Name: characterization of proteins by size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (sec-mals)
Uploaded: 2019-06-20T13:30:00
Duration: 10 min
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我们感谢Tsafi Danieli博士(希伯来大学沃尔夫森应用结构生物学中心)的建议和合作。我们还感谢丹尼尔生物技术有限公司(以色列雷霍沃特)协助和建立本研究中使用的分析FPLC-MALS系统。

1. 系统准备
<ol><li>连接 FPLC 紫外线探测器下游的 MALS 和 dRI 探测器。绕过pH值和电导率检测器,因为它们将在紫外线和MALS探测器之间增加显著的检测器体积。使用从柱到探测器之间 0.25 mm i.d.的毛细管,以及探测器输出上的 0.75 mm i.d. 毛细管,以浪费或收集分数。</li>
	<li>确保FPLC和探测器之间建立了必要的信号连接,包括从紫外检测器到MALS模拟输入的模拟输出,以及通过FPLC的I/O盒从FPLC到MALS自动注入的数字输出。</li>
	<li>安装适当的分析 SEC 列,涵盖至少 20 kDa 到 500 kDa 的分馏范围。检查产品信息以确定该列是否适合 MW、pH 和其他样品和移动相的特性范围。</li>
</ol>2. 准备缓冲液,在一夜之间使系统郁郁葱葱,并检查清洁度
<ol><li>使用HPLC级试剂,制备1L磷酸盐缓冲盐水,50-100 mM NaCl。使用瓶顶磺胺过滤器或类似滤芯将缓冲液过滤到 0.1 μm。将前50-100 mL缓冲液过滤到废瓶中并丢弃,以消除干过滤器中的微粒,然后将其余部分过滤到清洁无菌瓶中,该瓶已用过滤的去离子水彻底清洗,并盖上盖住以防止灰尘从进入。 注:如果要分析优先溶解在这些溶剂中的其他蛋白质,可以使用其他移动相溶剂,如Tris缓冲液。</li>
	<li>以 0.5 mL/min 的流速或柱制造商另有建议过夜,以平衡缓冲液中的柱并去除颗粒。使用 FPLC 的连续流模式,并确保流不会停止,直到所有 SEC-MALS 运行完成。<ol>
<li>在通宵冲洗期间,将 dRI 流单元置于清除模式。在开始示例运行之前关闭清除。</li>
		<li>开始时冲洗时,逐渐升高流速,以防止由于柱内压力的突然变化而产生"柱脱落"效应(或颗粒释放)。</li>
		<li>如果已知系统相当稳定且无颗粒,并且与所需的移动相保持平衡,则用较短的 2-3 小时冲洗替换隔夜冲洗。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通过轻轻敲击柱下游的油管以释放累积的颗粒,并在 MALS 仪器的前面板显示屏上的 90° 探测器中观察信号,从而检查系统的清洁度。验证峰峰值噪声不超过 50 -100 μV。</li>
	<li>执行"空白"喷射,以验证喷油器是否清洁颗粒。"空白"只是运行缓冲液,在新鲜无菌小瓶中准备。<ol>
<li>如果粒子峰值的体积不超过 1 mL,且比基线高出不超过 5 mV,则系统已准备好进行采样。否则,请执行额外的空白喷射,直到清洁,或执行维护以清洁喷油器。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 准备和加载样品
<ol><li>在 SEC 缓冲液中以 1-2 mg/mL 制备至少 200 μL 的 BSA。 注:为了防止降水,BSA绝不应在纯净水中溶解。</li>
	<li>使用注射器尖过滤器将蛋白质过滤至0.02 μm。</li>
	<li>丢弃前几滴滤液,以消除干过滤器中的颗粒。</li>
	<li>或者,在10,000 x g下离心样品15分钟,以便沉淀非溶性骨料和其他大颗粒。</li>
	<li>将 100 μL 的 BSA 溶液注入环路。 注:这是推荐的材料量,根据样品的情况(如稳定性或可用性)可以或多或少地注入。每次注射所需的蛋白质量随分子量成反比变化 - 如果分子量为 33 kDa,则需要两倍的蛋白质质量,即 BSA 的一半。</li>
</ol>4. 编制MALS软件
<ol><li>打开新 |在 MALS 软件菜单中从方法中试验,并从光散射系统方法文件夹中选择联机方法。如果存在 DLS 探测器,请从光散射中选择联机方法 |使用 QELS文件夹。</li>
	<li>在"配置"部分中,设置示例和移动阶段的参数。<ol>
<li>在通用泵视图中,将流速设置为 FPLC 中使用的流速。</li>
		<li>在通用泵视图中,溶剂分支,"名称"字段,选择PBS。</li>
		<li>在"注射器"视图中,样本分支输入名称为BSA,并设置dn/dc = 0.185(未修饰蛋白质的标准值)、A2 = 0 和 UV 消光系数 = 0.667 mL/(mg-cm)。 注:对于其他蛋白质,UV280 nm 消光系数可在文献中找到,或使用各种公共领域软件工具从序列中计算。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在"过程"部分"基本收集"视图中,选中"自动注入时触发"复选框,并将运行持续时间设置为 70 分钟,以便收集整个洗脱的数据,直到 SEC 的总渗透量列。 注:必要的时间量可能因柱和流速而异 - 标准 7.8 mm x 300 mm HPLC-SEC 列的 0.5 mL/min 需要 35 分钟的收集时间。</li>
	<li>单击"运行"按钮,在 MALS 软件中启动实验。它将在通过 MALS 探测器从 FPLC 仪器接收脉冲信号后开始读取数据。</li>
	<li>单击仪器前面板上的自动归零按钮,将 dRI 信号归零。</li>
</ol>5. FPLC软件的编写
<ol><li>在 FPLC 软件中插入蛋白质的名称和运行,在手册 |执行手动说明 |设置标记。</li>
	<li>将喷射阀从手动负载切换到流量路径下的喷射 |喷射阀.</li>
	<li>通过在 I/O 框下插入 0.5 s 脉冲来包括脉冲信号|脉冲数字出。这将触发 MALS 软件中的数据收集。</li>
</ol>6. 将样品注入循环。单击 FPLC 软件中的执行以启动实验运行。
7.分析SEC-MALS BSA数据
<ol><li>在 MALS 软件的"程序"部分下逐步执行分析。<ol>
<li>通过检查"基本集合"视图,验证峰值在 UV、MALS 和 RI 中的洗脱体积大致相同。</li>
		<li>在基线视图中,定义所有信号的基线(所有 LS 探测器、UV 和 dRI)。应定义基线以指示纯溶剂水平,最好从样品峰的一侧延伸到另一侧。</li>
		<li>在"峰值"视图中,通过单击并拖动鼠标定义要分析的峰值。选择每个峰值的中央 50%。首先选择单体峰值("峰值 1"),然后选择二分器峰值("峰值 2")。验证每个峰值下的 BSA 的dn/dc = 0.185 和 UV 280 nm 消光系数 = 0.667 的正确值。</li>
	</ol>
</li>
	<li>执行峰值对齐、带宽校正和规范化程序。 注: 通常,SEC-MALS 方法会定期校准,以便使用具有回旋R < 10 nm 半径的单分散蛋白(如 BSA)将角探测器的峰对齐、带宽和规范化角度检测器规范化到 90° 探测器单体。在此示例中,BSA 既充当校准分子,也是 MW 分析的主题。<ol>
<li>在程序 |对齐视图,通过单击并拖动鼠标选择峰值的中心区域,单击"对齐信号",然后单击"确定"。</li>
		<li>在程序 |波段宽幅视图,选择中央50%的单体峰。确保 RI 检测器被指定为参考仪器,然后单击"执行拟合并应用"以将 UV 和 LS 信号与 RI 信号匹配。<ol>
<li>放大到峰值以验证它们在中心 50-70% 内是否紧密重叠,然后单击"确定"。</li>
			<li>如果重叠不完美,(可能需要)执行拟合和"应用"一两次,直到重叠是出色的。</li>
		</ol>
</li>
		<li>在程序 |规范化视图,选择峰值 1,输入 3.0 nm 作为Rg值,单击"规范化然后确定"。</li>
		<li>在程序 |从 MALS视图中查看 Molar Mass 和 Rg,查看数据以确定由于噪声过大,应从分析中取消选择哪些检测角度(如果有)。通常,这些将是尘埃颗粒散布相对高强度的较低角度。从右侧的图形中选择峰内的各个切片,并在左侧的图形中查看反向减少的 Rayleigh 比率的角依从性。如果最低角度(有时是最高角度)始终与拟合有很大的偏差,则从视图底部的列表中取消选择它们。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在EASI 图形视图中查看结果的图表。从窗口顶部的"显示"下拉列表中选择"摩尔质量"。使用 Ctrl + 单击并拖动以放大峰值区域。</li>
	<li>查看结果中单体和二聚体峰值的最终表格重量平均摩尔质量结果 |峰值结果下的报告(摘要)视图|摩尔质量矩 (g/mol) |Mw. .纯度在峰值结果下报告|质量分数(%)。 注:还显示其他摩尔质量矩;这些通常与异构聚合物相关,但与具有离散大小的蛋白质无关。该软件产生的许多其他结果可能包含在报告中,如质量回收百分比(通过浓度检测器洗脱的蛋白质相对于注射量的分数)、峰值统计、多分散性、R g和Rh时刻等。如果提供不确定性测量,则根据测量系列中的噪声反映引用值的精度,不应视为表示精度。报告值的真实精度取决于各种因素,如提供的dn/dc和消光系数值的精度、仪器校准等。</li>
	<li>在"文件"菜单中,选择"另存为方法",并将分析的 BSA 数据保存为未来测量所有类型的蛋白质的标准方法。为 BSA 确定的规范化和范围扩大参数将在分析中进行。</li>
</ol>

DS 是怀亚特技术公司的员工,该公司的 MALS 产品在本协议中得到使用。AT 是 Danyel 生物技术公司的员工,是怀亚特 MALS 和 AKTA FPLC 仪器的分销商。

SEC-MALS实验为各峰的摩尔质量和流体动力学尺寸提供了单体、二分体和三分法的良好分离和定量结果。这反过来又清楚地识别和描述每个物种存在,以及量化纯度。通常获得的结果精确到5%以内,精确和可重复到1-2%3,69。这种精度和可重复性水平使得可以自信地区分可能接近 MW 的物种,只要它们被 SEC 分隔(可能在同一峰值内部分重叠)。蛋白质质量控制和基本生物物理表征的好处是显而易见的。
对于敏感、可重复的 SEC-MALS 测量而言,验证颗粒的缺失非常重要。粒子峰值通常显示为大型 MALS 信号,与类似的 UV 或 RI 信号不相上下。移动相和样品应仔细准备,以消除此类颗粒。使用HPLC级试剂或更好,过滤移动相和稀释缓冲液到0.1 - 0.2 μm(预洗过滤器,以消除始终存在于干燥膜上的颗粒),维护超清洁移动相瓶和其他玻璃器皿建议在流量下进行 SEC-MALS 和扩展柱平衡(以去除在流量停止或列不使用时可能积聚的微粒和集料)。样品应过滤到最小的孔径,不会去除感兴趣的材料,通常不超过0.1 μm,如果可能,不超过0.02 μm。如果过滤器迅速堵塞,样品可以离心,在孔径下降的阶段过滤,和/或重新纯化。当系统始终保持高质量、新鲜和过滤移动相,防止柱冲击,样品清洁且不粘附柱,测量不会显示上述颗粒噪声,并提供高质量数据。
MALS与典型的SEC蛋白质缓冲液无关;除PBS外,许多其他缓冲系统可用于优化分离和稳定性,包括各种赋形剂71。MALS 与特定列也不可知,应选择该列以进行最佳分离和恢复。赋形剂对分析的主要关注点是折射率的显著变化,导致特定折射率增量dn/dc和在需要紫外线分析时吸收 280 nm 的赋形剂发生修改。例如,精氨酸是一种常见的聚合还原赋形剂,可以显著影响典型蛋白质的dn/dc,甚至将其引入负态(如果dn/dn/DC,SEC-MALS仍可以分析具有负dn/dc的蛋白质。dc是经验决定的,但如果dn/dc = 0,则蛋白质散射的光强度将无效,MW 分析将不可能)。Zhao等人35广泛讨论了蛋白质的dn/dc值,结果表明,对于标准水缓冲液,绝大多数未修饰的蛋白质在标准值(0.185或0.186 mL/g=660 nm)的2-3%范围内。,虽然低于 10 kDa 的蛋白质是可变的,并且有几个物种可能高达 0.21 mL/g。
数据中BSA单体和二聚体峰值的MW曲线均相当均匀,在2%或以下,表明单分散物种。峰值上不均匀的 MW 值可能由异质性或不正确的分析引起。特别是,BSA MW 轮廓是凹面("微笑")或凸面("grimace"))可能导致未正确应用带宽校正。对于其他蛋白质,凸型轮廓也可能产生于单体和寡聚物之间的动态平衡,其中单体与寡聚物的比值,因此明显的MW值取决于峰值浓度(BSA不表现出这种行为,经常使用作为控制样本,以验证正确的带宽参数)。从前缘到后缘变化且不随样品浓度变化的 MW 轮廓是分子量物种分布的典型,由 SEC 部分解析。通过注入不同总量的蛋白质,明显不均匀分布的来源 - 分布会随着动态平衡而变化,但不会具有固定分布或不正确的范围扩大校正。
鉴于上述限制,SEC-MALS 不适合各种任务。不适合分析原油样品;样品应用标准亲和力和抛光方法进行良好纯化。它没有足够的准确性或解析能力来识别具有相同或非常接近质量的蛋白质或mAb的突变体和变异,并且不能与在SEC柱上不脱脂或分离的分析物一起使用,尽管最近已经证明,电离e 或反相色谱可与 MALS 结合,以分离和表征 SEC 72、73、74 未解析的物种。在蛋白质数量受到严重限制的情况下,SEC-MALS 可能并不可行,因为它通常需要 10 - 200 μg3,而管内径大于 0.25 mm 的 FPLC 系统可能需要更多;但是,由 UHPLC-SEC-MALS 可以分析较小的数量。高度不稳定的蛋白质,在引入移动阶段时聚合不适合SEC-MALS分析,虽然缓冲优化使用线下动态光散射可以克服这个问题75。
尽管 SEC-MALS 需要付出额外的努力,但它对蛋白质研究是无价的,并且被学术界和生物制药界广泛使用。除了上述协议中所述的单体、寡聚物和骨料的表征,SEC-MALS 还可以对修饰的蛋白质(如糖蛋白(分别确定蛋白质和甘油成分的MW)、表面活性剂或脂质溶解膜蛋白(分别确定蛋白质和溶解剂成分的MW),蛋白质组件,如病毒状颗粒、蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸复合物、多糖、蛋白多糖结合、肽和许多其他生物大分子。

可靠的分析溶液中蛋白质的分子量(MW)对于生物分子研究1、2、3、4至关重要。MW分析通知科学家,如果已经产生了正确的蛋白质,如果它是否适合用于进一步的实验5,6。正如蛋白质研究网络P4EU7和ARBRE-Mobieu8网站上所描述的那样,蛋白质质量控制不仅必须描述最终产品的纯度,而且必须描述其寡形状态、同质性、身份、构象、结构、翻译后修改和其他属性。
在非变性溶液中,MW 测量可识别存在于水环境中的蛋白质形式,无论是单体或寡聚。而对于许多蛋白质来说,目标是产生单体形式,而对于其他人来说,特定的原生寡果是生物活性9、10、11、12的关键。其他寡聚物和非原生骨料是不可取的,并且会导致晶体学、核磁共振 (NMR) 或小角度 X 射线散射的结构测定缺陷,以及功能测定中的伪影或不准确通过等温滴热量测定法或表面质子共振2,13定量结合。
在单克隆抗体 (mAbs) 等生物治疗中,基于溶液的MW分析在质量控制和产品表征方面也有类似的用途。过多的聚合和碎片表明产品不稳定,不适合人类使用。监管机构要求仔细定性,不仅治疗分子,而且潜在的降解物,可能存在于最终产品14,15,16,17。
一些最普遍的诊断蛋白质MW的方法是硫酸二钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细血管电泳(CE)、原生PAGE、质谱(MS)、尺寸排除色谱(SEC)和分析超离心(AUC)。其中,SDS-PAGE、CE 和 MS 不在原生状态下执行,通常会导致寡聚物和聚合物的分离,因此不适合确定原生寡聚物或量化聚合物。虽然从理论上讲,原生 PAGE 确实保留了原生状态,但根据我们的经验,许多蛋白质很难优化,结果也不是很可靠。AUC,无论是通过沉积速度还是沉积平衡,都是定量的,可以从第一原理确定MW,但它相当繁琐,需要大量的体力劳动和重要的数据解释专业知识,长时间的实验时间和非常昂贵的仪器。
分析 SEC 是一种定量且相对稳健的简单方法,用于在流经包装柱时分离大分子。SEC的原则和应用在若干评论18、19、20和手册"大小排除色谱:原则和方法"21中得到了很好的介绍。保留的不同是由于在从柱的末端脱去之前,在固定相中分散进出孔隙的时间不同。差异(名义上)产生于分子22的相对大小和扩散系数。使用一系列参考分子构建校准曲线,将分子的MW与洗脱体积相关联。对于蛋白质,参考分子通常是行为良好的球状蛋白,不通过电荷或疏水表面残留物与柱相互作用。使用紫外线 (UV) 吸收检测器测量洗脱体积。如果已知紫外线消光系数(通常根据序列计算)则蛋白质峰值总质量也可能定量。
值得注意的是,SEC对MW的分析依赖于两个有关要特征的蛋白质的关键假设:1)它们与参考标准共享相同的构象和特定体积(换言之,扩散特性和MW)和2)与参考标准一样,它们不与列相互作用,除非是固有特性,它们不遵循按电荷或疏水性相互作用的列包装。这些假设的偏差使校准曲线失效并导致错误的 MW 测定。这是内在无序的蛋白质,具有大斯托克斯半径,由于其广泛的非结构化区域23,24或非球形/线性寡聚组件10。糖基化蛋白质通常比非糖化形式有更大的斯托克斯半径,即使添加的碳水化合物质量被考虑19。洗涤剂溶解膜蛋白与校准蛋白不同,因为它们从 SEC 的洗脱取决于多肽-洗涤剂-脂质复合物的总大小,而不是蛋白质 25 的寡聚态和摩尔质量 ,26.柱化学、pH和盐条件都影响带电或疏水表面残留物的蛋白质的洗脱量27、28。
与多角度光散射 (MALS) 和差分折射率 (dRI)探测器 3、4、11、29相结合时,SEC 在 MW 测定方面变得更加通用和可靠。 30,31,32.dRI 探测器根据分析剂存在引起的溶液折射率变化来确定浓度。MALS 探测器测量由Anlyate散射到相对于入射激光束的多个角度的光的比例。该仪器统称为 SEC-MALS,独立于洗脱时间确定 MW,因为 MW 可以直接使用公式 1 从第一原理计算,
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59615/59615eq1.jpg">⑴
其中M是 Anlyate 的分子量,R(0) 降低的 Rayleigh 比率(即,由 ANlye 仪相对于激光强度散射的光量)由 MALS 探测器确定并外推为零角,c 由 UV 或 dRI 检测器确定的重量浓度,dn/dc Analyte 的折射率增量(本质上是解毒物和缓冲液的折射率之间的差异),以及K 取决于系统特性,如波长和溶剂折射率29。
在 SEC-MALS 中,SEC 列仅用于分离溶液中的各种物种,以便它们分别进入 MALS 和浓度检测器单元。实际保留时间对分析没有意义,除非它能解决蛋白质物种的程度。仪器独立于柱进行校准,不依赖于参考标准。因此,SEC-MALS 被认为是从基本物理方程中确定 MW 的"绝对"方法。如果样品是异构的,并且没有完全由列分隔,则在每个洗脱体积处提供的值将是每个洗脱体积中流经流单元的每个洗脱体积中分子的重量平均值,约为 75 μL。
通过分析散射强度的角变化,MALS还可以确定几何半径大于约12.5nm29的大分子和纳米粒子的大小(根均方半径、Rg)。对于单体蛋白和寡聚物等较小物种,可在MALS仪器中添加动态光散射(DLS)模块,以测量0.5纳米至33的流体动力半径。
虽然 UV 或 dRI 浓度分析可以提供 Eq. 1 中c的值,但使用 dRI 是首选,原因有二:1) dRI 是一种通用浓度检测器,适用于分析不含紫外线的糖或多糖等分子色光34;2)水缓冲液中几乎所有纯蛋白质的浓度反应dn/dc都相同,在1%或2%(0.185 mL/g)35之间,因此无需知道紫外线消光系数。
SEC-MALS在蛋白质研究中的应用相当广泛。到目前为止,最常见的应用是确定纯化的蛋白质是单一蛋白还是寡聚蛋白,以及寡聚的程度,并评估聚合体3、10、11、17 31,36,37,38.对于不能用传统方法为特征的洗涤剂溶解膜蛋白,这样做的能力尤其珍贵,为此公布的详细方案已经公布于31、39、40 ,41,42,43.其他常见应用包括确定糖蛋白、脂蛋白和类似偶联物的转化后修饰程度和多分散性4、31、44,45,46,47;异质复合物的形成(或缺乏)和绝对化学计量(相对于化学计量比),包括蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸和蛋白质-多糖复合物24、46, 48,49,50,51,52;确定单体-二聚体平衡解散常数49、53、54;并评估蛋白质构象55,56。除了蛋白质,SEC-MALS对于肽57,58,广泛异质的天然聚合物,如肝素59和甲壳素60,61,小病毒62和大多数类型的合成或加工聚合物63,64,65,66。在文献67和网上(http://www.wyatt.com/bibliography)中可以找到广泛的书目。
在这里,我们提出了一个运行和分析 SEC-MALS 实验的标准协议。牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白质单体和寡聚物分离和表征的例子。BSA 协议确定某些系统常数,作为进一步 SEC-MALS 分析的基础,包括复合物、糖蛋白和表面活性剂结合膜蛋白分析。
我们注意到,SEC-MALS 可能使用许多供应商的标准高性能液相色谱 (HPLC) 或快速蛋白液相色谱 (FPLC) 设备进行。该协议描述了在生产蛋白质用于研究和开发的实验中发现的FPLC系统的使用(见材料表)。在运行协议之前,应安装 FPLC 系统、MALS 和 dRI 探测器,以及相应的软件包,以便根据制造商的说明和任何必要的校准常数进行控制、数据采集和分析或输入到软件中的其他设置。应在泵和喷油器之间放置内联过滤器,并安装 0.1 μm 孔膜的亲水孔膜。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:770px;" width="770">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">AKTA pure</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">29-0182-26</td>
			<td style="width:242px;">fast protein liquid chromatograph (FPLC)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">AKTA UNICORN</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>FPLC control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">ASTRA</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td></td>
			<td>MALS data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Bovine serum albumine (purity &#62;97%)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A1900</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">DAWN or miniDAWN</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:123px;">WH2 or WTREOS</td>
			<td>multi-angle light scattering (MALS) detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Increase 200 10/300</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>size exclusion column, 200 &#197; pores, 10 mm i.d., 300 mm length</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Optilab</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:123px;">WTREX</td>
			<td>differential refractive index (RI) detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Sodium chloride NaCl</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:123px;">71382</td>
			<td>HPLC grade NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 &#181;m 1000 mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SCVPU11RE</td>
			<td>mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-1002</td>
			<td>sample filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 &#181;m pore, 10 mm diameter</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-1012</td>
			<td>sample filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-2012</td>
			<td>mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">WyattQELS</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td>WIQ</td>
			<td>dynamic light scattering detector</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of proteins by size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (sec-mals)

分析尺寸排除色谱(SEC),通常用于测定溶液中蛋白质和蛋白质-蛋白质复合物的分子量,是一种相对技术,它依靠分析物的洗脱体积来估计分子重量。当蛋白质不是球状或经历非理想柱相互作用时,基于蛋白质标准的校准曲线无效,从洗脱量中确定的分子量不正确。多角度光散射(MALS)是一种绝对技术,它根据基本物理方程确定溶液中分析物的分子量。SEC 分离与 MALS 分析相结合,构成了一种多功能、可靠的方法,用于描述一种或多种蛋白质物种(包括单体、原生寡聚物或聚合体和异质复合物)的溶液特征化。由于测量在每个洗脱体积上进行,SEC-MALS 可以确定脱模峰是均匀的还是异质的,并区分固定的分子量分布与动态平衡。也可以分析修饰性蛋白质,如糖蛋白或脂蛋白,或结合,如洗涤剂溶解膜蛋白。因此,SEC-MALS 是蛋白质化学家的关键工具,他必须确认用于生物或生物技术研究的分子的生物物理特性和溶液行为。SEC-MALS 该协议分析纯蛋白单体和聚合体的分子量和大小。获得的数据为进一步的SEC-MALS分析奠定了基础,包括复合物、糖蛋白和表面活性剂结合膜蛋白的分析。

图1a,b显示了 BSA 的三种寡聚形式:单体、二分体和修剪器,在 200 + 孔隙柱上与单体和二角器的基线分辨率很好地分离,而图 2a显示 75 + 孔柱上的分离不达到良好的单二体分辨率。后一个例子是为了说明"差"的结果;事实上,根据制造商规定的分离范围,可以预期两列的这些分离差异。修剪器未与二角器完全分离,较高的寡聚物与修剪器彼此未完全分离。图 2b是噪声光散射信号的示例,粒子存在于色谱图中,从而无法精确确定 MW。
从今以后,我们专注于图1b。单体在 13.8 mL 下洗脱,其重量平均摩尔质量 M w为 64.1 ± 0.4 kDa,由 MALS 确定,水动力半径Rh为 3.54 ± 0.01 nm。这些结果与BSA的序列质量和已知流体动力半径一致,分别为66.4 kDa和3.5nm68,在SEC-MALS的通常精度范围内,为5%3,69。在 12 mL 下洗脱的二分体显示Mw值 127 ± 1 kDa,由 MALS 按预期确定,是实验精度范围内单体值的两倍,R h值为 5.68 ± 0.06 nm。在11mL时也观察到修剪器峰值,M w为194 ± 9 kDa,由MALS测定,是单体精度的三倍,在实验精度范围内,如预期的那样。R由于 DLS 信号强度低,无法确定修剪器的 h。
在单体峰上计算的摩尔质量点均匀到2-5%以内,表示均匀性。发现一个尾随肩部与摩尔质量在38-50 kDa范围内,对应于BSA碎片70。这是不寻常的。穿过二角峰和三角峰的摩尔质量点不均匀,表明异质性。由于微量器痕迹出血到二角器峰值,并且修剪器峰值由于未解析的较高寡聚物的共同洗脱而异构,
单体峰值的信号噪声电平在所有三个信号中都是可以接受的,超过 100:1,而信号到噪声为 40:1 的比音器峰值也是可以接受的。蛋白质峰值以外的色谱图区域是平坦的,但由于在 LS 微量中接近总排除(空隙)体积的颗粒和 dRI 微量中的(正)盐峰值和 dRI 微量中(负)溶解空气峰值附近的颗粒峰值除外体积。这些在图1a中指出。
在 SEC-MALS 实验中也可以计算纯度水平:报告中单体峰的质量部分表示单体形态的纯度百分比。对于 BSA 单体,计算纯度为 88%。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig1.jpg"> 图 1:SEC-MALS分析牛血清白蛋白(BSA),使用200+孔径排除列。色谱图痕迹归一化为单体峰并偏移,以便清晰。(A) 指出可忽略的常见伪影,包括光散射信号开头附近的粒子峰,以及折射指数信号中总渗透体积附近的盐和溶解空气峰值。(B)色谱图具有优异的单体-二聚体分离,光散射信号具有较高的信噪。单体和二聚体 MW 值具有高均匀性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig2.jpg"> 图 2:低质量的 SEC-MALS 分析示例。色谱图痕迹归一化为单体峰并偏移,以便清晰。(A) 75 + 孔径排除列的分离不充分;8-9分钟之间的粒子峰值与蛋白质没有很好地分离。(B)光散射 (LS) 信号噪声比不足和与蛋白质相邻的大量颗粒明显。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

该协议描述了尺寸排除色谱与多角度光散射(SEC-MALS)的结合,用于对溶液中的蛋白质和复合物进行绝对表征。SEC-MALS 确定纯蛋白质、原生寡聚物、异质复合物和修饰性蛋白质(如糖蛋白)的分子量和大小。

蛋白质的表征(按尺寸-排除色谱与多角度光散射相结合(SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

SEC-MALS是确定溶液中大分子的分子量、大小和构象的定量方法。它可以识别寡聚物和复合物，并描述困难的样品，如糖蛋白和膜蛋白。SEC-MALS 是一种绝对方法。它依赖于基础物理，并不依赖于与分子标准、分子的构象或我们如何与分离介质相互作用的协作。SEC-MALS 可应用于许多以秒分隔的系统。从肽和小聚合物到蛋白质、核胶囊、多糖、合成聚合物、病毒类颗粒和小病毒。验证您的系统和缓冲区是否未满足供应商对低颗粒含量的建议非常重要。请咨询供应商的技术支持代表以确保。从准备 SEC-MALS 系统开始此过程，如文本协议中所述。使用每个 PLC 级试剂，用 50 至 100 毫摩尔氯化钠准备一升磷酸盐缓冲盐水。使用瓶装聚热电池泡沫过滤器将缓冲液过滤到 0.1 微米，或类似。将前 50 至 100 毫升缓冲液过滤到废瓶中，以消除干滤芯中的颗粒。然后，将剩余的滤波过滤到一个清洁的无菌瓶中，该瓶以前用过滤、去压的水清洗过，并防止灰尘进入。以每分钟 0.5 毫升的流速通宵冲洗柱，以平衡缓冲液中的柱，并清除颗粒物。使用 FPLC 的连续流模式，并确保流不会停止，直到所有 SEC-MALS 运行完成。在通宵冲洗期间，将 DRI 流量单元放在净化模式下。开始冲洗时，逐渐提高流速，以防止柱脱落效应，由柱中压力的突然变化引起。在开始示例运行之前关闭清除。通过轻轻敲击柱子下游的管子以释放积聚的颗粒，检查系统清洁度。观察 MALS 仪器前面板显示屏上 90 度探测器中的信号。验证峰值到峰值噪声不超过 50-100 微伏。还要验证折射率或 RI 信号稳定到负七折射率单位的 1 倍 10 到负七个折射率单位。执行空白喷射以验证喷油器是否清洁颗粒。空白只是用新鲜无菌小瓶准备的运行缓冲液。如果粒子峰值的体积不超过一毫升，且基线以上不超过五毫伏，则系统已准备好进行采样。否则，执行额外的空白喷射，直到清洁，或执行维护以清洁喷油器。现在，在 SCC 缓冲液中，以每毫升 1 到 2 毫克的速度准备至少 200 微升 BSA。使用注射器尖端过滤器将蛋白质过滤到02微米。丢弃前几滴滤液，以消除干滤片中的颗粒。或者，将样品在10，000倍G下离心15分钟，使非可溶性集料和其他大颗粒沉淀。然后，将 100 微升 BSA 解决方案注入环路。在 MALS 软件菜单中从方法打开新实验。然后，从光散射系统方法文件夹中选择联机方法。如果存在 DLS 探测器，请从具有 QELS 的光散射中选择联机方法。在配置部分中设置示例和移动相位参数。在通用泵视图中，将流速设置为 FPLC 中使用的流速。然后，导航到通用泵视图、溶剂分支、名称字段，然后选择 PBS。在喷油器视图中，示例分支，输入名称为 BSA。将 dn/dc 设置为 0.185，将 A2 设置为 0，将紫外线消光系数设置为每毫克 0.667 毫升。在过程部分的基本收集视图中，选择自动注入时复选框触发器。将运行持续时间设置为 70 分钟，以便为整个表示收集数据，直到达到 SEC 列的总渗透量。单击运行按钮在 MALS 软件中开始实验。在通过 MALS 探测器从 FPLC 仪器接收脉冲信号后，它将开始读取数据。单击仪器前面板上的自动零按钮，使 DRI 信号归零。在 FPLC 软件中工作，导航到手动，执行手动指令，设置标记，并插入蛋白质和运行的名称。将喷射阀从手动负载切换到在流道下喷射阀。通过将 0.5 秒脉冲插入 IO 盒脉冲数字输出，包括脉冲信号。这将触发 MALS 软件中的数据收集。现在，将示例注入循环。单击 FPLC 软件中的执行以开始实验运行。在 MALS 软件中的过程部分下逐步执行分析。通过检查基本集合视图，验证峰值在 UV、MALS 和 RI 中的表示体积是否大致相同。在基线视图中，定义所有信号的基线。在峰值视图中，通过单击并拖动鼠标定义要分析的峰值。选择每个峰值的 50% 的中心。首先选择单体峰值，然后选择二元峰。在每个峰值下，验证 BSA 在 280 纳米时 dn/dc 和消光系数的正确值。在过程对齐视图中，通过单击并拖动鼠标选择峰值的中心区域。单击对齐信号，然后确定。在程序中，带宽的视野，选择中央50%的单体峰。确保将折射率检测器指定为参考仪器。然后单击"执行拟合"，并应用以将 UV 和光散射信号与折射率信号匹配。放大峰值以验证它们在中央 50 到 70% 内非常紧密地重叠，然后单击"确定"。在过程、规范化视图中，选择峰值一。输入 3.0 纳米作为 RG 值，单击"规范化"，然后单击"正常"。在 EASI 图形视图中查看结果的图形。从窗口顶部的显示下拉列表中选择摩尔质量。使用控件、单击和拖动可放大峰值区域。要查看单体和二丁峰的最终制表权重平均摩尔质量结果，请导航到峰值结果、摩尔质量时刻、MW，然后选择结果，报表摘要。在峰值结果下报告纯度，质量分数。从文件菜单中，选择保存为方法，并保存分析的 BSA 数据作为未来测量所有类型的蛋白质的标准方法。分析中将传递为BSA确定的规范化和频带扩大参数。此处显示的是使用 200 安格斯特罗姆孔径排除列的 BSA 的 SEC-MALS 分析。色谱图轨迹被规范化为单体峰值，并偏移以保持清晰。指出了可以忽略的常见伪影，包括光散射信号开头附近的粒子峰，以及折射率信号中总渗透量附近的盐和溶解空气峰值。色谱图表现出出色的单体-三色-修剪器分离，光散射信号表现出高噪声信号。单体和二元重量平均摩尔质量值表现出高同质性。以下是低质量的 SEC-MALS 分析示例。在此示例中，75 Angstrom 孔径排除柱上的分离不足会导致 8 到 9 分钟的粒子峰值，这与蛋白质分离不当。在这里，信号与噪声比不足，在光散射信号中，与蛋白质相邻的大量粒子是明显的。获得良好的 SEC-MALS 结果的关键是选择适当的列，确保系统经过低光散射噪声校准，并预先过滤或离心样品以去除颗粒。在SEC-MALS之后，蛋白质样品可以进一步分析结合亲和力、生物利扎、表面表面质感、等温滴算、生物耐数量计、微尺度热泳或成分梯度、多角度光散射。蛋白质结构可以通过X射线晶体学、低温电子杂卓术或核磁共振术确定。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

在线体积排阻和离子交换色谱法SAXS光束线

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

科研

生物化学

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

方法可视化和用透射电子显微镜分析膜蛋白的相互作用

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

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Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

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Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

离子交换色谱 (IEX) 与多角度光散射 (ALS) 相结合, 用于蛋白质分离和表征

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Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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