Name: implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Değerli teknik yardımları için ıMM CNR 'dan V. Tufano 'Yu ve kullanışlı tartışmalar ve sürekli destek için Nikon Instruments 'ın ürün uzmanı Giacomo Cozzi 'i takdir ediyoruz. Bu çalışmanın kısmen Italyan Ulusal operatif programlar PONa3 00025 (BIOforIU) ve Euro-Bioımaging büyük ölçekli panEuropean araştırma altyapı projesi tarafından desteklenmektedir.

1. Lazer sistemini başlatma
<ol><li>Soğutucular sıcaklığının 20 °C ' de veya altında muhafaza edildiğini kontrol edin.</li>
	<li>Nem kontrol biriminin düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol edin ve nem% 40 civarında bir değere tutulur.</li>
	<li>Kılavuzundaki talimatları kesinlikle izleyerek Ti: sa lazerini açın.</li>
	<li>810 nm için dalga boyu ayarlayın.</li>
	<li>OPO ve bağlı mini bilgisayarı açın. OPO lazer denetleyen uygulamayı çalıştırın.</li>
	<li>Seçin bypass</st...

<ol>
	<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering.">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li><li>Alfonso-Garc&#237;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy:+a+tutorial.">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).</li><li>Camp, C. H., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering.">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li><li>D&#8217;Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques.">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).</li><li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics &amp; Materials. 26 (4), (2017).</li><li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope.">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).</li><li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators.">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li><li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology.">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li><li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets:+Size+matters.">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li><li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells:+size+and+optical+density+distribution.">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li><li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage.">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li><li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+distribution+in+living+cells:+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog.">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li><li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples.">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li><li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells:+A+precautionary+note.">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging:+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes.">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li><li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser.">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography.">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117 (2017).</li><li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy.">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).</li></ol>

SRS mikroskopisi, özellikle hücreler ve hücresel mimari için temel olan lipidler gibi kompleks biyolojik yapıların çalışmalarda, yeni yüksekliklere etiket içermeyen görüntüleme aldı. Lipidler biyolojik membranların üretimi gibi birden fazla fizyolojik yol içinde yer alan ve biyosentetik öncüleri ve sinyal Dönüştürücüsü olarak hizmet10. Lipidler, lipid damlacıkları (LDs) olarak da adlandırılan özel hücre içi organellere paketlenmiştir. Çapları birkaç onlarca na...

Yaşam bilimi uygulamalarında SRS mikroskobu, etiket içermeyen görüntüleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. SRS mikroskobu temel fikri vibrasyonel kontrast gücünü ve birkaç saniye içinde görüntü edinme yeteneğini birleştirmek için.
SRS, iki lazer ışınları frekansları arasındaki frekans farkının (farklı frekanslarda pompa sinyali ve Stokes sinyali) incelendiği bir numunenin moleküler titreşimi ile eşleştiğini, uyarılmış Raman saçılma ve önemli bir Stokes sinyalinde artış. Doğrusal Raman spektroskopisinin aksine SRS, gelen ışık alanlarına doğrusal olmayan bir bağımlılığı sergiler ve tutarlı radyasyon üretir. SRS 'nin iki temel avantajı vardır: 1) hız, hangi görüntüleri örnek hareket veya bozulma kaynaklanan eserler daha az duyarlı hale getirir, ve 2) mükemmel bir sinyal-gürültü oranı (SNR). Buna ek olarak, SRS spontan Raman ile özdeş bir spektrum sergiler ve SRS sinyal kimyasal Bond heyecanlı konsantrasyon ile doğrusal orantılı1,2,3,4, 5' i yapın.
Mikroskobu olarak, femtosaniye (FS) SRS deneysel ayarlama, hızlı aynalar tarama ünitesi (Şekil 1)6,7,8ile donatılmış, ters çevrilmiş bir optik mikroskop ile entegre edilmiştir. Bu mikroskop uygulamak için iki Pulse lazer kaynakları kullanılır. İlk bir FS-Ti: sa yaklaşık 140 FS nabız süresi ile, 80 MHz tekrarlama oranı ve 680-1080 nm aralığında emisyon dalga boyları. İkinci, prob ışını olarak kullanılan ve Ti: SA tarafından pompalanan, bir femtosaniye senkronize optik parametrik osilatör (Sopo), yaklaşık 200 FS nabız süresi ile, 80 MHz tekrarlama oranı, ve emisyon dalga boyları aralığında 1000-1600 Nm. Ti: SA ve SOPO ışını arasındaki asgari foton enerji farkının 2500 cm-1olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle, bu kombinasyonu kullanarak lazer sistemleri, sadece yüksek frekanslı C-H Bölgesi (2800-3200 cm-1) Raman Spectra keşfedilebilir6,7,8.
SRS mikroskop ayarlamak için, art arda paragraflarda açıklanan dikkate alınması gereken üç önemli sorunlar vardır. İlk yüksek frekanslı modülasyon transfer yönteminin uygulamasıdır (bkz. Şekil 2 ve adım 2,1 bir açıklama için protokol). SRS deneysel soruşturmada, önemli bir parametre sistemin hassasiyetidir. SRS sinyali, uyarma kirişlerinin yoğunluğunda küçük bir değişiklik olarak algılanır; Bu nedenle, lazer yoğunluğu gürültü ve atış gürültüsü ile bozulabilir. Bu sorun, bu sistemi yüksek frekanslı modülasyon aktarım yöntemiyle bütünleştirerek üstesinden gelebilir (bkz. Şekil 2 ve adım 2,1 Ayrıntılar için protokol). Bu yöntemle pompa modülatmek için bir elektro-optik Modulatör (EOM) kullanılır. Prob ışınına aktarılan modülasyon daha sonra bir PD tarafından optik filtreler yığını ile pompa ışını bloke sonra tespit edilebilir [Raman kazanç uyarılmış (SRG) algılama modu]. PD çıkışı, ölçülen sinyali demodüle eden bir kilit amplifikatörüne (LıA) düşük geçiş filtresine bağlanır. Işın modülasyon sıklığını 1 MHz 'in üzerindeki frekanslara artırarak, PDs 'nin içsel sınırı elde edilebilir.
İkinci konu göz önünde bulundurulması gereken ileri algılama yürütmek ve aynı zamanda Brightfield mikroskop gözlem korumak için izin mekanik bir montaj kurulumu. Ayrıca, görüntü üretimi sırasında mekanik titreşim nedeniyle gürültüyü azaltmak ve algılama sisteminin kesin yeniden konumlandırılmasına izin vermek gerekir (bkz. Şekil 3 ve protokol 2,2 adım).
Üçüncüsü, faz duyarlı algılama şeması tarafından alınan sinyalin senkronizasyon, mikroskobun tarama kafası tarafından izlenen örnek üzerine konumlandırılmış kiriş ile. Görüntüleri gerçekleştirmek için, SMs tarama kafası birimine bağlı mikroskop denetleyici tarafından kullanılabilir hale gelen üç TTL sinyalleri gerektirir: piksel saat, hat senkronizasyonu, ve çerçeve senkronizasyonu. Senkronizasyon, bir PCI kartı, üç TTL sinyalleri ve LIA6,7,8çıkış kanalında bir voltaj sinyalinin alınması kullanılarak kontrol edilerek elde edilir. Ev yapımı bir yazılım geliştirilmiş ve önceden açıklanan6,7,8, senkronizasyon sisteminin donanımı Şekil 4' te rapor edilirken.
SRS görüntüleme yapılırken temel bir prosedür mikroskop hizalaması. Bu, ardışık paragraflarda açıklanan dört adım boyunca gerçekleştirilir. İlk iki kiriş uzamsal çakışıyor (protokol adım 3,1 bakın). Bu deneysel ayarda, iki kiriş, dikrotik bir ayna ile birlikte dağınık bir şekilde birleşmiştir. Ön adım OPO ve TI: sa hizalaması, böylece her mikroskop ulaşır. Daha sonra, bir referans ışını olarak OPO göz önüne alındığında ve bir pozisyon duyarlı Dedektör yararlanarak, TI: sa dağınık OPO için örtüşmesi.
İkinci önemli yönü iki kiriş temporal çakışıyor (protokol adım 3,2 bakın). Onlar OPO konut içinde biraz farklı kiriş yolları takip beri pompa ve OPO kirişler mükemmel senkronize9, onlar yaklaşık 5 NS ve 5 cm uzamsal fark bir zaman GECIKMESI var OPO çıkışında bile. Bu nedenle, TI: SA ve OPO örnekteki geçici çakışmayı sağlamak için optik yeniden zamanlanmış gerektirir. Bu genellikle, bu durumda Ti: SA ve mikroskop arasında eklenen ince ayarlanabilir optik gecikme hattı ile gerçekleştirilir (bkz. Şekil 1). İki kiriş temporal çakışmayı elde etmek için iki teknik kullanılır. İlki hızlı PD ve osiloskop kullanılarak gerçekleştirilir, ikincisi ise otomatik ve çapraz optik korelasyonlar üzerine kuruludur. İlk tekniği kullanarak, iki kiriş kaba bir çakışma elde edilir (belirsizlik 10 PS), iki kiriş doğru temporal örtüşme bir çapraz-korrelatör (1 FS çözünürlüğü) kullanılarak elde edilir iken.
Üçüncü önemli yönü mikroskop içinde iki kiriş hizalama (protokol 3,3 adım bakın). Örnek bir ön beyaz ışık gözlem istenen görüş alanı (FOV) bireyye sağlar. Daha sonra, mikroskopla bir yan liman tarafından mikroskop giren lazer kirişler, üst parçaya monte edilen PD 'ye ulaşmak için hizalanır (Şekil 3). Ancak, doğru görüntü edinme için, bir dizi parametreyi ayarlamak gereklidir (örneğin, piksel boyutu ve piksel bekleme süresi). Örnekleme sıklığı, bir görüntüdeki tüm bilgileri korumak için Nyquist 'in teoremi tarafından uygulanan kısıtlamaya saygı göstermelidir, ancak her pikselde ölçülen uzamsal koordinatlar ve SRS değerinin arasında doğru bir yazışmalar için, entegrasyon süresi eşit veya piksel bekleme süresi ile karşılaştırılabilir olmalıdır.
Mikroskop hizalama son adımda, çok sayıda testler uzamsal ve temporal hizalama optimize etmek için gerçekleştirilir (protokol adım 3,4 bakın). Bir dizi iletim görüntüleri (TI) her ikisi için Ti: SA ve OPO uzamsal çakışmayı en iyi duruma getirmek için elde edilir. Bir TI 'de, tek bir kiriş kullanılır ve örnekteki iletilen ışın yoğunluğu bir PD ile ölçülür. TI ise OPO tarafından gerçekleştirilen durumda, PD çıkış sinyali doğrudan PCI kartına bağlanır, TI durumunda Ti: SA tarafından gerçekleştirilen durumunda, PD çıkış sinyali LIA bağlı ve LıA analog çıkış PCI kartına bağlanır. İletim görüntüleri FOV optimize etmek için çok yararlıdır, aydınlatma, mikroskop hedefleri odak pozisyonu ve iki kiriş dağınık6,7,8olup olmadığını kontrol etmek.
Pompa ve prob ışınının temporal çakışmanın optimizasyonu, 3,3 FS zaman vardiyasına karşılık gelen 0,001 mm 'lik adımlarla gecikme çizgisini tarayarak ve çapı 3 μm olan polistiren boncuk numunesi tek bir noktada SRS ölçümü gerçekleştirerek elde edilir. Bir SRS sinyalinin amplitüdü, prob pompası gecikmesinin bir işlevi olarak, LIA 'dan değerleri ölçer ve iki kiriş6,7,8ile tam temporal örtüşme ile karşılık gelen maksimum sağlar. Sonuçlandırmadan önce, tüm tartışılan adımlar yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için zorunlu olduğunu unutulmamalıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisation tool</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon C2Tool</td>
			<td>Acquisation supported tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>APE-</td>
			<td>APE Pulse link control software</td>
			<td>software control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator</td>
			<td>APE</td>
			<td>APE PulseCheck USB 50</td>
			<td>Autocorrelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET10A</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector card</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs VRC</td>
			<td>IR detector Card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Semrock FF875-Di01-25X36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF875-Di01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td>
			<td>Pockels cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs DET025AL/M</td>
			<td>Photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast mirror scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Microscpe scanning head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser Ti:SA</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra II</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>TTi</td>
			<td>TG5011 AIM &#8211; TTi</td>
			<td>Function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
			<td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Standford Research System</td>
			<td>SR844-200 MHz dual phase</td>
			<td>A lock-in amplifier from Stanford Research Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch filter,</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-808E-25</td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical delay line</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport M-ILS200CC</td>
			<td>Tunable optical delay line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Parametric Oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
			<td>Coherent Compact OPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>WaveRunner</td>
			<td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td>
			<td>Digital Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI Card</td>
			<td>National instrument</td>
			<td>NI PCIe 6363</td>
			<td>Data acquisation card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Position Sensors Detectors</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport Conex PSD9</td>
			<td>Position detector sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter head</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>PowerMax PM10,</td>
			<td>Laser power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Thorlabs PT1/M</td>
			<td>Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of a nonlinear microscope based on stimulated raman scattering

Stimüle Raman saçılma (SRS) mikroskopisi yakın kızılötesi uyarma ışığı kullanır; Bu nedenle, birçok multi-foton mikroskobik görüntüleme özelliklerini paylaşır. SRS görüntüleme modalitesi, uygun bant geçiren filtreleri ve kilitleme amplifikatörü (LIA) algılama düzenine sahip, Taramasız bir İleri dedektör ile donatılarak ticari lazer tarama mikroskopları kullanılarak elde edilebilir. Tipik bir SRS mikroskobu Şematik düzeni aşağıdakileri içerir: iki darbeli Lazer kiriş, (yani, pompa ve prob bir tarama mikroskop yönlendirilmiş), hangi görüntü düzleminde hem boşluk ve zaman içinde çakışan olmalıdır, daha sonra içine bir mikroskop amaç odaklı iki tarama aynalar (SMs) ile örnek, hangi raster bir x-y düzlem arasında odak nokta. Numune ile etkileşimden sonra, iletilen çıkış darbeleri üst objektif tarafından toplanır ve ters mikroskopla takılan ileri algılama sistemiyle ölçülür. Pompa darbeleri bir optik filtre yığınıyla kaldırılır, ancak numunenin odak hacminde oluşan SRS sürecinin sonucu olan prob darbeleri bir fotodiyot (PD) ile ölçülür. PD 'nin okuması modülasyon derinliği ayıklamak için LIA tarafından kipi çözülmüş. İki boyutlu (2D) görüntü, ileri algılama birimini mikroskop tarama ünitesi ile senkronize ederek elde edilir. Bu yazıda, SRS mikroskobu uygulanması, 3 μm çapları ile polistiren boncukların etiket içermeyen görüntülerinin raporlanması ve başarıyla gösterilmiştir. Bu SRS mikroskoplar ticari olarak mevcut değildir, bu nedenle bu özelliklerin yararlanmak için, ev yapımı inşaat tek seçenektir dikkati çekiyor. SRS mikroskopisi birçok alanda popüler hale geldiğinden, SRS mikroskop uygulamasının bu dikkatli açıklamasını bilimsel topluluk için çok yararlı olabilir inanılmaktadır.

Şekil 7' de SRS ölçümü (örneğin tek BIR noktada SRS ölçümü) örneği bildirilir. Kirişler zaman veya uzayda örtüşmez olduğunda, elde edilen sonuç Şekil 8A'da bildirilir. Off-rezonansta, LıA tarafından ölçülen sinyalin genliği sıfırdır, ancak LıA tarafından ölçülen sinyal faz negatif ve pozitif değerler arasında atlar. Ancak, kirişler uzayda örtüşürken, gecikme çizgisini uygun bir aralıkta hareket ettirirken, elde e...

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering at JoVE.com

Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Stimululated Raman saçılma dayalı doğrusal olmayan mikroskop uygulanması

Bu yazıda, SRS deneysel kurma işleminin lazer tarama mikroskobu ile entegrasyonu ile elde edilen, stimüle edilen Raman saçılma (SRS) mikroskobu uygulaması açıklanmıştır. SRS mikroskobu iki femtosaniye (FS) lazer kaynakları, bir TI-safir (TI: sa) ve senkronize optik parametrik osilör (OPO) dayanmaktadır.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Bu protokol, doğrusal olmayan mikroskobu ile ilgilenen bilim adamının, uyarılmış Raman saçılımına dayalı bir mikroskobunun temel bileşenlerini, ayarını ve hizalama prosedürünü anlamasına yardımcı olabilir. SRS mikroskopisinin başlıca avantajları titreşim kontrastına dayalı etiketsiz görüntüleme yapabilme ve birkaç saniye içinde görüntü elde etme yetenekleridir. SRS mikroskobu, özellikle hücreler ve hücresel mimari için temel olan lipidler gibi karmaşık biyolojik yapıların çalışmaları, etiketsiz görüntülemeyi yeni boyutlara taşımıştır.SRS sinyali, sonda ışınının yoğunluğunda küçük bir değişiklik olarak algılanır ve gürültü yle bozulabilir. Bu nedenle doğru bir işaret çok önemlidir. Başlamak için, OPO ve Titanyum-safir lazer ışınlarını hizalayın, böylece ikisi de mikroskoba ulaşsın.Daha sonra, lazer ışını konum sensörü dedektörleri iki pozisyonda dichroic ayna bir ve ayna altı arasında yerleştirin. İlk pozisyon dikroik ayna bir yakın yer alır ve ikinci bir ayna altı yakındır. Her pozisyon için, OPO ışınının X ve Y koordinatlarını algılamak için sensörleri kullanın.Daha da önemlisi, Titanyum-safir lazer ışınının X ve Y koordinatlarının sensörün dedektörlerinin her iki konumunda da aynı OPO'ya ait olduğunu doğrulayın. Bazı pozisyonlarda, eşakışmayacak koordinatlar varsa, dengelemek için bitişik aynanın eğimini ayarlayın. Titanyum-safir ışın konumlarını aynanın altı ve yedi arasındaki yol için OPO ile ilgili olarak hizalamak için aynı prosedürü uygulayın.Ayna altı ve yedi arasında bir flip-flop montaj ek bir ayna yükleyin ve otokorelator içine Kiriş yönlendirmek için ayna nın montaj çevirin. Otokorelatör denetleyicisi üzerinde güç, onu kontrol bilgisayarda yazılım uygulamasını başlatmak ve 8,35 milimetre normal konumuna otoklavator ışın mesafesi ayarlama vidaayarlayın. Daha sonra, Titanyum-safir ışını durdurun ve OPO ışınını ek aynadan otokorelatörün giriş aynasına yansıtın.Burada gösterildiği gibi lazer darbe sinyali maksimize etmek için giriş aynası ayarlamaya çalışın. Daha sonra, OPO ışını durdurun ve serbest bırakın ve flip-flop monte aynadan giriş aynasına ve otokorelatora Titanyum-safir ışını yansıtın. Burada gösterilen otokorelatör sinyali elde edilene kadar en uygun ışın ayarı tekrarlayın.Şimdi, Kiriş mesafesi ayar vidasını 7.30 milimetrelik çapraz konuma ayarlayın. Her iki kiriyi de serbest bırakın ve iki kirişle çakışmak için gecikmiş hattı tarayıp takın. Burada gösterildiği gibi, ortaya çıkan çapraz korelatör sinyalini elde edin.Daha sonra, kirişler ayna yedi ve mikroskop un tarama kafası ulaşabilirsiniz böylece flip-flop monte ayna çevirin. Kondansatörü çıkarın ve 60x öznel lensi geçici olarak geri çekmek için kaçış düğmesini kullanın. Ardından 60x öznel lensi optik yoldan çıkarmak için burun parçasını döndürün.Daha sonra, dedektörü harici mekanik montaj kullanarak mikroskobun üst kısmına monte edin. Dedektörün çıkışını 50 Ohm Düşük Geçiş Filtresi'nden osiloskopa bağlayın. Şimdi, tarayıcı kafasını kontrol eden işlemciyi açın ve OPO ışınını mikroskobun tarayıcı başına yansıtın.OPO sinyalini izleyin ve xy çevirmeni kullanarak dedektör tarafından ölçülen gücü en üst düzeye çıkarın. Daha sonra, OPO lazerden Titanyum-safir lazere ışın geçişi ve Titanyum-safir lazer için de bir sinyal elde olduğunu doğrulayın. Bu, her iki kirişin de iyi hizalanmış olduğunu gösterir.60x öznel tanıtmak için burun parçası geri döndürerek kiriş hizalama sonuçlandırın. Ardından, 60x mikroskop objektif objektifine kesinleştirilmiş odağı yeniden kazanmak için mikroskoptaki yeniden odaklama düğmesini kullanın. Son olarak, hedefi, numuneye dokunmadan veya rahatsız etmeden kondansatörün yerine 40x büyütme ile yerleştirin.Mikroskoptan önce ölçülen Titanyum-safir ve OPO lazerlerinin gücünü her iki ışın için de 30 miliwatt'a ayarlayın. Daha sonra, pompa ve prob boncuk titreşim frekansı ile rezonans içinde değil, böylece, bir önceki ne göre, farklı bir değere OPO lazer dalga boyu ayarlayın. Sonra, her iki Kirişi de serbest bırakın, böylece mikroskoba girin.Tarama gecikme hattını bilgisayarlı çevirmeni çalıştırın ve gecikme hattının her konumu için kilitleme amplifikatörü kullanarak ölçülen yoğunluğu kaydedin. Gecikme hattı taraması tamamlanana kadar bekleyin. Şimdi, OPO'nun dalga boyunu 1076 nanometreye ayarlayın, böylece pompa ve sonda boncukların titreşim frekansıyla rezonansa alın.Tarama gecikme hattını bilgisayarlı çevirmençalıştırın ve gecikme hattı taraması tamamlanana kadar bekleyin. Son olarak, elde edilen çakışma ışını konumunu ve uyarılmış Raman saçılma görüntülerinin bir sonraki kazanımını elde etmek için gecikme hattını ayarlayın. Kirişlerin uzamsal senkronizasyonunu optimize etmek için Titanyum-safir ışınıdurdurarak ve OPO gücünü sekiz miliwatt'a indirerek başlayın.Ardından, dedektör okumasını veri toplama kartına bağlayın. Mikroskop tarama konsolu ile birlikte veri toplama programını çalıştırın. Tamamlandığında, dosyayı kaydedin ve burada gösterilen gibi bir görüntü elde etmek için verileri işleyin.Daha sonra, OPO ışını durdurun ve Titanyum-safir gücünü 2,5 ila 4,5 miliwatt'a düşürün. Dedektörü kilitleme amplifikatörü ve okumalarını veri toplama kartıyla bağlayın. Daha sonra, yine mikroskop tarama konsolu ile birlikte veri toplama programı çalıştırın.Tamamlandığında, dosyayı kaydedin ve burada gösterilen gibi bir görüntü elde etmek için verileri işleyin. Pompa darbeleri kaldırmak ve sadece stoke sinyali elde etmek için 40x objektif ve fotodiyot arasında filtre yığını tanıtın. Daha sonra pompa sinyalini 8 miliwatt'lık odaklanmış güçle 810 nanometreye ayarlayın.3054 ters santimetre Raman kayması ile polistiren tipik bir Karbon-Hidrojen bağı araştırmak için sekiz miliwatt aynı odaklı gücü ile 1076 nanometre sonda sinyali ayarlayın. Dedektörü kilitleme amplifikatörü ve kilitleme amplifikatörü okumasıyla veri toplama kartına bağlayın. Son olarak, mikroskop programında piksel biçimini ve edinme süresini ayarlayın ve tamamlandığında matris dosyasını kaydederek ve veri toplama sistemini çalıştırın.Örneğin tek bir noktasından bir örnek ölçüm burada görüntülenir. Işın zaman veya uzayda çakışmadığında, elde edilen sonuç, kilitleme amplifikatörü ile ölçülen sinyalgeninin sıfır olduğu rezonanskapalıdır. Ancak bu sinyalin fazı negatif ve pozitif değerler arasında geçiş eder.Eğer ışınlar uzayda üst üste bindirilirse, ışınlar zaman içinde mükemmel bir şekilde örtüştünce sinyal artar ve maksimuma ulaşır, faz ise Kirişlerin örtüştüldettiği süre boyunca sabit bir değer elde etmeye başlar. İletim görüntüsünde tek bir ışın kullanılır ve numuneden iletilen ışın yoğunluğu bir fotodiyot ile ölçülür. Sol tarafta, iletim görüntüsü OPO kullanılarak elde edilirken, sağ tarafta titanyum-safir kullanılarak iletim görüntüsü elde edildi.Üç mikrometre çapında polistiren boncukların etiketsiz görüntülerinin rapor edildiği srs görüntüsünün tipik bir örneği burada gösterilmiştir. SRS mikroskobudayalı yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için, bir mikroskobun hizalanması önemlidir. Bu nedenle protokolde belirtilen tüm adımın dikkatle yerine getirilmesi gerekir.

Research

JoVE Journal

Engineering

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

Nanodetection için bir referans Interferometer Uygulanması

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Coherent anti-Stokes Raman Scattering CARS Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Çözünme sırasında tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması (CARS) Mikroskopi visualizes İlaç Tabletler

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Tek plasmonik Nanoparçacığı gelen doğrusal olmayan Saçılma Ölçülmesi

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Automation of Mode Locking in a Nonlinear Polarization Rotation Fiber Laser through Output Polarization Measurements

Çıktı Polarizasyon Ölçümler aracılığıyla Doğrusal Olmayan Polarizasyon Rotasyon Fiber Lazer Mod Kilitleme Otomasyonu

When a laser is mode-locked, it emits a train of ultra-short pulses at a repetition rate determined by the laser cavity length. This article outlines a ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

Mikrosferik Whispering Galeri Modu Rezonatörler içinde Uyarılmış Stokes ve Antistokes Raman saçılması

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Işık saçılma Profiler (SLPS) Tabanlı Metodoloji İntraoküler Lenslerden İleri ve Geri Işık Saçılımını Kantitatif Olarak Değerlendirmek İçin Tarama

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

Yüksek hızda sürekli uyarılan Brillouin saçılma Spektrometre için malzeme analizi

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

Experimental Implementation of a New Composite Fabrication Method: Exposing Bare Fibers on the Composite Surface by the Soft Layer Method

Deneysel yeni bir bileşik imalat yöntemi uygulanması: bileşik yüzeyi yumuşak katman yöntemi tarafından çıplak lifleri ortaya

The bipolar plate is a key component in proton exchange membrane fuel cells (PEMFCs) and vanadium redox flow batteries (VRFBs). It is a multi-functional ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

Gösteri bir mikroskop Hyperlens entegre ve süper kararlılık düşsel

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Predicting Catalyst Extrudate Breakage Based on the Modulus of Rupture

Predicting katalizör Extrudate kırılma rüptürü modülü üzerinde dayalı

The mechanical strength of extruded catalysts and their natural or forced breakage by either collision against a surface or by a compressive load in a ...