Name: characterization of proteins by size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (sec-mals)
Uploaded: 2019-06-20T13:30:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS at JoVE.com

Vi takker Dr. Tsafi Danieli (Wolfson centre for Applied structural Biology, hebraisk University) for rådgivning og samarbejde. Vi takker også Daniel Biotech Ltd. (Rehovot, Israel) for bistand og etablering af analytiske FPLC-MALS system udnyttet i denne undersøgelse.

1. klargøring af systemet
<ol><li>Tilslut MALS og dRI-detektorer neden for FPL'ENS UV-detektor. Bypass pH-og ledningsevne detektorer, da de vil tilføje signifikant interdetektor volumen mellem UV og MALS detektorer. Brug kapillar slange på 0,25 mm id fra kolonnen til og mellem detektorerne og 0,75 mm id kapillar slange på outputtet af detektorerne til affald eller fraktion opsamler.</li>
	<li>Sørg for, at de nødvendige signal forbindelser mellem FPLC og detektorer er blevet fastlagt, herunder analog udgang fra UV-detektoren til den analoge MALS-indgang, og digital udgang fra fplc'en til de MALS-Auto indsprøjtningerne via fpl's I/O-boks.</li>
	<li>Installer en passende analytisk SEC-kolonne, der dækker et fraktionerings område på mindst 20 kDa til 500 kDa. Kontroller produktoplysningerne for at finde ud af, om kolonnen er velegnet til intervallet MW, pH og andre egenskaber for prøve-og mobil fasen.</li>
</ol>2. klargøring af buffer, f lushing systemet natten over og kontrol renholdelse
<ol><li>Ved hjælp af reagenser af HPLC-kvalitet forberedes 1 L phosphatbufferet saltvand med 50-100 mM NaCl. Filtrer bufferen til 0,1 μm ved hjælp af en flaske-Top-Polyether-sulfon filter eller lignende. De første 50-100 mL buffer filtreres til en affalds flaske og kasseres for at eliminere partikler fra de tørrefiltre, og derefter filtreres resten til en ren, steril flaske, der er blevet vasket grundigt med filtreret, afioniseret vand og begrænset for at forhindre støv fra at trænge ind. Bemærk: andre mobile fase opløsningsmidler såsom en Tris buffer kan anvendes, hvis yderligere proteiner, der fortrinsvis opløses i disse opløsningsmidler, skal analyseres.</li>
	<li>Skyl natten med en strømningshastighed på 0,5 mL/min, eller som det ellers anbefales af kolonne producenten, for at ækvilibrere kolonnen i bufferen og fjerne partikler. Brug FPLC'S kontinuerlige flow -tilstand, og sørg for, at flowet ikke stopper, før alle SEC-Mals-kørsler er fuldført.<ol>
<li>Placer dRI-flowcellen i Purge -tilstand i løbet af natten flush. Sluk for rensningen, før prøvekørsler påbegyndes.</li>
		<li>Ved start af flush, rampe gradvist strømningshastigheden for at forhindre "spalte afgivelse" effekt (eller frigivelse af partikler) forårsaget af en pludselig ændring af trykket i kolonnen.</li>
		<li>Hvis systemet er kendt for at være ganske stabilt og partikel-fri, og i ligevægt med den ønskede mobile fase, erstatte natten flush med en kortere, 2-3 h flush.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kontrollér systemets renhed ved let at tappe slangen neden for kolonnen for at frigive akkumulerede partikler og observere signalet i 90 °-detektoren på frontpanelets display af MALS-instrumentet. Kontroller, at top-til-peak-støjen ikke er mere end 50-100 μV.</li>
	<li>Udfør en ' blank ' injektion for at kontrollere, at injektoren er ren af partikler. En ' blank ' er simpelthen den løbende buffer, der tilberedes i et friskt, sterilt hætteglas.<ol>
<li>Hvis partikel toppunktet ikke er mere end 1 mL i volumen og højst 5 mV over baseline, er systemet klar til prøver. Ellers skal du udføre yderligere tomme injektioner, indtil den er ren, eller udføre vedligeholdelse for at rense injektoren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. klargøring og indlæsning af prøven
<ol><li>Der tilberedes mindst 200 μL BSA ved 1-2 mg/mL i SEC-bufferen. Bemærk: for at undgå udfældning bør BSA aldrig opløses i rent vand.</li>
	<li>Filtrer proteinet til 0,02 μm med et sprøjte spids filter.</li>
	<li>De første dråber filtrat kasseres for at fjerne partikler fra de tørrefiltre.</li>
	<li>Alternativt centrifugeres prøven ved 10.000 x g i 15 minutter for at muliggøre udfældning af ikke-opløselige aggregater og andre store partikler.</li>
	<li>Injicer 100 μL af BSA-opløsningen i løkken. Bemærk: Dette er den anbefalede mængde materiale, og mere eller mindre kan injiceres i henhold til omstændighederne i prøven, såsom stabilitet eller tilgængelighed. Den mængde protein, der kræves pr. injektion, varierer omvendt med molekylvægt-dobbelt så meget protein masse er nødvendig, hvis molekylvægten er 33 kDa, eller halvdelen af BSA.</li>
</ol>4. klargøring af MALS-softwaren
<ol><li>Åbn ny | Eksperimenter fra metode i menuen Mals-software, og vælg online -metoden fra mappen med lysspredning af system metoder. Hvis en DLS-detektor er til stede, skal du vælge online -metoden fra lysspredningen | Med QELS mappe.</li>
	<li>I afsnittet konfiguration skal du angive parametre for prøve-og mobil fasen.<ol>
<li>I generisk pumpe visning skal du indstille strømningshastigheden til den, der bruges i fplc.</li>
		<li>Vælg PBSi den generiske pumpe visning, opløsnings gren, navn felt.</li>
		<li>I injektor visningen, prøve gren, Indtast navnet som BSA, og sæt DN/DC = 0,185 (standardværdien for UMODIFICEREDE proteiner), a2 = 0, og UV-ekstinktionskoefficient = 0,667 ml/(mg-cm). Bemærk: for andre proteiner kan den UV280 nm ekstinktionskoefficient findes i litteraturen eller beregnes ud fra dens sekvens ved hjælp af forskellige offentlige-domæne software værktøjer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>I afsnittet procedurer , grundlæggende samling visning, skal du vælgeafkrydsningsfeltet Trigger på autoinjicere og indstille varigheden af løbe til 70 min, således at data indsamles for hele eluering indtil den totale gennemtrængning volumen af SEC kolonnen er nået. Bemærk: den nødvendige mængde tid kan variere med kolonne og strømningshastighed-35 min. af samlingen er påkrævet for en standard 7,8 mm x 300 mm HPLC-SEC kolonne ved 0,5 mL/min.</li>
	<li>Start eksperimentet i MALS-softwaren ved at klikke på knappen Kør . Den vil begynde at læse dataene efter at have modtaget impuls signalet fra FPLC-instrumentet via MALS-detektoren.</li>
	<li>Nul dRI-signalet ved at klikke på knappen Autozero på instrumentets frontpanel.</li>
</ol>5. klargøring af FPLC-softwaren
<ol><li>Indsæt navnet på proteinet og løbe i FPLC software, i manual | Udfør manuelle instruktioner | Sæt mærke.</li>
	<li>Skift Indsprøjtnings ventilen fra Manuel belastning for at injicere under strømnings kurve | Indsprøjtnings ventil.</li>
	<li>Medtag et impuls signal ved at indsætte en 0,5 s puls under i/O boks | Puls digital ud. Dette vil udløse dataindsamling i MALS software.</li>
</ol>6. Injicer prøven i sløjfen. Klik på Udfør i FPLC-softwaren for at starte eksperiment kørslen.
7. analyse af oplysninger om SEC-MALS BSA
<ol><li>Udfør analyse trin for trin under afsnittet procedurer i Mals-software.<ol>
<li>Kontroller, at toppene vises med omtrent samme elutions volumen i UV, MALS og RI, ved at kontrollere den grundlæggende samlings visning.</li>
		<li>Definer grundlinjen for alle signaler (alle LS-detektorer, UV og dRI) i visningen baseline . Basislinjerne skal defineres for at angive niveauet af rent opløsningsmiddel, som er at foretrække at strække sig fra den ene side af toppunkterne til den anden.</li>
		<li>I toppene kan du definere de toppe, der skal analyseres, ved at klikke og trække med musen. Vælg den midterste 50% af hver top. Vælg først monomer-toppen (' peak 1 ') og derefter dimer Peak (' peak 2 '). Kontrollér de korrekte værdier for DN/DC = 0,185 og UV 280 Nm ekstinktionskoefficient = 0,667 for BSA under hver top.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Udfør spids justering, bånd-udvidelse af korrektions-og normaliserings procedurer. Bemærk: normalt kalibreres SEC-MALS-metoden med jævne mellemrum til spids justering, udvidelse af båndet og normalisering af vinkel detektorerne til 90 °-detektoren ved hjælp af et mono Disperse-protein med radius af Gyration Rg &LT; 10 nm såsom BSA Monomer. I dette eksempel tjener BSA både som kalibrerings molekyle og er selv genstand for MW-analyse.<ol>
<li>I procedurerne | Justerings visning skal du vælge det centrale område af toppene ved at klikke og trække med musen, klikke på Juster signaler og derefter på OK.</li>
		<li>I procedurerne | Band udvide View, vælge den centrale 50% af monomer Peak. Sørg for, at RI-detektoren er specificeret som Reference instrument, og klik derefter på Udfør tilpasning og Anvend for at matche UV-og ls-signalerne til Ri-signalet.<ol>
<li>Zoom ind på toppene for at kontrollere, at de overlapper meget tæt i det centrale 50-70%, og klik derefter på OK.</li>
			<li>Hvis overlapningen ikke er perfekt, (det kan være nødvendigt at) udføre fit og "apply" en eller to gange mere, indtil overlapningen er fremragende.</li>
		</ol>
</li>
		<li>I procedurerne | Normaliserings visning, Vælg top 1, angiv 3,0 nm som Rg -værdi, klik på Normaliser og derefter OK.</li>
		<li>I procedurerne | Molar Mass og rg fra MALS visning, gennemgå dataene for at afgøre, hvilke, hvis nogen, afsløring vinkler bør fravælges fra analysen på grund af overdreven støj. Typisk vil disse være de lavere vinkler, hvori støvpartikler spreder en relativ høj intensitet. Vælg individuelle udsnit i toppene fra grafen til højre og se den kantede afhængighed af den inverse reducerede Rayleigh ratio i grafen til venstre. Hvis de laveste (og nogle gange de højeste) vinkler konsekvent afviger meget fra pasformen, så Fravælg dem fra listen nederst i visningen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Få vist grafen for resultaterne i EASI Graph -visningen. Vælg Molar Mass fra display drop-down øverst i vinduet. Brug CTRL + klik og træk for at zoome ind på topområdet.</li>
	<li>Se den endelige tabel vægt-gennemsnitlige molær masse resultater for monomer og dimer toppe i resultaterne | Rapport (oversigt) under spids resultater | Molære masse øjeblikke (g/mol) | På MW. Renhed rapporteres under spids resultater | Massefraktion (%). Bemærk: andre molære masse øjeblikke vises også; disse er sædvanligvis relevante for heterogene polymerer, men ikke for proteiner med diskrete størrelser. Mange andre resultater produceret af softwaren kan indgå i rapporten, såsom procent masse genvinding (den fraktion af protein, der elueret via koncentrationen detektor i forhold til den injicerede mængde), Peak statistik, polydispersity, Rg og Rh øjeblikke, osv. Når det er angivet, afspejler usikkerheds foranstaltningerne præcisionen af den anførte værdi på grundlag af støjen i måle serierne og bør ikke anses for at repræsentere nøjagtigheden. Den sande nøjagtighed af de rapporterede værdier afhænger af forskellige faktorer såsom nøjagtigheden af de angivne DN/DC og ekstinktionskoefficient værdier, instrument kalibrering, etc.</li>
	<li>I menuen filer skal du vælge Gem som metode og gemme de analyserede BSA data som en standardmetode til fremtidige målinger af alle typer af proteiner. De normaliserings-og bånd udvidede parametre, der er fastlagt for BSA, vil blive fremført i analysen.</li>
</ol>

DS er ansat hos Wyatt Technology Corporation, hvis produkter fra MALS anvendes i denne protokol. AT er ansat hos Danyel Biotech, en distributør af Wyatt MALS og AKTA FPLC instrumenter.

Eksperimentet SEC-MALS har givet god adskillelse af monomer, dimer og trimer og kvantitative resultater for de molære masser og hydrodynamiske størrelser for hver top. Dette til gengæld klart identificerer og kendetegner hver art til stede, samt kvantificering renhed. Normalt er de opnåede resultater nøjagtige til inden for 5%, og præcis og gentagelig til inden for 1-2%3,69. Dette niveau af præcision og repeterbarhed gør det muligt trygt at skelne mellem arter, der kan være tæt på MW, så længe de er adskilt af SEC (kan delvis overlappe inden for samme højdepunkt). Fordelene for protein kvalitetskontrol og grundlæggende biofysiske karakterisering er synlige.
Verifikation af fravær af partikler er ganske vigtigt for følsomme, gentagelige SEC-MALS målinger. Partikel toppe vises generelt som store MALS-signaler, der ikke er ledsaget af sammenlignelige UV-eller RI-signaler. Den mobile fase og prøve skal forberedes omhyggeligt for at eliminere sådanne partikler. Anvendelse af reagenser af HPLC-kvalitet eller bedre, filtrering af mobil fase og fortyndings buffer til 0,1-0,2 μm (forvask af filteret for at eliminere partikler, der altid er til stede på tørre membraner), vedligeholdelse af ekstra rene mobile fase flasker og andet glas til SEC-MALS og udvidet kolonne ligevægt under flow (for at fjerne partikler og aggregater, der kan have akkumuleret, når strømmen blev stoppet eller en kolonne ikke er i brug) er alle anbefales. Prøven filtreres til den mindste porestørrelse, der ikke fjerner det pågældende materiale, sædvanligvis ikke større end 0,1 μm og om muligt 0,02 μm. Hvis filteret hurtigt træger, kan prøven centrifugeres, filtreres i etaper af faldende porestørrelse og/eller genrenses. Når systemerne konsekvent vedligeholdes med frisk og filtreret Mobil fase af høj kvalitet, forhindres kolonne chok, prøverne er rene og ikke overholder kolonnen, målingerne vil ikke udvise den førnævnte partikel støj og vil give data af høj kvalitet.
MALS er agnostisk til typiske SEC-buffere for proteiner. mange andre buffer systemer udover PBS kan bruges til at optimere separation og stabilitet, herunder en række hjælpestoffer71. MALS er også agnostisk til den specifikke kolonne, som skal vælges for optimal separation og nyttiggørelse. De primære betænkeligheder for hjælpestoffer med hensyn til analyse er væsentlige ændringer i brydningsindekset, hvilket fører til modifikation af det specifikke brydningsindeks tilvækst DN/DC, og hjælpestoffer, der absorberer 280 Nm, når UV-analyse er nødvendig. For eksempel, arginin er en fælles aggregering-reducerende hjælpestoffer, der kan dramatisk påvirke DN/DC af et typisk protein, selv bringe det ind i den negative regime (et protein med negativ DN/DC kan stadig ANALYSERES af SEC-Mals hvis DN/ DC bestemmes empirisk, men hvis DN/DC = 0 intensiteten af lys spredt af proteinet vil være null og MW analyse vil være umulig). Emnet DN/DC værdier for proteiner diskuteres i udstrakt grad af Zhao et al.35 , hvor det er påvist, at for almindelige vandige buffere falder langt størstedelen af uændrede proteiner inden for 2-3% af standardværdien (0,185 eller 0,186 ml/g ved = 660 nm) , selvom proteiner under ~ 10 kDa er mere variable, og der er et par arter, der kan gå så højt som 0,21 mL/g.
MW-profilerne på tværs af BSA monomer og dimer toppe i de fremlagte data var begge helt homogene til inden for 2% eller derunder, hvilket indikerer mono Disperse arter. Ikke-ensartede MW-værdier over et højdepunkt kan opstå som følge af heterogenitet eller ukorrekt analyse. Navnlig kan en BSA MW-profil, der er konkave ("smil") eller konvekse ("grimasse"), skyldes, at den ikke har anvendt den udvidede korrektion korrekt. For andre proteiner kan en konvekse profil også opstå som følge af dynamisk ligevægt mellem monomerer og oligomerer, hvor forholdet mellem monomer og oligomer-og dermed den tilsyneladende MW-værdi-afhænger af peak-koncentrationen (BSA udviser ikke denne adfærd og bruges ofte kontrolprøve for at verificere korrekte bånd udvidelse parametre). En MW-profil, der varierer fra den førende til den bageste kant og ikke ændres med prøvekoncentration er typisk for en fordeling af molekylvægt arter, der er delvist løst ved SEC. dynamisk ligevægt adskiller sig let fra de andre kilder til tilsyneladende uhomogene fordelinger ved at injicere forskellige samlede mængder af protein-fordelingen vil variere med dynamisk ligevægt, men ikke med en fast fordeling eller ukorrekt bånd-udvidelse korrektion.
I betragtning af de begrænsninger, der er beskrevet ovenfor, er SEC-MALS ikke velegnet til forskellige opgaver. Den egner sig ikke til analyse af råprøver; prøverne skal være godt renset ved standard affinitet og polerings metoder. Det har ikke tilstrækkelig nøjagtighed eller opløsningskraft til at identificere mutanter og varianter af et protein eller mAb med samme eller meget tæt masse, og kan ikke anvendes med analysander, der ikke eluere fra eller adskilles på en SEC-kolonne, men for nylig har det vist sig, at ion-exchang e eller reverse-fase kromatografi kan kombineres med decimaler for at adskille og karakterisere arter, der ikke er løst ved SEC72,73,74. Hvis protein mængderne er stærkt begrænset, er SEC-MALS muligvis ikke gennemførlig, da det typisk kræver 10-200 μg3 , og der kan kræves endnu flere af et fplc-system med en indvendig diameter på mere end 0,25 mm. mindre mængder kan dog analyseres af UHPLC-SEC-MALS. Meget ustabile proteiner, der aggregeres ved Introduktion til den mobile fase er ikke egnet til SEC-MALS analyse, selvom buffer optimering ved hjælp off-line dynamisk lys spredning kan overvinde dette problem75.
På trods af den ekstra indsats, SEC-MALS indebærer, er det uvurderligt for proteinforskning og anvendes i udstrakt grad af de akademiske og biofarmaceutiske samfund. Ud over karakterisering af monomerer, oligomerer og aggregater som beskrevet i ovenstående protokol kan SEC-Mals karakterisere modificerede proteiner såsom glycoproteiner (bestemmelse af MW af proteinet og tykkere komponenterne enkeltvis), overfladeaktivt stof-eller lipid-solubiliserede membran proteiner (bestemmelse af MW af protein og opløseligheds komponenter), protein samlinger såsom viruslignende partikler, protein-protein og protein-nukleinsyre komplekser, polysaccharider, protein-polysaccharid konjugater, peptider og mange andre biomakromolekyler.

Pålidelig analyse af molekylvægten (MW) af proteiner i opløsning er afgørende for Biomolekylær forskning1,2,3,4. MW analyse informerer videnskabsmanden, hvis det korrekte protein er blevet produceret, og hvis det er egnet til brug i yderligere forsøg5,6. Som beskrevet på webstederne for protein forskningsnet P4EU7 og Arbre-mobieu8skal protein kvalitetskontrollen ikke blot karakterisere det færdige produkts renhed, men også dets oligomerisk tilstand, homogenitet, identitet, kropsbygning, struktur, ændringer efter oversættelse og andre egenskaber.
MW-måling i ikke-Denaturerings opløsning identificerer den form af proteinet, der er til stede i et vandigt miljø, hvad enten det drejer sig om monomerisk eller oligomerisk. Mens det for mange proteiner er målet at producere den monomerisk form, for andre en specifik indfødte oligomer er nøglen til biologisk aktivitet9,10,11,12. Andre oligomerer og ikke-indfødte aggregater er uønskede og vil føre til mangler i strukturel bestemmelse ved krystallografi, nuklear magnetisk resonans (NMR) eller lille-vinkel X-ray spredning, samt artefakter eller unøjagtigheder i funktionelle analyser til kvantificere binding ved isotermisk titrering Calorimetri eller overflade Plasmon resonans2,13.
I tilfælde af bioterapeutiske midler, såsom monoklonale antistoffer (mAbs), tjener den løsnings baserede MW-analyse et lignende formål med kvalitetskontrollen og produkt karakteriseringen. Overdreven aggregater og fragmenter er tegn på et ustabilt produkt, der ikke er egnet til human brug. Regulerende organer kræver omhyggelig karakterisering, ikke kun af det terapeutiske molekyle, men også potentielle nedbrydningsstoffer, der kan være til stede i det endelige produkt14,15,16,17.
Nogle af de mest udbredte metoder til analyse af protein MW er natriumdodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side), kapillar elektroforese (CE), indfødt side, massespektrometri (MS), size-udelukkelses kromatografi (SEC) og analytisk ultracentrifugering (AUC). Af disse er SDS-Page, CE og MS ikke udført i den oprindelige tilstand og typisk føre til afkobling af oligomerer og aggregater, derfor er ikke egnet til bestemmelse af den indfødte oligomer eller kvantificerer aggregater. Selv om Native PAGE gør, teoretisk, bevare den indfødte tilstand, i vores erfaring er det vanskeligt at optimere for mange proteiner, og resultaterne er ikke meget pålidelige. AUC, enten ved bundfældning hastighed eller bundfældning ligevægt, er kvantitativ og kan bestemme MW fra de første principper, men det er ganske besværligt, kræver meget manuel arbejdskraft og betydelig ekspertise i data fortolkning, lang eksperimentets tid og en meget dyrt instrument.
Analytisk SEC er en kvantitativ og relativt robust, enkel metode, der adskiller makromolekyler under strømning gennem en pakket kolonne. De principper og anvendelser af SEC er godt præsenteret i flere anmeldelser18,19,20 og i håndbogen "Size udelukkelse kromatografi: principper og metoder"21. Forskellene i fastholdelse skyldes forskellige mængder af tid brugt sprede ind og ud af porerne i den stationære fase, før eluere fra slutningen af søjlen. Forskellene opstår (nominelt) fra de relative størrelser og diffusions koefficienter af molekylerne22. En kalibreringskurve er konstrueret ved hjælp af en række reference molekyler, der relaterer MW af molekylet til eluering volumen. For proteiner er reference molekyler generelt velopførte, kugleformede proteiner, der ikke interagerer med kolonnen via ladning eller hydrofobe overflade rester. Elutions volumenet måles med en ultraviolet (UV) absorbans detektor. Hvis UV-ekstinktionskoefficienten er kendt-ofte beregnet ud fra sekvensen-kan den samlede totale masse af proteiner også kvantiteres.
Især er analysen af MW i SEC baseret på to hoved antagelser vedrørende de proteiner, der skal karakteriseres: 1) de deler med referencestandarderne samme kropsbygning og specifikke volumen (med andre ord det samme forhold mellem diffusions egenskaber og MW) og 2) som referencestandarder, de ikke interagerer med kolonnen undtagen ved sterisk egenskaber-de ikke overholder kolonne pakning ved opladning eller hydrofobe interaktioner. Afvigelser fra disse antagelser gør kalibreringskurven ugyldig og fører til fejlagtige MW-bestemmelser. Dette er tilfældet for egenuordnede proteiner, der har store Stokes radier på grund af deres omfattende ustrukturerede regioner23,24 eller ikke-sfæriske/lineære oligomere samlinger10. Glykosylerede proteiner vil generelt have en større Stokes radius end den ikke-glykosylerede form, selv når den tilføjede kulhydrat masse tages i betragtning19. Vaskemiddel opløselig membran proteiner eluerer anderledes end kalibrerings proteiner, fordi deres eluering fra SEC afhænger af den samlede størrelse af polypeptid-vaskemiddel-lipider kompleks snarere end oligomerisk tilstand og Molar masse af proteinet25 ,26. Kolonne kemi, ph-og salt forhold alle påvirker eluering mængder af proteiner med ladede eller hydrofobe overflade rester27,28.
SEC bliver meget mere alsidig og pålidelig til MW-bestemmelse, når den kombineres med lysspredning (Mals) og differentiale brydningsindeks (dRI)-detektorer3,4,11,29, 30,31,32. En dRI-detektor bestemmer koncentrationen baseret på ændringen i opløsningens brydningsindeks på grund af tilstedeværelsen af analysand. En MALS-detektor måler andelen af lys, der spredes af en analysand, i flere vinkler i forhold til hændelses laserstrålen. Kollektivt kendt som SEC-Mals, denne instrumentering bestemmer MW uafhængigt af eluering tid, da MW kan beregnes direkte fra de første principper ved hjælp af ligning 1,
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59615/59615eq1.jpg">1
hvor M er analysmens molekylvægt, R (0) den reducerede Rayleigh ratio (dvs. mængden af lys spredt af analysand i forhold til laser INTENSITETEN) bestemt af Mals-detektoren og ekstrapoleret til vinkel nul, c vægt koncentration, der bestemmes af UV-eller dRI-detektoren, DN/DC den refraktive indeks tilvækst af analysanden (hovedsagelig forskellen mellem det refraktive indeks for analysand og bufferen) og K en optisk konstant, der afhænger af Systemegenskaber såsom bølgelængde og opløsningsmiddel brydningsindeks29.
I SEC-MALS bruges SEC-kolonnen udelukkende til at adskille de forskellige arter i opløsningen, så de kommer ind i MALS-og koncentrations detektor cellerne enkeltvis. Den faktiske retentionstid har ingen betydning for analysen, undtagen for så vidt angår, hvor godt den løser protein arterne. Instrumenterne er kalibreret uafhængigt af kolonnen og er ikke baseret på referencestandarder. SEC-MALS betragtes derfor som en "absolut" metode til bestemmelse af MW fra grundlæggende fysiske ligninger. Hvis prøven er heterogen og ikke helt adskilt af kolonnen, vil den værdi, der gives ved hvert elueringsvolumen, være en vægt gennemsnit af molekylerne i hvert elueringsvolumen, der strømmer gennem flowcellen pr. tids skive, ca. 75 μL.
Ved analyse af den vinkelvariation af spredning intensitet, kan MALS også bestemme størrelsen (root-middel-kvadrat radius, Rg) af makromolekyler og nanopartikler med geometrisk radius større end omkring 12,5 nm29. For mindre arter såsom monomere proteiner og oligomerer kan et dynamisk lyssprednings modul (DLS) tilsættes til MALS-instrumentet for at måle hydrodynamiske radier fra 0,5 nm og op33.
Mens enten UV eller dRI koncentrations analyse kan give værdien af c i EQ. 1, brug af dRI foretrækkes af to grunde: 1) DRI er en universel koncentrations detektor, velegnet til analyse af molekyler såsom sukker eller polysaccharider, der ikke indeholder en UV kromoforen34; og 2) koncentrationen respons DN/DC af næsten alle rene proteiner i vandig buffer er den samme til inden for en eller to procent (0,185 ml/g)35, så der er ingen grund til at kende UV-ekstinktionskoefficienten.
Brugen af SEC-MALS i proteinforskning er ganske omfattende. Langt de mest almindelige anvendelser er at fastslå, om et renset protein er monomere eller oligomere og graden af oligomerisering, og vurdere aggregater3,10,11,17, 31af36,37,38. Evnen til at gøre det for vaskemiddel-solubilized membran proteiner, der ikke kan karakteriseres ved traditionelle midler er især værdsat, og detaljerede protokoller for dette er blevet offentliggjort31,39,40 , 41 af , 42 af , 43. andre almindelige anvendelser omfatter fastsættelse af graden af post-translationel modifikation og polydispersitet af glycoprotein, lipoproteiner og lignende konjugater4,31,44 , 45 af , 46 af , 47; dannelsen (eller mangel på samme) og absolutte støkiometri (i modsætning til støkiometrisk ratio) af heterokomplekser, herunder protein-protein, Protein-nukleinsyre og protein-polysaccharid komplekser24,46, 48,49,50,51,52; bestemmelse af monomer-dimer ligevægts dissociations konstanten49,53,54; og evaluering af protein konformation55,56. Ud over proteiner er SEC-Mals uvurderlig for karakterisering af peptider57,58, stort set heterogene naturlige polymerer såsom hepariner59 og chitosans60,61, små vira62 og de fleste typer af syntetiske eller forarbejdedepolymerer 63,64,65,66. En omfattende bibliografi kan findes i litteraturen67 og online (på http://www.Wyatt.com/bibliography).
Her præsenterer vi en standardprotokol til at køre og analysere et SEC-MALS eksperiment. Bovint serumalbumin (BSA) er præsenteret som et eksempel for separation og karakterisering af protein monomerer og oligomerer. BSA-protokollen bestemmer visse system konstanter, der tjener som grundlag for yderligere SEC-MALS analyser, herunder af komplekser, glycoproteiner og overfladeaktive membran proteiner.
Vi bemærker, at SEC-MALS kan udføres ved hjælp af standard højtydende væskekromatografi (HPLC) eller hurtig protein væskekromatografi (FPLC) udstyr fra mange leverandører. Denne protokol beskriver brugen af et FPLC-system, der almindeligvis findes i laboratorier, der producerer proteiner til forskning og udvikling (Se tabel over materialer). Før protokollen køres, skal FPLC-systemet, MALS og dRI-detektorer være installeret sammen med deres respektive softwarepakker til kontrol, dataopsamling og-analyse pr. fabrikanters instruktioner og eventuelle påkrævede kalibrerings konstanter. eller andre indstillinger, der er indtastet i softwaren. Der skal anbringes et indbygget filter mellem pumpen og injektoren med en hydrofilt, 0,1 μm pore membran installeret.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:770px;" width="770">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">AKTA pure</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">29-0182-26</td>
			<td style="width:242px;">fast protein liquid chromatograph (FPLC)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">AKTA UNICORN</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>FPLC control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">ASTRA</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td></td>
			<td>MALS data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Bovine serum albumine (purity &#62;97%)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A1900</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">DAWN or miniDAWN</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:123px;">WH2 or WTREOS</td>
			<td>multi-angle light scattering (MALS) detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Increase 200 10/300</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>size exclusion column, 200 &#197; pores, 10 mm i.d., 300 mm length</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Optilab</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:123px;">WTREX</td>
			<td>differential refractive index (RI) detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Sodium chloride NaCl</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:123px;">71382</td>
			<td>HPLC grade NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 &#181;m 1000 mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SCVPU11RE</td>
			<td>mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-1002</td>
			<td>sample filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 &#181;m pore, 10 mm diameter</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-1012</td>
			<td>sample filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-2012</td>
			<td>mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">WyattQELS</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td>WIQ</td>
			<td>dynamic light scattering detector</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of proteins by size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (sec-mals)

Analytisk størrelse-udelukkelses kromatografi (SEC), der almindeligvis anvendes til bestemmelse af molekylvægten af proteiner og protein-protein komplekser i opløsning, er en relativ teknik, der er afhængig af analyteens elueringsvolumen for at estimere Molekylær Vægt. Når proteinet ikke er kugleformet eller undergår ikke-ideelle kolonne interaktioner, er kalibreringskurven baseret på protein standarder ugyldig, og molekylvægten bestemt fra elueringvolumen er ukorrekt. Multi-vinkel lys spredning (MALS) er en absolut teknik, der bestemmer molekylvægten af en analysand i opløsning fra grundlæggende fysiske ligninger. Kombinationen af SEC for separation med MALS til analyse udgør et alsidigt, pålideligt middel til karakterisering af opløsninger af en eller flere protein arter, herunder monomerer, indfødte oligomerer eller aggregater, og heterokomplekser. Da målingen foretages ved hvert elutions volumen, kan SEC-MALS bestemme, om en eluering peak er homogen eller heterogen og skelne mellem en fast molekylvægt fordeling kontra dynamisk ligevægt. Det er også muligt at analysere modificerede proteiner såsom glycoproteiner eller lipoproteiner eller konjugater såsom opløsningsmidler, der er opløselig for opvaskemiddel. Derfor er SEC-MALS et vigtigt værktøj for protein kemikeren, der skal bekræfte de biofysiske egenskaber og opløsningens opførsel af molekyler, der produceres til biologisk eller bioteknologisk forskning. Denne protokol for SEC-MALS analyserer molekylvægten og størrelsen af rene protein monomerer og aggregater. De indsamlede data tjener som grundlag for yderligere SEC-MALS analyser, herunder for komplekser, glycoproteiner og overfladeaktive membran proteiner.

Figur 1a, b viser, at tre oligomere former for BSA: monomer, dimer og trimer, var godt adskilte på 200 å pore kolonne med baseline opløsning af monomer og dimer, mens figur 2a viser, at adskillelsen på en 75 Å pore kolonne ikke opnå god monomer-dimer opløsning. Sidstnævnte eksempel blev medtaget for at illustrere et "dårligt" resultat; disse forskelle i adskillelsen for de to søjler kan faktisk forventes i henhold til fabrikantens angivne adskillelses intervaller. Trimeren er ikke helt adskilt fra dimer og højere oligomerer er ikke godt adskilt fra trimeren og hinanden. Figur 2b er et eksempel på støjende lyssprednings signal med partikler til stede i hele kromatogrammet, hvilket udelukker nøjagtig måling af MW.
Nu fokuserer vi på figur 1b. Monomer, der eluerer ved 13,8 mL, udviser en vægt-gennemsnitlig molær masse Mw af 64,1 ± 0,4 KDA bestemt af Mals og Hydrodynamisk radius Rh af 3,54 ± 0,01 nm. Disse resultater er i overensstemmelse med sekvens massen og den kendte hydrodynamiske radius for henholdsvis BSA, 66,4 kDa og 3,5 nm68, til inden for den sædvanlige nøjagtighed af SEC-Mals, 5%3,69. Dimeren, som elueret ved 12 mL, udviste en Mw -værdi på 127 ± 1 KDA bestemt af Mals-som forventet, det dobbelte af monomer til eksperimentel præcision-og Rh af 5,68 ± 0,06 nm. Trimertoppen blev også observeret ved 11 mL med Mw af 194 ± 9 KDA bestemt af Mals, tre gange så meget som monomeren inden for eksperimentel præcision som forventet. R h af trimeren ikke kunne bestemmes på grund af lav intensitet af DLS-signalet.
De molære masse punkter, der beregnes på tværs af monomer toppen, er ensartede til inden for 2-5%, hvilket indikerer homogenitet. Det er ikke usædvanligt at finde en efterfølgende skulder med molær masse i intervallet 38-50 kDa, svarende til BSA fragmenter70. De molære masse punkter på tværs af dimeriske og trimeriske toppe er ikke ensartet, hvilket indikerer heterogenitet. Den dimer peak er noget heterogen på grund af spor af trimer, der bløder ind i dimer peak, og trimer peak er heterogen på grund af co-eluering af dårligt løste højere oligomerer.
Signal-støjniveauet for monomer toppen er helt acceptabelt i alle tre signaler, over 100:1, som det er dimer peak med signal-støj af 40:1. Kromatogram regioner ud over protein toppene er flade, med undtagelse af en top på grund af partikler nær den totale udelukkelse (void) volumen i ls spor og en (positiv) salt peak og en (negativ) opløst luft Peak i dRI spor, nær den totale gennemtrængning Volumen. Disse er anført i figur 1a.
Renhedsgraden kan også beregnes i et eksperiment med SEC-MALS: massefraktion af den monomeriske top i rapporten repræsenterer den procentvise renhed af den monomere form. Den beregnede renhed for BSA-monomer er 88%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig1.jpg"> Figur 1 : SEC-Mals analyse af bovint serumalbumin (BSA) ved hjælp af en 200 Å porestørrelse-eksklusions kolonne. Kromatogram spor normaliseret til monomer toppen og offset for klarhed. (A) fælles artefakter, der kan ignoreres, er påpeget, herunder en partikel spids nær begyndelsen af det lyssprednings signal samt salt og opløst luft toppe nær den totale gennemtrængning volumen i brydningsindeks signalet. B) kromatogrammet udviser fremragende adskillelse af monomer-dimer-trimer, og lyssprednings signalet udviser høj signal-støj. Monomer-og dimer MW-værdierne udviser høj homogenitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig2.jpg"> Figur 2 : Eksempler på SEK-Mals-analyser af lav kvalitet. Kromatogram spor normaliseret til monomer toppen og offset for klarhed. A) utilstrækkelig adskillelse af en kolonne til udelukkelse af 75 Å porestørrelse en partikel peak mellem 8-9 min er ikke godt adskilt fra proteinerne. (B) utilstrækkeligt signal-støj-forhold og omfattende partikler, der støder op til proteinerne, fremgår af lyssprednings signalet (LS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS at JoVE.com

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Denne protokol beskriver kombinationen af størrelses udelukkelse kromatografi med multi-vinkel lys spredning (SEC-MALS) for absolut karakterisering af proteiner og komplekser i opløsning. SEC-MALS bestemmer molekylvægten og størrelsen af rene proteiner, indfødte oligomerer, heterokomplekser og modificerede proteiner såsom glycoproteiner.

Karakterisering af proteiner efter størrelse-eksklusions kromatografi koblet til multi-vinkel Light spredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

SEC-MALS er en kvantitativ metode til bestemmelse af den molekylære vægt, størrelse og kropsbygning af makromolekyler i opløsning. Det kan identificere oligomerer og komplekser, og karakterisere vanskelige prøver, ligesom glycoproteiner og membran proteiner. SEC-MALS er en absolut metode.Det bygger på grundlæggende fysik, og afhænger ikke af samarbejde mod molekylære standarder, molekylets kropsbygning, eller hvordan vi interagerer med separationsmediet. SEC-MALS kan anvendes på mange systemer, der er adskilt af sek. Fra peptider og små polymerer til proteiner, nukleocapsids, polysaccharider, syntetiske polymerer, viruslignende partikler og små vira.Det er vigtigt at kontrollere, at dit system og buffere går glip af leverandørens anbefalinger for lavt partikelindhold. Rådfør dig med leverandørens tekniske supportrepræsentant for at være sikker. Begynd denne procedure med forberedelse af SEC-MALS-systemet som beskrevet i tekstprotokollen.Ved hjælp af hver PLC-grade reagenser, forberede en liter fosfat-buffered saltvand med 50 til 100 millimolar natriumchlorid. Filtrer bufferen til 0,1 mikron ved hjælp af et flasket polyethercelleskumfilter eller lignende. De første 50-100 milliliter buffer filtreres til en affaldsflaske for at fjerne partiklerne fra de tørre filtre.Derefter filtreres resten til en ren, steril flaske, der tidligere er blevet vasket med filtreret, deioniseret vand og holdes for at forhindre støv i at trænge ind. Kolonnen skylles natten over med en strømningshastighed på 0,5 milliliter pr. minut for at bringe kolonnen i bufferen i ligevægt og fjerne partikler. Brug FPLC's kontinuerlige flowtilstand, og sørg for, at flowet ikke stopper, før alle SEC-MALS-kørsler er fuldført.Placer DRI-flowcellen i rensetilstand under nattens træk. Når du begynder at skylle, skal du gradvist rampe strømningshastigheden for at forhindre kolonnens afgivelseseffekt, forårsaget af en pludselig trykændring i kolonnen. Slå udrensningen fra, før du begynder at prøvekørsler.Kontroller systemets renlighed ved let at banke slangen nedstrøms for kolonnen for at frigive akkumulerede partikler. Overhold signalet i 90 graders detektor på FRONTpanelets display på MALS-instrumentet. Kontroller, at top-til-top støj ikke er mere end 50-100 mikrovolt.Kontroller også, at brydningsindekset eller RI-signalet er stabilt til mindre end 1 gange ti til minus syv brydningsindeksenheder. Udfør en blindprøve for at kontrollere, at injektoren er ren for partikler. En tom er simpelthen den løbende buffer tilberedt i et friskt, sterilt hætteglas.Hvis partikeltoppen ikke er mere end en milliliter i volumen, og der ikke er mere end fem millivolt over baseline, er systemet klar til prøver. Ellers skal du udføre yderligere blindprøver, indtil de er rene, eller udføre vedligeholdelse for at rengøre injektoren. Nu, forberede mindst 200 mikroliter af BSA på en til to milligram per milliliter i SCC buffer.Filtrer proteinet til 02 mikron ved hjælp af et sprøjtespidsfilter. Kassér de første par dråber filtrat for at fjerne partikler fra de tørre filtre. Alternativt centrifuges prøven ved 10.000 gange G i femten minutter for at muliggøre udfældning af ikkeopløselige aggregater og andre store partikler.Derefter injiceres 100 mikroliter af BSA-opløsningen i løkken. Åbn nyt eksperiment fra metoden i MALS-softwaremenuen. Vælg derefter onlinemetoden i mappen med lyssp scattering-systemmetoder.Hvis der findes en DLS-detektor, skal du vælge onlinemetoden fra lyssprænden med QELS-mappen. Angiv parametre for eksempel- og mobilfasen i konfigurationsafsnittet. I den generiske pumpevisning skal du indstille strømningshastigheden til den, der anvendes i FPLC.Gå derefter til den generiske pumpevisning, opløsningsmiddelgren, navnefelt, og vælg PBS. Angiv navnet som BSA i injektorvisningen. Indstil dn/dc til 0,185, sæt A2 til 0, og indstil UV Extinction Coefficienten til 0,667 milliliter pr. milligram centimeter.Markér afkrydsningsfeltets udløser ved automatisk injicering i afsnittet procedurer, grundlæggende samlingsvisning. Angiv varigheden af kørslen til 70 minutter, så der indsamles data for hele allusionen, indtil den samlede gennemtrængevolumen for SEK-kolonnen er nået. Start eksperimentet i MALS-softwaren ved at klikke på kørselsknappen.Den vil begynde at aflæse dataene efter at have modtaget pulssignalet fra FPLC-instrumentet via MALS-detektoren. Nul på DRI-signalet ved at klikke på auto-nul-knappen på instrumentets frontpanel. Arbejde i FPLC software, navigere til manuel, udføre manuelle instruktioner, sæt mærke, og indsætte navnet på det protein og køre.Skift injektionsventilen fra manuel belastning for at injicere, under flow sti, injektionsventil. Medtag et pulssignal ved at indsætte en puls på 0,5 sekunder under IO-boksens puls digitalt. Dette vil udløse dataindsamling i MALS-softwaren.Sprøjt prøven ind i løkken. Klik på udfør i FPLC-softwaren for at starte eksperimentkørslen. Udfør analyse trin for trin under afsnittet procedurer i MALS-softwaren.Kontroller, at toppe vises ved omtrent samme allusionvolumen i UV, MALS og RI ved at kontrollere den grundlæggende samlingsvisning. Definer referencelinjen for alle signaler i grundvisningen. I visningen toppe skal du definere de toppe, der skal analyseres, ved at klikke og trække med musen.Vælg de centrale 50 % af hver spidsbelastning. Vælg først monomertoppen, og derefter den svagere top. Under hver top kontrolleres de korrekte værdier dn/dc og udryddelseskoefficient ved 280 nanometer for BSA.Vælg det centrale område af toppene i procedurerne ved at klikke på og trække med musen. Klik på juster signaler, og okay. I de procedurer, band udvidelse visning, skal du vælge den centrale 50% af monomer peak.Sørg for, at brydningsindeksdetektoren er angivet som referenceinstrumentet. Klik derefter på perform fit, og anvend for at matche UV- og lysspiskesignalerne til brydningsindekssignalet. Zoom ind på toppene for at kontrollere, at de overlapper meget tæt inden for den centrale 50 til 70%, og klik derefter okay.Vælg top i procedurer, normaliseringsvisning. Indtast 3,0 nanometer som RG-værdien, klik på normaliser, og klik derefter på okay. Få vist grafen over resultaterne i EASI-grafvisningen.Vælg molarmasse på displayets rullemenu øverst i vinduet. Brug kontrolelement, klik og træk for at zoome ind i topområdet. For at se den endelige tabulerede vægt gennemsnitlige molar masse resultater for monomer og dimer toppe, navigere til peak resultater, molar masse øjeblikke, MW, og vælg til resultaterne, rapport resumé.Renhed er rapporteret under peak resultater, masse fraktion. Vælg Gem som metode i filmenuen, og gem de analyserede BSA-data som en standardmetode til fremtidige målinger af alle typer proteiner. De normaliserings- og båndforvidende parametre, der bestemmes for BSA, vil blive fremført i analysen.Vist her er SEC-MALS analyser af BSA, ved hjælp af en 200 Ångstrøm pore størrelse udelukkelse kolonne. Chromatogram spor er normaliseret til monomer peak, og offset for klarhedens skyld. Fælles artefakter, der kan ignoreres, påpeges, herunder en partikeltop nær begyndelsen af lyssp spredesignalet, samt salt og opløste lufttoppe nær det samlede gennemtrængningsvolumen i brydningsindekssignalet.Kromatogrammet udviser fremragende monomer-dimer-trimer adskillelse, og lysspørlesignalet udviser højt signal til støj. Monomer- og dimervægts gennemsnitlige molarmasseværdier udviser høj homogenitet. Her er eksempler på SEC-MALS-analyser af lav kvalitet.I dette eksempel resulterer utilstrækkelig adskillelse på en 75 Angstrom pore størrelse udelukkelse kolonne i en partikel top mellem otte til ni minutter, der ikke er godt adskilt fra proteiner. Her er der et utilstrækkeligt signal til støjforhold, og omfattende partikler ved siden af proteinerne er synlige i lyssp spredesignalet. Tasterne til gode SEC-MALS-resultater vælger en passende kolonne, der sikrer, at systemet er kalibreret med lav lysspiststøj, og forfiltrer eller centrifugerer prøverne for at fjerne partikler.Efter SEC-MALS kan proteinprøver analyseres yderligere for bindende affinitet, bioliza, overfladeplasmonresonans, isotermisk titreringskaloritri, bioleridphorometri, mikroskalateroforese eller sammensætningsgradient, multivinkel lysspredning. Proteinstrukturen kan bestemmes ved røntgenkrystallografi, kryoelektronikfejl eller NMR.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Size-udelukkelse og ionbytningskromatografi på en SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskellige dimensioner ved hjælp af automatiseret krystallisering kombineret med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionbytning kromatografi (IEX) koblet til multi-vinkel lysspredning (MALS) for Protein adskillelse og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifikation af inositol fosfat eller Phosphoinositide interagerende proteiner ved affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support