Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
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Agradecemos a V. Tufano do IMM CNR por sua valiosa assistência técnica e Giacomo Cozzi, especialista de produtos da Nikon Instruments, para discussões úteis e suporte contínuo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos programas operativos nacionais italianos PONa3 00025 (BIOforIU) e pelo euro-BioImaging projeto de infra-estrutura de investigação panEuropean em grande escala.

1. iniciando o sistema a laser
<ol><li>Verifique se a temperatura dos resfriadores é mantida a ou abaixo de 20 ° c.</li>
	<li>Verifique se a unidade de controle de umidade está funcionando corretamente e a umidade é mantida em um valor em torno de 40%.</li>
	<li>Ligue o laser ti: SA, seguindo rigorosamente as instruções do manual.</li>
	<li>Defina o comprimento de onda para 810 nm.</li>
	<li>Ligue o OPO e o mini-computador conectado. Execute o aplicativo que controla o laser OPO.</li>
	<li>Selecione bypas...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators.">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li><li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology.">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li><li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets:+Size+matters.">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li><li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells:+size+and+optical+density+distribution.">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li><li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage.">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li><li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+distribution+in+living+cells:+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog.">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li><li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples.">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li><li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells:+A+precautionary+note.">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging:+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes.">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li><li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser.">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography.">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117 (2017).</li><li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

A microscopia de SRS tomou a imagem latente Label-Free às alturas novas, especial nos estudos de estruturas biológicas complexas tais como lipídios, que são fundamentais às pilhas e à arquitetura celular. Os lipídios estão envolvidos em múltiplas vias fisiológicas, como a produção de membranas biológicas, e servem como precursores biossintéticos e Transdutores de sinal10. Os lipídios são embalados em organelas intracelulares especializadas, também denominadas gotículas lipídicas...

Em aplicações da ciência da vida, a microscopia de SRS emergiu como a ferramenta poderosa para a imagem latente Label-Free. A idéia básica da microscopia SRS é combinar a força do contraste vibracional e sua capacidade de adquirir imagens em poucos segundos.
SRS é um processo em que a diferença de frequência entre duas freqüências de feixes de laser (sinal da bomba e sinal Stokes em diferentes frequências) coincide com a vibração molecular de uma amostra investigada, causando dispersão Raman estimulado e uma significativa aumento do sinal Stokes. Ao contrário da Espectroscopia Raman linear, o SRS apresenta uma dependência não linear dos campos de luz recebidos e produz radiação coerente. SRS tem duas vantagens fundamentais: 1) velocidade, o que torna as imagens menos sensíveis aos artefactos resultantes do movimento da amostra ou degradação, e 2) uma excelente relação sinal-ruído (SNR). Além, SRS exibe um espectro idêntico ao Raman espontâneo, e o sinal de SRS é linearmente proporcional à concentração da ligação química excited1,2,3,4, a 5.
Em nosso microscópio, um femtossegundo (FS) SRS experimental set-up é integrado com um microscópio óptico invertido equipado com uma unidade de digitalização de espelhos rápidos (Figura 1)6,7,8. Duas fontes de laser pulsada são usadas para implementar este microscópio. O primeiro é um FS-ti: SA com uma duração de pulso de aproximadamente 140 FS, taxa de repetição de 80 MHz, e comprimentos de onda de emissão na faixa de 680-1080 nm. O segundo, usado como feixe de sonda e bombeado por ti: SA, é um oscilador paramétrico óptico sincronizado femtossegundo (Sopo), com uma duração de pulso de aproximadamente 200 FS, taxa de repetição de 80 MHz e comprimentos de onda de emissão na faixa de 1000-1600 nm. Deve-se notar que a diferença mínima de energia do fóton entre o feixe ti: SA e SOPO é de 2500 cm-1. Portanto, usando essa combinação de sistemas a laser, apenas a região C-H de alta frequência (2800-3200 cm-1) dos espectros Raman pode ser explorada6,7,8.
A fim estabelecer um microscópio de SRS, há três edições cruciais a considerar, que são descritas nos parágrafos sucessivos. A primeira é a implementação de um método de transferência de modulação de alta frequência (ver Figura 2 e etapa 2,1 do protocolo para uma descrição). Em uma investigação experimental SRS, um parâmetro crucial é a sensibilidade do sistema. Um sinal de SRS é detectado como uma pequena alteração na intensidade dos feixes de excitação; Conseqüentemente, pode ser corrompido pelo ruído da intensidade do laser e pelo ruído do tiro. Esta edição pode ser superada integrando este sistema com um método de transferência de alta freqüência da modulação (veja Figura 2 e etapa 2,1 do protocolo para detalhes). Neste método, um modulador electro-óptico (EOM) é usado para modular a bomba. A modulação transferida para o feixe de sonda pode então ser detectada por um PD depois de bloquear o feixe da bomba com uma pilha de filtros ópticos [estimulado o ganho Raman (SRG) modo de detecção]. A saída PD é conectada por um filtro passa-baixo para um amplificador de bloqueio (LIA), que demodula o sinal medido. Ao aumentar a frequência de modulação do feixe para freqüências acima de 1 MHz, o limite intrínseco do PDs pode ser obtido.
A segunda edição a considerar é a instalação de uma montagem mecânica que permita realizar a deteção para diante e ao mesmo tempo preservar a observação do microscópio no brightfield. Além, tem que reduzir o ruído devido à vibração mecânica durante a geração de imagens e permitir o reposicionamento preciso do sistema de deteção (veja Figura 3 e etapa 2,2 do protocolo).
A terceira é a sincronização do sinal adquirido pelo esquema de detecção sensível à fase, com o feixe posicionado na amostra monitorada pelo cabeçote de varredura do microscópio. A fim realizar imagens, os SMs exigem três sinais do TTL que são disponibilizados pelo controlador do microscópio conectado à unidade da cabeça da varredura: pulso de disparo do pixel, sincronização da linha, e sincronização do frame. A sincronização é conseguida controlando usando um cartão do PCI, os três sinais do TTL, e a aquisição de um sinal da tensão no canal de saída de lia6,7,8. Um software caseiro foi desenvolvido e descrito anteriormente6,7,8, enquanto o hardware do sistema de sincronização é relatado na Figura 4.
Um procedimento fundamental ao realizar a imagem latente de SRS é alinhamento do microscópio. Realiza-se ao longo de quatro etapas, que são descritas nos parágrafos sucessivos. A primeira é a sobreposição espacial de duas vigas (ver passo 3,1 do protocolo). Nesta fase experimental, as duas vigas foram combinadas espacialmente por um espelho dicróico. A etapa preliminar é o alinhamento de OPO e de ti: SA de modo que cada um alcangue o microscópio. Em seguida, considerando OPO como um feixe de referência e tirando proveito de um detector de posição sensível, o ti: SA é espacialmente sobreposta a OPO.
O segundo aspecto crucial é a sobreposição temporal de duas vigas (ver passo 3,2 do protocolo). Mesmo se a bomba e os feixes de OPO são perfeitamente sincronizados9, uma vez que seguem caminhos de feixe ligeiramente diferentes dentro da habitação opo, na saída opo eles têm um atraso de cerca de 5 ns e diferença espacial de 5 cm. Portanto, ti: SA e OPO exigem re-cronometrado opticamente para garantir a sobreposição temporal na amostra. Isso normalmente é realizado com uma linha de retardo óptico finamente sintonável, que neste caso é inserida entre o ti: SA e o microscópio (veja a Figura 1). A fim de obter a sobreposição temporal de dois feixes, duas técnicas são usadas. O primeiro é realizado usando um PD rápido e osciloscópio, enquanto o segundo é baseado em correlações auto e Cross-Optical. Usando a primeira técnica, uma sobreposição áspera de dois feixes é obtida (incerteza de 10 picosegundo), quando uma sobreposição temporal exata de dois feixes for obtida usando um cross-correlator (definição de 1 FS).
O terceiro aspecto crucial é o alinhamento das duas vigas no interior do microscópio (ver passo 3,3 do protocolo). Uma observação preliminar da luz branca da amostra permite individuar o campo de visão desejado (FOV). Em seguida, os feixes de laser, entrando no microscópio por uma porta lateral do microscópio, são alinhados a fim alcangar o paládio montado na parte superior (Figura 3). No entanto, para uma aquisição de imagem correta, é necessário definir um número de parâmetros (por exemplo, dimensão de pixel e tempo de permanência do pixel). A frequência de amostragem deve respeitar a restrição imposta pelo teorema de Nyquist, a fim de preservar todas as informações em uma imagem, enquanto que para uma correspondência correta entre as coordenadas espaciais de pixels e o valor de SRS medido em cada pixel, o tempo de integração de LIA deve ser igual ou comparável ao tempo de permanência do pixel.
Na etapa final do alinhamento do microscópio, são realizados inúmeros testes para otimizar o alinhamento espacial e temporal (ver etapa 3,4 do protocolo). Uma série de imagens de transmissão (TI) para ti: SA e OPO são adquiridas a fim de otimizar a sobreposição espacial. Em um TI, um único feixe é usado, e a intensidade transmitida do feixe da amostra é medida por um PD. No caso de TI realizado por OPO, o sinal de saída PD está diretamente conectado ao cartão PCI, enquanto no caso de TI realizado por ti: SA, o sinal de saída PD é conectado a LIA e saída analógica de LIA está conectado a placa PCI. As imagens de transmissão são muito úteis para otimizar o FOV, a iluminação, a posição focal dos objetivos do microscópio e verificar se as duas vigas são espacialmente sobrepostas6,7,8.
A otimização da sobreposição temporal da bomba e do feixe de sonda é obtida através da digitalização da linha de retardo com etapas de 0, 1 mm correspondendo a um deslocamento de tempo de 3,3 FS e realizando uma medição de SRS em um único ponto de uma amostra de grânulo de poliestireno de 3 μm de diâmetro. A amplitude de um sinal de SRS mede valores de lia, em função do retardo da sonda-bomba, e fornece um máximo correspondente com a sobreposição temporal exata das duas vigas6,7,8. Antes de concluir, deve-se notar que todas as etapas discutidas são obrigatórias para obter uma imagem de alta qualidade.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

A microscopia de espalhamento Raman (SRS) estimulada usa luz de excitação near-infrared; Conseqüentemente, compartilha de muitas propriedades microscópicas da imagem latente do multi-fóton. A modalidade da imagem latente de SRS pode ser obtida usando microscópios comerciais da laser-exploração equipando com um detector dianteiro não-descanned com filtros apropriados do bandpass e o esquema de deteção do fechamento-no amplificador (LIA). Uma disposição esquemática de um microscópio típico de SRS inclui o seguinte: dois feixes de laser pulsado, (isto é, a bomba e a ponta de prova dirigidas em um microscópio da exploração), que deva ser sobreposta no espaço e no tempo no plano da imagem, a seguir focalizada por um objetivo do microscópio em a amostra através de dois espelhos de digitalização (SMs), que raster o ponto focal através de um plano x-y. Após a interação com a amostra, os pulsos de saída transmitidos são coletados por um objetivo superior e medidos por um sistema de detecção de avanço inserido em um microscópio invertido. Os pulsos da bomba são removidos por uma pilha de filtros óticos, visto que os pulsos da ponta de prova que são o resultado do processo de SRS que ocorre no volume focal do espécime são medidos por um fotodiodo (paládio). O leitura do paládio é demodulado pelo lia para extrair a profundidade da modulação. Uma imagem bidimensional (2D) é obtida sincronizando a unidade de detecção direta com a unidade de digitalização do microscópio. Neste trabalho, a implementação de um microscópio de SRS é descrita e demonstrada com sucesso, bem como a comunicação de imagens sem rótulo de grânulos de poliestireno com diâmetros de 3 μm. Vale a pena notar que os microscópios SRS não estão disponíveis comercialmente, por isso, a fim de tirar proveito dessas características, a construção caseira é a única opção. Desde que a microscopia de SRS está tornando-se popular em muitos campos, acredita-se que esta descrição cuidadosa da implementação do microscópio de SRS pode ser muito útil para a comunidade científica.

Um exemplo de medida SRS (i.e., medida SRS em um único ponto da amostra) é relatado na Figura 7. Quando as vigas não são sobrepostas no tempo ou no espaço, o resultado obtido é relatado na figura 8a. Em off-Resonance, a amplitude do sinal medido pela LIA é zero, enquanto a fase de sinal medido pela LIA salta entre valores negativos e positivos. Enquanto que, quando as vigas são sobrepostas no espaço, movendo a linha de atraso em um intervalo apro...

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Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Implementação de um microscópio não-linear baseado em espalhamento Raman estimulado

Neste manuscrito, é descrita a implementação de um microscópio de espalhamento Raman (SRS) estimulado, obtido pela integração de um conjunto experimental de SRS com um microscópio de varredura a laser. O microscópio de SRS é baseado em duas fontes do laser do femtossegundo (FS), em um ti-safira (ti: SA) e em oscilador paramétrico ótico sincronizado (OPO).

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Este protocolo pode ajudar o cientista interessado em microscopia não linear a entender os componentes-chave, a configuração e o procedimento de alinhamento de um microscópio baseado na dispersão estimulada de Raman. As principais vantagens da microscopia SRS são suas habilidades para realizar imagens sem rótulos baseadas no contraste vibracional e adquirir uma imagem em poucos segundos. A microscopia SRS levou a imagem livre de rótulos a novos patamares, especialmente estudos de estruturas biológicas complexas, como lipídios, que são fundamentais para as células e a arquitetura celular.O sinal SRS é detectado como uma pequena mudança na intensidade do feixe da sonda e pode ser corrompido pelo ruído. Portanto, um sinal preciso é crucial. Para começar, alinhe o OPO e os raios laser de safira de titânio para que ambos cheguem ao microscópio.Em seguida, coloque os detectores de posição do raio laser em duas posições entre o espelho dicroico um e o espelho seis. A primeira posição está localizada perto do espelho dicroico um e a segunda está perto do espelho seis. Para cada posição, use os sensores para detectar as coordenadas X e Y do feixe OPO.É importante verificar se as coordenadas X e Y do raio laser de titânio-safira são do mesmo OPO em ambas as posições dos detectores do sensor. Se, em algumas posições, as coordenadas não coincidirem, sintonize a inclinação do espelho adjacente para compensar. Siga este mesmo procedimento para alinhar as posições do feixe de safira de titânio em relação ao OPO para o caminho entre os seis e sete do espelho.Instale um espelho adicional em um suporte de flip-flop entre o espelho seis e sete e gire o suporte do espelho para direcionar o feixe para o autocorrelador. Ligue o controlador de correção automática, inicie o aplicativo de software no computador que o controla e ajuste o parafuso de ajuste de distância do feixe do autocorrelador para sua posição normal em 8,35 milímetros. Em seguida, pare o feixe de safira de titânio e solte e projete o feixe OPO do espelho adicional para o espelho de entrada do autocorrelador.Tente ajustar o espelho de entrada para maximizar o sinal de pulso laser, como mostrado aqui. Em seguida, pare o feixe OPO e solte e projete o feixe de safira de titânio do espelho montado no flip-flop para o espelho de entrada e para o corregedor automático. Repita o ajuste ideal do feixe até que o sinal de corretivo automático, mostrado aqui, seja obtido.Agora, ajuste o parafuso de ajuste de distância do feixe para a posição cruzada em 7,30 milímetros. Solte os dois feixes e escaneie a linha atrasada para sobrepor as duas vigas. Obtenha o sinal de correlator cruzado resultante, como mostrado aqui.Em seguida, gire o espelho montado no flip-flop para que os feixes possam alcançar o espelho sete e a cabeça de varredura do microscópio. Remova o condensador e use o botão de fuga para retrair temporariamente a lente subjetiva de 60x. Em seguida, gire a peça do nariz para mover a lente subjetiva de 60x para fora do caminho óptico.Em seguida, monte o detector na parte superior do microscópio usando o suporte mecânico externo. Conecte a saída do detector através de um filtro de passe baixo de 50 Ohm a um osciloscópio. Agora, ligue o processador que controla a cabeça do scanner e projete o feixe OPO na cabeça do scanner do microscópio.Monitore o sinal OPO e maximize a energia medida pelo detector usando um tradutor XY. Em seguida, troque o feixe do laser OPO para o laser de titânio-safira e verifique se um sinal também é obtido para o laser de safira de titânio. Isso indica que ambas as vigas estão bem alinhadas.Finalize o alinhamento do feixe girando para trás a peça do nariz para introduzir o subjetivo de 60x. Em seguida, use o botão de refoco no microscópio para recuperar o foco finalizado para a lente objetiva do microscópio 60x. Por fim, coloque o objetivo, com uma ampliação de 40x, no lugar do condensador sem tocar ou perturbar a amostra.Defina a potência dos lasers titanium-safira e OPO medidos antes do microscópio para 30 miliwatts para ambos os feixes. Em seguida, defina o comprimento de onda do laser OPO a um valor diferente, em relação ao anterior, de modo que a bomba e a sonda não estejam em ressonância com a frequência vibracional das contas. Em seguida, solte ambos os feixes, para que entrem no microscópio.Execute o tradutor informatizado da linha de atraso de varredura e regise a intensidade medida usando o amplificador de travamento para cada posição da linha de atraso. Aguarde até que a varredura da linha de atraso esteja completa. Agora, defina o comprimento de onda do OPO de volta para 1076 nanômetros, de modo que a bomba e a sonda estejam em ressonância com a frequência vibracional das contas.Execute a linha de atraso de varredura do tradutor informatizado e aguarde até que a varredura da linha de atraso esteja concluída. Por fim, defina a posição de sobreposição obtida e a linha de atraso para a próxima aquisição de imagens de dispersão de Raman estimuladas. Para otimizar a sincronização espacial dos feixes, comece por parar o feixe de safira de titânio e reduzir a potência OPO para oito miliwatts.Em seguida, conecte a leitura do detector ao cartão de aquisição de dados. Execute o programa de aquisição de dados junto com o console de digitalização de microscópio. Quando terminar, salve o arquivo e processe os dados para obter uma imagem como a mostrada aqui.Em seguida, pare o feixe OPO e reduza a potência de titânio-safira para 2,5 a 4,5 miliwatts. Conecte o detector com o amplificador de travamento e suas leituras com o cartão de aquisição de dados. Em seguida, execute novamente o programa de aquisição de dados junto com o console de digitalização de microscópio.Quando terminar, salve o arquivo e processe os dados para obter uma imagem como a mostrada aqui. Introduza uma pilha de filtros entre o objetivo de 40x e o fotodiodo para remover os pulsos da bomba e adquirir apenas o sinal de botão. Em seguida, defina o sinal da bomba para 810 nanômetros com uma potência focal focada de oito miliwatts.Defina o sinal da sonda para 1076 nanômetros com a mesma potência focal focada de oito miliwatts para investigar uma ligação carbono-hidrogênio típica de poliestireno com uma mudança raman de 3054 centímetros inversos. Conecte o detector com o amplificador de travamento e a leitura do amplificador de bloqueio ao cartão de aquisição de dados. Finalmente, defina o formato de pixel e o tempo de aquisição no programa de microscópio e execute-o e ao sistema de aquisição de dados, salvando o arquivo matrix assim que ele estiver completo.Uma medição de exemplo de um único ponto da amostra é exibida aqui. Quando o feixe não é sobreposto no tempo ou espaço, o resultado obtido é fora da ressonância, onde a amplitude do sinal, medida por um amplificador de travamento, é zero. A fase desse sinal, no entanto, salta entre valores negativos e positivos.Se os feixes forem sobrepostos no espaço, o sinal aumenta e atinge seu máximo quando os feixes são perfeitamente sobrepostos no tempo, enquanto a fase começa a atingir um valor fixo durante o tempo em que as vigas são sobrepostas. Em uma imagem de transmissão, um único feixe é usado e a intensidade do feixe transmitido da amostra é medida por um fotodiodo. À esquerda, a imagem de transmissão foi obtida utilizando OPO, enquanto à direita, a imagem de transmissão foi obtida utilizando-se de safira de titânio.Um exemplo típico de uma imagem SRS é mostrado aqui, no qual são relatadas imagens livres de rótulos de contas de poliestireno com diâmetros de três micrômetros. Para obter uma imagem de alta qualidade, baseada na microscopia SRS, o alinhamento de um microscópio é fundamental. Portanto, todos os passos indicados no protocolo devem ser realizados com cuidado.

Research

JoVE Journal

Engineering

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Engenharia

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