Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Vi uppskattar V. Tufano från IMM CNR för hans värdefulla teknisk assistans och Giacomo Cozzi, produktspecialist från Nikon Instruments, för användbara diskussioner och kontinuerligt stöd. Detta arbete stöddes delvis av italienska nationella operativa program PONa3 00025 (BIOforIU) och av euro-bioimaging storskaliga paneuropeiska forskningsinfrastruktur projekt.

1. Starta Lasersystemet
<ol><li>Kontrollera om temperaturen på kylaggregat bibehålls vid eller under 20 ° c.</li>
	<li>Kontrollera om fuktkontroll enheten fungerar korrekt och luftfuktigheten bibehålls till ett värde runt 40%.</li>
	<li>Slå på TI: sa laser, strikt följa instruktionerna i manualen.</li>
	<li>Ställ in våglängden till 810 nm.</li>
	<li>Slå på OPO och den anslutna minidatorn. Kör programmet som styr OPO-lasern.</li>
	<li>Välj bypass om 100% av TI: sa-laserutdata krävs vid u...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy:+a+tutorial.">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).</li><li>Camp, C. H., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators.">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li><li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology.">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li><li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets:+Size+matters.">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li><li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells:+size+and+optical+density+distribution.">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li><li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage.">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li><li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+distribution+in+living+cells:+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog.">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li><li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples.">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li><li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells:+A+precautionary+note.">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging:+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes.">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li><li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser.">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography.">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117 (2017).</li><li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

SRS mikroskopi har tagit etikett-fri avbildning till nya höjder, särskilt i studier av komplexa biologiska strukturer såsom lipider, som är grundläggande för celler och cellulära arkitektur. Lipider är involverade i flera fysiologiska vägar såsom produktion av biologiska membran, och de fungerar som biosyntetiska prekursorer och signaltransducers10. Lipider är förpackade i specialiserade intracellulära organeller, även kallad lipid droppar (LDs). Deras diameter varierar från några ...

I Life Science-tillämpningar har SRS mikroskopi vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för etikettfri avbildning. Den grundläggande idén om SRS mikroskopi är att kombinera styrkan i vibrations kontrast och dess förmåga att förvärva bilder på några sekunder.
SRS är en process där frekvens skillnaden mellan två laserstrålar frekvenser (pump signal och Stokes signal vid olika frekvenser) matchar molekylära vibrationer i ett undersökt prov, orsakar stimulerad Raman spridning och en betydande ökning av Stokes-signalen. Till skillnad från linjär Raman-spektroskopi uppvisar SRS ett ickelinjär beroende av de inkommande ljus fälten och producerar sammanhängande strålning. SRS har två grundläggande fördelar: 1) hastighet, vilket gör bilder mindre känsliga för artefakter som härrör från provet rörelse eller nedbrytning, och 2) en utmärkt signal-brus-förhållande (SNR). Dessutom uppvisar SRS ett spektrum som är identisk med den spontana Raman, och SRS signalen är linjärt proportionell mot koncentrationen av den kemiska Bond upphetsad1,2,3,4, 5.
I vårt Mikroskop, en femtosecondlaser (FS) SRS experimentella set-up är integrerat med ett inverterat optiskt mikroskop utrustad med en snabb speglar skanning enhet (figur 1)6,7,8. Två pulsade laserkällor används för att implementera detta Mikroskop. Den första är en FS-TI: sa med en puls varaktighet på cirka 140 FS, repetitionshastighet på 80 MHz, och emissions våglängder i intervallet 680-1080 nm. Den andra, som används som sond balk och pumpas av TI: sa, är en femtosecondlaser synkroniserad optisk parametriska oscillator (SOPO), med en puls varaktighet på cirka 200 FS, repetitionshastighet på 80 MHz, och utsläpp våglängder i intervallet 1000-1600 nm. Det bör noteras att minsta fotons energi skillnad mellan TI: sa och SOPO beam är 2500 cm-1. Därför, med hjälp av denna kombination av lasersystem, endast den höga frekvensen C-H-regionen (2800-3200 cm-1) av Raman spectra kan utforskas6,7,8.
För att inrätta ett SRS-Mikroskop finns det tre viktiga frågor att beakta, vilka beskrivs i de efterföljande styckena. Den första är genomförandet av en hög frekvensmodulering överföringsmetod (se figur 2 och steg 2,1 i protokollet för en beskrivning). I en SRS experimentell undersökning, är en avgörande parameter känsligheten i systemet. En SRS signal detekteras som en liten förändring i intensiteten av excitation balkar; Därför kan det skadas av laser intensitet buller och skott buller. Denna fråga kan lösas genom att integrera detta system med en hög frekvensmodulering överföringsmetod (se figur 2 och steg 2,1 i protokollet för mer information). I denna metod används en elektrooptisk modulator (EOM) för att modulera pumpen. Den modulering som överförs till sond strålen kan sedan detekteras av en PD efter att ha blockerat pump strålen med en bunt optiska filter [stimulerad Raman Gain (SRG) detektions läge]. PD-utgången ansluts med ett lågpassfilter till en lock-in-förstärkare (LIA), som demodulerar den uppmätta signalen. Genom att öka strålens modulerings frekvens till frekvenser över 1 MHz kan den inneboende gränsen för PDs erhållas.
Den andra frågan att ta hänsyn till är installationen av ett mekaniskt fäste som medger att man utför framåtriktad detektering och samtidigt bevarar Mikroskop observation i brightfield. Dessutom måste det minska bullret på grund av mekaniska vibrationer under generering av bilder och för att möjliggöra exakt omplacering av detekterings systemet (se figur 3 och steg 2,2 i protokollet).
Den tredje är synkroniseringen av den signal som förvärvas av fas-känsligt detektions schema, med strålen placerad på provet övervakas av Scan huvudet av mikroskopet. För att förverkliga bilder kräver SMs tre TTL-signaler som görs tillgängliga av Mikroskop styrenheten ansluten till Scan Head enhet: Pixel Clock, Line Sync och Frame Sync. Synkroniseringen uppnås genom att kontrollera med hjälp av ett PCI-kort, de tre TTL-signalerna, och förvärvet av en spänningssignal på utgångskanalen av Lia6,7,8. En hemlagad programvara har utvecklats och beskrivits tidigare6,7,8, medan hårdvaran i synkroniseringssystemet rapporteras i figur 4.
En grundläggande procedur vid utförandet av SRS Imaging är Mikroskop justering. Det realiseras under loppet av fyra steg, som beskrivs i de efterföljande styckena. Den första är den rumsliga överlappningen av två balkar (se steg 3,1 i protokollet). I denna experimentella uppsättning, de två balkar var rumsligt collinearly kombineras med en Dichroic spegel. Det preliminära steget är anpassningen av OPO och TI: sa så att varje når mikroskopet. Sedan, med tanke på OPO som referens balk och dra nytta av en position känslig detektor, TI: sa är rumsligt överlappade till OPO.
Den andra avgörande aspekten är den temporala överlappningen av två balkar (se steg 3,2 i protokollet). Även om pumpen och OPO balkar är perfekt synkroniserade9, eftersom de följer något olika balk stigar inne i OPO bostäder, vid OPO Exit de har en tidsfördröjning på ca 5 ns och rumslig skillnad på 5 cm. Därför, TI: sa och OPO kräver att tidsinställda optiskt för att säkerställa temporala överlappning på provet. Detta är vanligtvis åstadkommas med en fint avstämbara optisk fördröjning linje, som i detta fall infogas mellan TI: sa och Mikroskop (se figur 1). För att erhålla den temporal överlappningen av två strålar, används två tekniker. Den första utförs med hjälp av en snabb PD och oscilloskop, medan den andra är baserad på Auto-och Cross-optiska korrelationer. Med den första tekniken erhålls en grov överlappning av två balkar (osäkerhet på 10 PS), medan en exakt temporala överlappning av två balkar erhålls med hjälp av en cross-correlator (upplösning av 1 FS).
Den tredje avgörande aspekten är anpassningen av de två strålarna inuti mikroskopet (se steg 3,3 i protokollet). Ett preliminärt vitt ljus observation av provet gör det möjligt att individuera önskat synfält (FOV). Efteråt, laserstrålar, in i mikroskopet med en sido port av Mikroskop, är inriktade för att nå PD monterad på den övre delen (figur 3). För en korrekt Bildinsamling krävs dock att ange ett antal parametrar (till exempel pixel dimension och pixel Dwell Time). Provtagningsfrekvensen måste respektera den begränsning som införts av Nyquists sats för att bevara all information i en bild, medan för en korrekt korrespondens mellan de rumsliga koordinaterna för pixlar och SRS-värde mätt i varje pixel, integrationstiden av LIA bör vara lika med eller jämförbar med pixel Dwell-tiden.
I det sista steget av Mikroskop anpassningen, många tester utförs för att optimera den rumsliga och tidsmässiga anpassningen (se steg 3,4 i protokollet). Ett antal transmissions bilder (TI) för både TI: sa och OPO förvärvas för att optimera rumslig överlappning. I en TI används en enda stråle och den överförda strålens intensitet från provet mäts med en PD. När det gäller TI realiseras av OPO, PD utsignalen är direkt ansluten till PCI-kort, medan det i fallet med TI realiseras av TI: sa, är PD utsignalen ansluten till LIA och analog utgång av LIA är ansluten till PCI-kort. Överföringen bilder är mycket användbara för att optimera FOV, belysningen, fokuspositionen för Mikroskop mål och att kontrollera om de två balkar är rumsligt överlappade6,7,8.
Optimeringen av pumpen och sond strålens temporala överlappning erhålls genom att skanna fördröjningen linje med steg om 0,001 mm som motsvarar en 3,3 FS tidsförskjutning och utföra en SRS mätning i en enda punkt i en polystyren pärla prov 3 μm i diameter. Amplituden av en SRS signal mäter värden från Lia, som en funktion av sonden-pump fördröjning, och ger en maximal motsvarande med exakt temporala överlappning av de två balkar6,7,8. Innan du avslutar bör det noteras att alla diskuterade steg är obligatoriska för att få en bild av hög kvalitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

Stimulerad Raman spridning (SRS) mikroskopi använder nästan infraröd excitation ljus; Därför, det delar många multi-Photon mikroskopiska Imaging egenskaper. SRS Imaging modalitet kan erhållas med kommersiella laserscanning Mikroskop genom att utrusta med en icke-avskurna framåt detektor med rätt bandpass filter och lock-in förstärkare (Lia) detekterings schema. En Schematisk layout av ett typiskt SRS Mikroskop omfattar följande: två pulsade laserstrålar, (dvs. pumpen och sonden riktad i ett scanning Mikroskop), som måste överlappas i både tid och rum på bildplanet, sedan fokuserat med ett Mikroskop mål i provet genom två scanning speglar (SMs), som raster brännpunkten över ett x-y-plan. Efter interaktion med provet samlas överförda utflödes pulser upp av ett övre mål och mäts med ett framåtdetekterings system insatt i ett inverterat Mikroskop. Pump pulser avlägsnas med en bunt optiska filter, medan sonden pulser som är resultatet av SRS-processen som inträffar i brännvidden av preparatet mäts med en fotodiod (PD). Den avläsning av PD är demodulerade av Lia att extrahera moduleringsdjupet. En tvådimensionell (2D) bild erhålls genom att synkronisera den främre detekterings enheten med Mikroskop skannings enheten. I det här dokumentet beskrivs och demonstreras implementeringen av ett SRS-Mikroskop, liksom rapporteringen av etikettfria bilder av polystyren-pärlor med en diameter på 3 μm. Det är värt att notera att SRS Mikroskop inte är kommersiellt tillgängliga, så för att kunna dra nytta av dessa egenskaper, är den hemgjorda konstruktionen det enda alternativet. Eftersom SRS mikroskopi blir populär på många områden, man tror att denna noggranna Beskrivning av SRS Mikroskop genomförandet kan vara mycket användbart för det vetenskapliga samfundet.

Ett exempel på SRS-mätning (dvs. SRS-mätning i en enda punkt i provet) rapporteras i figur 7. När balkarna inte överlappar varandra i tid eller rum rapporteras det erhållna resultatet i figur 8a. I off-resonans, amplituden av signalen mätt med LIA är noll, medan fasen av signalen mätt med LIA hoppar mellan negativa och positiva värden. När balkarna överlappar varandra i rymden och flyttar fördröjnings linjen i ett lämpligt område rapporter...

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Implementering av ett ickelinjärt Mikroskop baserat på stimulerad Raman-spridning

I detta manuskript beskrivs implementeringen av en stimulerad Raman spridning (SRS) Mikroskop, som erhållits genom integration av en SRS experimentell uppsättning med ett Laser scanning Mikroskop. SRS-mikroskopet är baserat på två femtosecondlaser (FS) laserkällor, en TI-Sapphire (TI: sa) och synkroniserad optisk parametrisk oscillator (OPO).

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Detta protokoll kan hjälpa forskare som är intresserade av olinjär mikroskopi för att förstå de viktigaste komponenterna, inrättandet, och anpassningen förfarandet för ett mikroskop baserat på stimulerad Raman spridning. De viktigaste fördelarna med SRS mikroskopi är dess förmåga att utföra etikettfri bildbehandling baserad på vibrationskontrast och att skaffa en bild på några sekunder. SRS mikroskopi har tagit etikettfri bildbehandling till nya höjder särskilt studier av komplexa biologiska strukturer såsom lipider, som är grundläggande för celler och cellulär arkitektur.SRS-signalen detekteras som en liten förändring i sondstrålens intensitet och den kan skadas av brus. Därför är ett korrekt tecken avgörande. Till att börja med rikta OPO och Titanium-safir laserstrålar så att de båda når mikroskopet.Därefter placerar laserstrålens lägesgivares detektorer i två lägen mellan dikroisk spegel ett och spegel sex. Den första positionen är placerad nära dikroisk spegel en och den andra är nära spegel sex. För varje position, använd sensorerna för att detektera OPO-strålens X- och Y-koordinater.Viktigt, kontrollera att X och Y koordinaterna för Titan-safir laserstrålen är av samma OPO i båda positionerna av sensorns detektorer. Om, i vissa positioner, de koordinater som inte sammanfaller, stämma lutningen på den intilliggande spegeln för att kompensera. Följ samma förfarande för att anpassa Titan-safir beam positioner med avseende på OPO för vägen i-mellan spegelns sex och sju.Installera en extra spegel på en flip-flop mount i-mellan spegel sex och sju och vänd fästet på spegeln för att rikta strålen i autokorrigeringsapparaten. Ström på autokorrelator-styrenheten, starta programapplikationen på datorn som styr den och ställ in autokoratorns skruv för strålavståndsjustering till dess normala position vid 8,35 millimeter. Sedan, stoppa Titan-safir stråle och släpp och projekt OPO strålen från den extra spegeln till ingången spegel av autocorrelator.Försök att justera ingångsspegeln för att maximera laserpulssignalen som visas här. Därefter stoppar du OPO-strålen och släpper och projicera Titan-safirstrålen från flip-flop monterad spegel till ingångsspegeln och in i autokorrigeringsapparaten. Upprepa den optimala stråljusteringen tills autokorrigeringssignalen, som visas här, erhålls.Ställ nu in bomavståndsjusteringsskruven på tvärläget på 7,30 millimeter. Släpp båda balkarna och skanna den fördröjda linjen för att överlappa de två balkarna. Erhåll resulterande korskorrelersignal, som visas här.Vänd sedan flip-flop monterad spegel så att balkarna kan nå spegel sju och skanning huvudet av mikroskopet. Ta bort kondensorn och använd escape-knappen för att tillfälligt dra tillbaka den subjektiva linsen på 60x. Rotera sedan nos-bit för att flytta 60x subjektiva linsen utanför den optiska vägen.Därefter monterar du detektorn till den övre delen av mikroskopet med hjälp av det yttre mekaniska fästet. Anslut detektorns utgång genom ett 50 Ohm Low Pass Filter till ett oscilloskop. Nu, slå på processorn som styr skannerhuvudet och projicera OPO-strålen i skannerhuvudet på mikroskopet.Övervaka OPO-signalen och maximera effekten som mäts av detektorn med hjälp av en XY-översättare. Sedan, växla strålen från OPO laser till Titanium-safir laser och kontrollera att en signal också erhålls för Titan-safir laser. Detta indikerar att båda balkarna är väl inriktade.Slutställ strålen anpassningen genom att rotera tillbaka nos-bit för att införa 60x subjektiva. Använd sedan omfokuseringsknappen på mikroskopet för att återfå det slutna fokuset till objektivobjektivet 60x-mikroskop. Slutligen, placera målet, med en förstoring av 40x, i stället för kondensorn utan att röra eller störa provet.Ställ in kraften i Titan-safir och OPO-lasrar som uppmätts före mikroskopet till 30 milliwatt för båda balkarna. Ställ sedan in våglängden för OPO-lasern till ett annat värde, med avseende på den föregående, så att pumpen och sonden inte är i resonans med pärlornas vibrationsfrekvens. Därefter släpper båda balkarna, så att de kommer in i mikroskopet.Kör den datoriserade översättaren för skanningsfördröjningslinjen och registrera den uppmätta intensiteten med hjälp av inlåsningsförstärkaren för varje position på fördröjningslinjen. Vänta tills fördröjningsraden skanning är klar. Nu, ställ in våglängden för OPO tillbaka till 1076 nanometer, så att pumpen och sonden är i resonans med vibrationsfrekvens av pärlorna.Kör den datoriserade datoriserade översättaren för skanningsfördröjning och vänta tills fördröjningsraden skanning är klar. Ställ slutligen in erhållna överlappningsstrålens position och fördröjningslinjen för nästa förvärv av stimulerade Raman-spridningsbilder. För att optimera den rumsliga synkroniseringen av balkarna, börja med att stoppa Titan-safirstrålen, och minska OPO-kraften till åtta milliwatt.Därefter ansluter du detektorns avläsning till datainsamlingskortet. Kör datainsamlingsprogrammet tillsammans med mikroskopskanningskonsolen. När du är klar, spara filen och bearbeta data för att få en bild som den som visas här.Därefter stoppar du OPO-strålen och minskar Titan-safireffekten till 2,5 till 4,5 milliwatt. Anslut detektorn med inlåsningsförstärkaren och dess avläsningar med dataanskaffningskortet. Sedan, återigen köra datainsamlingsprogrammet tillsammans med mikroskop scanning konsolen.När du är klar, spara filen och bearbeta data för att få en bild som den som visas här. Introducera en stapel med filter i-mellan 40x objektivet och fotodioden för att ta bort pumpen pulser och förvärva endast stoke signal. Ställ sedan in pumpsignalen på 810 nanometer med en fokuserad effekt på åtta milliwatt.Ställ in sonden signal till 1076 nanometer med samma fokuserade effekt på åtta milliwatt att undersöka en typisk Carbon-Väte bindning av polystyren med en Raman förskjutning av 3054 invers centimeter. Anslut detektorn med inlåsningsförstärkaren och inlåsningsförstärkarens avläsning till dataanskaffningskortet. Slutligen, ställa in pixelformat och förvärvstid i mikroskop programmet och köra den och datainsamlingssystemet, vilket sparar matrisfilen när den är klar.Här visas en exempelmätning från en enda punkt i provet. När strålen inte överlappas i tid eller rum, är det erhållna resultatet av resonans, där amplituden av signal, mätt med en inlåsningsförstärkare, är noll. Fasen av denna signal, dock hoppar mellan negativa och positiva värden.Om strålarna överlappas i rymden ökar signalen och når sitt maximum när strålarna är perfekt överlappade i tiden, medan fasen börjar för att uppnå ett fast värde under den tid då balkarna överlappas. I en transmissionsbild används en enda stråle och den överförda strålintensiteten från provet mäts med en fotodiod. Till vänster erhölls transmissionsbilden med hjälp av OPO, medan till höger erhölls transmissionsbilden med hjälp av Titanium-sapphire.Ett typiskt exempel på en SRS-bild visas här, i vilken etikettfria bilder av polystyrenpärlor med diametrar på tre mikrometer rapporteras. För att få en högkvalitativ bild, baserad på SRS mikroskopi, är inriktningen av ett mikroskop kritisk. Därför måste alla indikerade steg i protokollet utföras noggrant.

Research

JoVE Journal

Engineering

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

Genomförande av en referens Interferometer för Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Coherent anti-Stokes Raman Scattering CARS Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Sammanhängande anti-Stokes Ramanspridning (CARS) Mikroskopi Visualiserar Pharmaceutical tabletter under upplösningen

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Mätning av Spridnings olinjäriteter från en enda plasmoniska nanopartiklar

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Automation of Mode Locking in a Nonlinear Polarization Rotation Fiber Laser through Output Polarization Measurements

Automatisering av Läge Låsning i en Nonlinear polariseringsrotation Fiber Laser genom utgångs Polarisering Mätningar

When a laser is mode-locked, it emits a train of ultra-short pulses at a repetition rate determined by the laser cavity length. This article outlines a ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

Stimulerad Stokes och Antistokes Raman Scattering i mikrosfäriska Whispering Gallery läge resonatorer

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) -baserad metodik för att kvantitativt utvärdera framåt och bakåtljusstrålning från intrakokulära linser

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

Höghastighets Continuous-wave stimuleras Brillouin spridning spektrometer för materialanalys

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

Experimental Implementation of a New Composite Fabrication Method: Exposing Bare Fibers on the Composite Surface by the Soft Layer Method

Experimentell genomförandet av en ny komposit Fabrication metod: utsätta Bare fibrer på sammansatta ytan av metoden mjuka lager

The bipolar plate is a key component in proton exchange membrane fuel cells (PEMFCs) and vanadium redox flow batteries (VRFBs). It is a multi-functional ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

Demonstration av en Hyperlens-integrerat Mikroskop och super-upplösning Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Predicting Catalyst Extrudate Breakage Based on the Modulus of Rupture

Att förutse katalysator Extrudate brott baserat på modulusen av brista

The mechanical strength of extruded catalysts and their natural or forced breakage by either collision against a surface or by a compressive load in a ...