Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Agradecemos a V. Tufano de IMM CNR por su valiosa asistencia técnica y a Giacomo Cozzi, especialista en productos de Nikon Instruments, por sus útiles debates y soporte continuo. Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Programas Operativos Nacionales Italianos PONa3 00025 (BIOforIU) y por el proyecto de infraestructura de investigación paneuropea Euro-Bioimaging a gran escala.

1. Puesta en marcha del sistema láser
<ol><li>Compruebe si la temperatura de los enfriadores se mantiene a o por debajo de 20 oC.</li>
	<li>Compruebe si la unidad de control de humedad funciona correctamente y la humedad se mantiene en un valor de alrededor del 40%.</li>
	<li>Encienda el láser Ti:Sa, siguiendo estrictamente las instrucciones del manual.</li>
	<li>Establezca la longitud de onda en 810 nm.</li>
	<li>Encienda la OPO y el miniordenador conectado. Ejecute la aplicación que controla el láser de OPO.</li>...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy:+a+tutorial.">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).</li><li>Camp, C. H., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators.">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li><li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology.">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li><li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets:+Size+matters.">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li><li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells:+size+and+optical+density+distribution.">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li><li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage.">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li><li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+distribution+in+living+cells:+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog.">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li><li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples.">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li><li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells:+A+precautionary+note.">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging:+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes.">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li><li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser.">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography.">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117 (2017).</li><li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

La microscopía SRS ha llevado la imagen sin etiquetas a nuevas alturas, especialmente en estudios de estructuras biológicas complejas como los lípidos, que son fundamentales para las células y la arquitectura celular. Los lípidos están involucrados en múltiples vías fisiológicas como la producción de membranas biológicas, y sirven como precursores biosintéticos y transductores de señal10. Los lípidos se envasan en orgánulos intracelulares especializados, también llamados gotas de l...

En aplicaciones de ciencias de la vida, la microscopía SRS ha surgido como una poderosa herramienta para la creación de imágenes sin etiquetas. La idea básica de la microscopía SRS es combinar la fuerza del contraste vibratorio y su capacidad para adquirir imágenes en pocos segundos.
SRS es un proceso en el que la diferencia de frecuencia entre dos frecuencias de rayos láser (señal de bomba y señal de estoculas a diferentes frecuencias) coincide con la vibración molecular de una muestra investigada, causando dispersión de Raman estimulada y una dispersión significativa de Raman y una dispersión significativa aumento de la señal Stokes. A diferencia de la espectroscopia lineal de Raman, SRS exhibe una dependencia no lineal de los campos de luz entrantes y produce radiación coherente. SRS tiene dos ventajas fundamentales: 1) velocidad, lo que hace que las imágenes sean menos sensibles a los artefactos derivados del movimiento o degradación de la muestra, y 2) una excelente relación señal-ruido (SNR). Además, SRS exhibe un espectro idéntico al Raman espontáneo, y la señal SRS es linealmente proporcional a la concentración del enlace químico excitado1,2,3,4, 5.
En nuestro microscopio, una configuración experimental femtosegundo (fs) SRS se integra con un microscopio óptico invertido equipado con una unidad de escaneo de espejos rápidos (Figura 1)6,7,8. Se utilizan dos fuentes láser pulsadas para implementar este microscopio. El primero es un fs-Ti:Sa con una duración de pulso de aproximadamente 140 fs, tasa de repetición de 80 MHz, y longitudes de onda de emisión en el rango de 680-1080 nm. El segundo, utilizado como haz de sonda y bombeado por Ti:Sa, es un oscilador paramétrico óptico sincronizado femtosegundo (SOPO), con una duración de pulso de aproximadamente 200 fs, tasa de repetición de 80 MHz y longitudes de onda de emisión en el rango de 1000-1600 nm. Cabe señalar que la diferencia mínima de energía fotónica entre el haz Ti:Sa y SOPO es de 2500 cm-1. Por lo tanto, utilizando esta combinación de sistemas láser, sólo la región C-H de alta frecuencia (2800-3200 cm-1) de espectros Raman se puede explorar6,7,8.
Con el fin de crear un microscopio SRS, hay tres cuestiones cruciales a considerar, que se describen en los párrafos sucesivos. El primero es la implementación de un método de transferencia de modulación de alta frecuencia (véase el cuadro 2 y el paso 2.1 del protocolo para una descripción). En una investigación experimental SRS, un parámetro crucial es la sensibilidad del sistema. Una señal SRS se detecta como un pequeño cambio en la intensidad de los haces de excitación; por lo tanto, puede ser corrompido por el ruido de intensidad del láser y el ruido de disparo. Este problema se puede superar integrando este sistema con un método de transferencia de modulación de alta frecuencia (véase el cuadro 2 y el paso 2.1 del protocolo para más detalles). En este método, se utiliza un modulador electroóptico (EOM) para modular la bomba. La modulación transferida al haz de la sonda puede ser detectada por un PD después de bloquear el haz de la bomba con una pila de filtros ópticos [modo de detección de ganancia Raman estimulada (SRG)]. La salida PD está conectada por un filtro de paso bajo a un amplificador de bloqueo (LIA), que demodula la señal medida. Al aumentar la frecuencia de modulación del haz a frecuencias superiores a 1 MHz, se puede obtener el límite intrínseco de los PD.
La segunda cuestión a considerar es la instalación de un soporte mecánico que permite llevar a cabo la detección hacia adelante y al mismo tiempo para preservar la observación del microscopio en el campo brillante. Además, tiene que reducir el ruido debido a la vibración mecánica durante la generación de imágenes y permitir el reposicionamiento preciso del sistema de detección (ver Figura 3 y paso 2.2 del protocolo).
La tercera es la sincronización de la señal adquirida por el esquema de detección sensible a la fase, con el haz colocado en la muestra monitoreado por el cabezal de exploración del microscopio. Para realizar imágenes, los SM requieren tres señales TTL que están disponibles por el controlador del microscopio conectado a la unidad principal de escaneo: reloj de píxeles, sincronización de línea y sincronización de fotogramas. La sincronización se logra mediante el control mediante una tarjeta PCI, las tres señales TTLy la adquisición de una señal de tensión en el canal de salida de LIA 6,7,8. Un software casero ha sido desarrollado y descrito previamente6,7,8, mientras que el hardware del sistema de sincronización se informa en la Figura 4.
Un procedimiento fundamental al llevar a cabo imágenes SRS es la alineación del microscopio. Se realiza en el transcurso de cuatro pasos, que se describen en los párrafos sucesivos. La primera es la superposición espacial de dos haces (véase el paso 3.1 del protocolo). En esta configuración experimental, las dos vigas fueron colinealmente combinadas espacialmente por un espejo dicroico. El paso preliminar es la alineación de OPO y Ti:Sa para que cada uno llegue al microscopio. A continuación, considerando oPO como un haz de referencia y aprovechando un detector sensible a la posición, el Ti:Sa se superpone espacialmente a OPO.
El segundo aspecto crucial es la superposición temporal de dos haces (véase el paso 3.2 del protocolo). Incluso si la bomba y los haces OPO están perfectamente sincronizados9,ya que siguen caminos de haz ligeramente diferentes dentro de la carcasa de OPO, en la salida de OPO tienen un retraso de tiempo de aproximadamente 5 ns y diferencia espacial de 5 cm. Por lo tanto, Ti:Sa y OPO requieren ser re-cronometrados ópticamente para asegurar la superposición temporal en la muestra. Esto se logra típicamente con una línea de retardo óptica finamente ajustable, que en este caso se inserta entre el Ti:Sa y el microscopio (véase la figura 1). Para obtener la superposición temporal de dos vigas, se utilizan dos técnicas. El primero se lleva a cabo utilizando un PD rápido y un osciloscopio, mientras que el segundo se basa en correlaciones auto ópticas y cruzadas. Utilizando la primera técnica, se obtiene una superposición aproximada de dos vigas (incertidumbre de 10 ps), mientras que una superposición temporal precisa de dos vigas se obtiene utilizando un correlator cruzado (resolución de 1 fs).
El tercer aspecto crucial es la alineación de las dos vigas dentro del microscopio (ver paso 3.3 del protocolo). Una observación preliminar de la luz blanca de la muestra permite individuate el campo de visión deseado (FOV). Después, los rayos láser, que entran en el microscopio por un puerto lateral del microscopio, se alinean para alcanzar el PD montado en la parte superior (Figura3). Sin embargo, para una adquisición correcta de la imagen, es necesario establecer una serie de parámetros (por ejemplo, la dimensión de píxel y el tiempo de permanencia del píxel). La frecuencia de muestreo debe respetar la restricción impuesta por el teorema de Nyquist para preservar toda la información de una imagen, mientras que para una correspondencia correcta entre las coordenadas espaciales de píxeles y el valor SRS medido en cada píxel, el tiempo de integración de LIA debe ser igual o comparable al tiempo de permanencia del píxel.
En el paso final de la alineación del microscopio, se llevan a cabo numerosas pruebas para optimizar la alineación espacial y temporal (ver paso 3.4 del protocolo). Se adquieren varias imágenes de transmisión (TI) para Ti:Sa y OPO para optimizar la superposición espacial. En una TI, se utiliza un solo haz, y la intensidad del haz transmitido de la muestra se mide mediante un PD. En el caso de TI realizado por OPO, la señal de salida PD está conectada directamente a la tarjeta PCI, mientras que en el caso de TI realizada por Ti:Sa, la señal de salida PD está conectada a LIA y la salida analógica de LIA está conectada a la tarjeta PCI. Las imágenes de transmisión son muy útiles para optimizar el FOV, la iluminación, la posición focal de los objetivos del microscopio y para comprobar si los dos haces están superpuestos espacialmente6,7,8.
La optimización de la superposición temporal de la bomba y del haz de la sonda se obtiene escaneando la línea de retardo con pasos de 0,001 mm correspondientes a un cambio de tiempo de 3,3 fs y realizando una medición SRS en un único punto de una muestra de perlas de poliestireno de 3 m de diámetro. La amplitud de una señal SRS mide los valores de LIA, en función del retardo de la sonda-bomba, y proporciona un máximo correspondiente a la superposición temporal exacta de los dos haces6,7,8. Antes de concluir, cabe señalar que todos los pasos discutidos son obligatorios para obtener una imagen de alta calidad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) utiliza luz de excitación infrarroja cercana; por lo tanto, comparte muchas propiedades de imágenes microscópicas multifono. La modalidad de imagen SRS se puede obtener utilizando microscopios comerciales de exploración láser equipando con un detector de avance no desescaneado con filtros de paso de banda adecuados y un esquema de detección de amplificador de bloqueo (LIA). Un diseño esquemático de un microscopio SRS típico incluye lo siguiente: dos rayos láser pulsados, (es decir, la bomba y la sonda dirigidas en un microscopio de escaneo), que deben superponerse tanto en el espacio como en el tiempo en el plano de la imagen, y luego enfocarse mediante un objetivo de microscopio la muestra a través de dos espejos de exploración (SM), que rasterizan el punto focal a través de un plano x-y. Después de la interacción con la muestra, los pulsos de salida transmitidos son recogidos por un objetivo superior y medidos por un sistema de detección hacia adelante insertado en un microscopio invertido. Los pulsos de la bomba se eliminan mediante una pila de filtros ópticos, mientras que los pulsos de la sonda que son el resultado del proceso SRS que se produce en el volumen focal de la muestra se miden mediante un fotodiodo (PD). La lectura de los datos sobre el rendimiento es demodulada por la LIA para extraer la profundidad de modulación. Se obtiene una imagen bidimensional (2D) sincronizando la unidad de detección directa con la unidad de escaneo del microscopio. En este artículo, se describe y demuestra con éxito la implementación de un microscopio SRS, así como la notificación de imágenes sin etiquetas de perlas de poliestireno con diámetros de 3 m. Vale la pena señalar que los microscopios SRS no están disponibles comercialmente, por lo que para aprovechar estas características, la construcción casera es la única opción. Dado que la microscopía SRS se está volviendo popular en muchos campos, se cree que esta descripción cuidadosa de la implementación del microscopio SRS puede ser muy útil para la comunidad científica.

En la Figura 7se indica un ejemplo de medición SRS (es decir, medición SRS en un único punto de la muestra). Cuando las vigas no se superponen en el tiempo o el espacio, el resultado obtenido se indica en la Figura 8a. En la baja resonancia, la amplitud de la señal medida por LIA es cero, mientras que la fase de la señal medida por LIA salta entre los valores negativos y positivos. Mientras que, cuando las vigas se superponen en el espacio, moviendo ...

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Implementación de un microscopio no lineal basado en la dispersión estimulada de Raman

En este manuscrito, se describe la implementación de un microscopio de dispersión Raman (SRS) estimulado, obtenido mediante la integración de una configuración experimental SRS con un microscopio de escaneo láser. El microscopio SRS se basa en dos fuentes láser de femtosegundo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) y un oscilador paramétrico óptico sincronizado (OPO).

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Este protocolo puede ayudar a los científicos interesados en la microscopía no lineal a comprender los componentes clave, la configuración y el procedimiento de alineación de un microscopio basado en la dispersión estimulada de Raman. Las principales ventajas de la microscopía SRS son sus capacidades para realizar imágenes sin etiquetas basadas en contraste vibratorio y adquirir una imagen en pocos segundos. La microscopía SRS ha llevado las imágenes sin etiquetas a nuevas alturas, especialmente estudios de estructuras biológicas complejas como los lípidos, que son fundamentales para las células y la arquitectura celular.La señal SRS se detecta como un pequeño cambio en la intensidad del haz de la sonda y puede ser corrompida por el ruido. Por lo tanto, un signo preciso es crucial. Para empezar, alinee el OPO y los rayos láser de zafiro de titanio para que ambos lleguen al microscopio.A continuación, coloque los detectores del sensor de posición del rayo láser en dos posiciones entre el espejo dicroico uno y el espejo seis. La primera posición se encuentra cerca del espejo dicroico uno y la segunda está cerca del espejo seis. Para cada posición, utilice los sensores para detectar las coordenadas X e Y del haz OPO.Es importante destacar que las coordenadas X e Y del rayo láser de zafiro de titanio son del mismo OPO en ambas posiciones de los detectores del sensor. Si, en algunas posiciones, las coordenadas no coinciden, ajuste la inclinación del espejo adyacente para compensar. Siga este mismo procedimiento para alinear las posiciones de la viga de titanio-zafiro con respecto a OPO para el trayecto entre los seis y siete del espejo.Instale un espejo adicional en un soporte flip-flop entre el espejo seis y siete y voltee el soporte del espejo para dirigir la viga al autocorrelador. Encienda el controlador de autocorrelator, inicie la aplicación de software en el ordenador que lo controla y ajuste el tornillo de ajuste de distancia de haz del autocorrelador a su posición normal en 8,35 milímetros. A continuación, detenga la viga de zafiro titanio y suelte y proyecte el haz OPO desde el espejo adicional hasta el espejo de entrada del autocorrelador.Intente ajustar el espejo de entrada para maximizar la señal de pulso láser como se muestra aquí. A continuación, detenga la viga OPO y suelte y proyecte el haz de zafiro de titanio desde el espejo montado en el chancla hasta el espejo de entrada y en el autocorrelador. Repita el ajuste óptimo del haz hasta que se obtenga la señal de autocorrelador, que se muestra aquí.Ahora, ajuste el tornillo de ajuste de distancia de la viga a la posición cruzada en 7,30 milímetros. Suelte ambas vigas y escanee la línea retardada para superponer las dos vigas. Obtenga la señal del correlator cruzado resultante, como se muestra aquí.A continuación, voltee el espejo montado en la chancla para que los haces alcancen el espejo siete y el cabezal de escaneo del microscopio. Retire el condensador y utilice el botón de escape para retirar temporalmente la lente subjetiva 60x. A continuación, gire la boquilla para mover la lente subjetiva 60x fuera de la trayectoria óptica.A continuación, monte el detector en la parte superior del microscopio utilizando el soporte mecánico externo. Conecte la salida del detector a través de un filtro de paso bajo de 50 ohmios a un osciloscopio. Ahora, encienda el procesador que controla el cabezal del escáner y proyecte el haz OPO en la cabeza del escáner del microscopio.Supervise la señal OPO y maximice la potencia medida por el detector utilizando un traductor XY. A continuación, cambie el haz del láser OPO al láser de zafiro de titanio y verifique que también se obtenga una señal para el láser de zafiro de titanio. Esto indica que ambas vigas están bien alineadas.Finalice la alineación del haz girando hacia atrás la boquilla para introducir la subjetiva de 60x. A continuación, utilice el botón de reenfoque en el microscopio para recuperar el enfoque finalizado a la lente objetivo del microscopio 60x. Finalmente, coloque el objetivo, con un aumento de 40x, en lugar del condensador sin tocar ni alterar la muestra.Ajuste la potencia de los láseres Titanium-sapphire y OPO medidos antes del microscopio a 30 milivatios para ambos haces. A continuación, establezca la longitud de onda del láser OPO en un valor diferente, con respecto al anterior, de modo que la bomba y la sonda no estén en resonancia con la frecuencia vibratoria de las perlas. A continuación, suelte ambos haces, de modo que entren en el microscopio.Ejecute el traductor computarizado de la línea de retardo de escaneado y registre la intensidad medida utilizando el amplificador de bloqueo para cada posición de la línea de retardo. Espere hasta que se complete el escaneo de la línea de retardo. Ahora, establezca la longitud de onda del OPO de nuevo en 1076 nanómetros, de modo que la bomba y la sonda estén en resonancia con la frecuencia vibratoria de las perlas.Ejecute el traductor computarizado de la línea de retardo de análisis y espere hasta que se complete el análisis de la línea de retardo. Por último, establezca la posición de haz superpuesta obtenida y la línea de retardo para la próxima adquisición de imágenes de dispersión Raman estimuladas. Para optimizar la sincronización espacial de las vigas, comience por detener el haz de zafiro de titanio y reducir la potencia de OPO a ocho milivatios.A continuación, conecte la lectura del detector a la tarjeta de adquisición de datos. Ejecute el programa de adquisición de datos junto con la consola de escaneo del microscopio. Cuando haya terminado, guarde el archivo y procese los datos para obtener una imagen como la que se muestra aquí.A continuación, detenga el haz OPO y reduzca la potencia de zafiro de titanio a 2,5 a 4,5 milivatios. Conecte el detector con el amplificador de bloqueo y sus lecturas con la tarjeta de adquisición de datos. A continuación, vuelva a ejecutar el programa de adquisición de datos junto con la consola de escaneo del microscopio.Cuando haya terminado, guarde el archivo y procese los datos para obtener una imagen como la que se muestra aquí. Introducir una pila de filtros entre el objetivo 40x y el fotodiodo para eliminar los pulsos de la bomba y adquirir sólo la señal de stoke. A continuación, ajuste la señal de la bomba a 810 nanómetros con una potencia focalizada de ocho milivatios.Establezca la señal de la sonda en 1076 nanómetros con la misma potencia focalizada de ocho milivatios para investigar un enlace típico carbono-hidrógeno de poliestireno con un desplazamiento Raman de 3054 centímetros inversos. Conecte el detector con el amplificador de bloqueo y la lectura del amplificador de bloqueo a la tarjeta de adquisición de datos. Por último, establezca el formato de píxel y el tiempo de adquisición en el programa de microscopio y ejecútelo y el sistema de adquisición de datos, guardando el archivo de matriz una vez que se haya completado.Aquí se muestra una medida de ejemplo desde un único punto de la muestra. Cuando el haz no se solapa en tiempo o espacio, el resultado obtenido es fuera de resonancia, donde la amplitud de la señal, medida por un amplificador de bloqueo, es cero. La fase de esta señal, sin embargo, salta entre valores negativos y positivos.Si las vigas se superponen en el espacio, la señal aumenta y alcanza su máximo cuando las vigas están perfectamente superpuestas en el tiempo, mientras que la fase comienza a alcanzar un valor fijo durante el tiempo en el que las vigas se superponen. En una imagen de transmisión, se utiliza un solo haz y la intensidad del haz transmitido de la muestra se mide mediante un fotodiodo. A la izquierda, la imagen de transmisión se obtuvo utilizando OPO, mientras que a la derecha, la imagen de transmisión se obtuvo utilizando titanio-zafiro.Aquí se muestra un ejemplo típico de una imagen SRS, en el que se informan imágenes sin etiquetas de perlas de poliestireno con diámetros de tres micrómetros. Para obtener una imagen de alta calidad, basada en la microscopía SRS, la alineación de un microscopio es fundamental. Por lo tanto, todos los pasos indicados en el protocolo deben llevarse a cabo cuidadosamente.

Research

JoVE Journal

Engineering

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

Implementación de un interferómetro de referencia para Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Investigación

Ingeniería

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Coherent anti-Stokes Raman Scattering CARS Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopía visualiza Tablets Farmacéuticos durante la disolución

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

La medición de la dispersión no linealidades de una nanopartícula Individual plasmónicas

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Automation of Mode Locking in a Nonlinear Polarization Rotation Fiber Laser through Output Polarization Measurements

Automatización de modo de bloqueo de rotación en un láser de fibra no lineal de polarización a través de mediciones de polarización de salida

When a laser is mode-locked, it emits a train of ultra-short pulses at a repetition rate determined by the laser cavity length. This article outlines a ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

Estimulada Stokes y Antistokes Raman Scattering en microesférico Whispering Gallery Mode resonadores

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Metodología basada en el perfilador de dispersión de luz de barrido (SLPS) para evaluar cuantitativamente la dispersión de luz hacia delante y hacia atrás desde lentes intraoculares

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

Espectrómetro de dispersión de Brillouin estimulada onda continua alta velocidad para análisis de materiales

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

Experimental Implementation of a New Composite Fabrication Method: Exposing Bare Fibers on the Composite Surface by the Soft Layer Method

Implementación experimental de un nuevo método de fabricación compuesto: exponer desnudas fibras en la superficie del compuesto por el método de capa suave

The bipolar plate is a key component in proton exchange membrane fuel cells (PEMFCs) and vanadium redox flow batteries (VRFBs). It is a multi-functional ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

Demostración de un microscopio integrado de Hyperlens y proyección de imagen de súper resolución

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Predicting Catalyst Extrudate Breakage Based on the Modulus of Rupture

Rotura de extrusión de catalizador predicción basada en el módulo de ruptura

The mechanical strength of extruded catalysts and their natural or forced breakage by either collision against a surface or by a compressive load in a ...