon på forsinkelseslinjen. Vent til skanningen av forsinkelseslinjen er fullført. Nå setter du bølgelengden til OPO tilbake til 1076 nanometer, slik at pumpen og sonden er i resonans med vibrasjonsfrekvensen til perlene.Kjør skanneforsinkelseslinjen datastyrt oversetter og vent til skanningen av forsinkelseslinjen er fullført. Til slutt, angi den oppnådde overlapping stråleposisjon og forsinkelseslinjen for neste oppkjøp av stimulert Raman spredning bilder. For å optimalisere romlig synkronisering av bjelkene, begynn med å stoppe Titanium-sapphire-strålen og redusere OPO-kraften til åtte milliwatt.Deretter kobler du detektoravlesningen til datainnsamlingskortet. Kjør datainnsamlingsprogrammet sammen med mikroskopskanningskonsollen. Når du er ferdig, lagrer du filen og behandler dataene for å få et bilde som det som vises her.Deretter stopper du OPO-strålen og reduserer titan-safirkraften til 2,5 til 4,5 milliwatt. Koble detektoren til låseforsterkeren og avlesningene til datainnhentingskortet. Deretter kjører du igjen datainnsamlingsprogrammet sammen med mikroskopskanningskonsollen.Når du er ferdig, lagrer du filen og behandler dataene for å få et bilde som det som vises her. Introdder en stabel med filtre mellom 40x-målet og fotodioden for å fjerne pumpepulsene og bare skaffe stokesignalet. Deretter setter du pumpesignalet til 810 nanometer med en fokusert effekt på åtte milliwatt.Sett probesignalet til 1076 nanometer med samme fokuserte kraft på åtte milliwatt for å undersøke en typisk karbon-hydrogenbinding av polystyren med et Raman-skifte på 3054 inverse centimeter. Koble detektoren til låseforsterkeren og den innlåste forsterkerens avlesning til datainnhentingskortet. Til slutt angir du pikselformatet og innhentingstiden i mikroskopprogrammet og kjører det og datainnsamlingssystemet, og lagrer matrisefilen når den er fullført.Et eksempelmåling fra ett enkelt punkt i prøven vises her. Når strålen ikke overlappes i tid eller rom, er det oppnådde resultatet av resonans, hvor amplituden av signalet, målt ved en innlåst forsterker, er null. Fasen av dette signalet hopper imidlertid mellom negative og positive verdier.Hvis bjelkene overlapper i rommet, øker og når signalet sitt maksimale når bjelkene er perfekt overlappet i tide, mens fasen begynner å oppnå en fast verdi i løpet av tiden bjelkene overlapper. I et overføringsbilde brukes en enkelt stråle, og den overførte stråleintensiteten fra prøven måles ved en fotodiode. Til venstre ble overføringsbildet innhentet ved hjelp av OPO, mens til høyre ble overføringsbildet oppnådd ved hjelp av Titanium-sapphire.Et typisk eksempel på et SRS-bilde vises her, der etikettfrie bilder av polystyrenperler med diameter på tre mikrometer rapporteres. For å få et bilde av høy kvalitet, basert på SRS-mikroskop, er justeringen av et mikroskop kritisk. Derfor må alle angitte trinn i protokollen utføres nøye.

Research

JoVE Journal

Engineering

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

Implementering av et referanse Interferometer for Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Coherent anti-Stokes Raman Scattering CARS Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) Mikros visualiserer farmasøytiske tabletter under oppløsning

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Måling av Spredning Nonlinearities fra en enkelt Plasmonic Nanopartikkel

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Automation of Mode Locking in a Nonlinear Polarization Rotation Fiber Laser through Output Polarization Measurements

Automatisering av Mode Låsing i en ikke-lineær polarisering rotasjon Fiber Laser gjennom Output Polarisering Målinger

When a laser is mode-locked, it emits a train of ultra-short pulses at a repetition rate determined by the laser cavity length. This article outlines a ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

Stimulert Stokes og Antistokes Raman spredning i mikrosfærisk Whispering Gallery Mode resonatorer

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) basert metode for å kvantitativt vurdere fremover og bakover lys spredning fra intraokulære objektiver

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

Høyhastighets Continuous-wave stimulert Brillouin spredning Spectrometer for materielle analyse

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

Experimental Implementation of a New Composite Fabrication Method: Exposing Bare Fibers on the Composite Surface by the Soft Layer Method

Eksperimentell gjennomføringen av en ny sammensatt fabrikasjon metode: utsette nakne fiber på sammensatte overflaten av myke lag metoden

The bipolar plate is a key component in proton exchange membrane fuel cells (PEMFCs) and vanadium redox flow batteries (VRFBs). It is a multi-functional ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

Demonstrasjon av en Hyperlens-integrert mikroskop og super-oppløsning Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Predicting Catalyst Extrudate Breakage Based on the Modulus of Rupture

Forutsi Catalyst Extrudate brudd basert på Modulus av brudd

The mechanical strength of extruded catalysts and their natural or forced breakage by either collision against a surface or by a compressive load in a ...