Name: characterization of proteins by size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (sec-mals)
Uploaded: 2019-06-20T13:30:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS at JoVE.com

Wij danken Dr. Tsafi Danieli (Wolfson centrum voor toegepaste structurele biologie, Hebreeuwse Universiteit) voor advies en samenwerkingen. Wij danken Daniel Biotech Ltd (de heer, Israël) voor de hulp en de oprichting van de analytische FPLC-MALS systeem gebruikt in deze studie.

1. voorbereiding van het systeem
<ol><li>Sluit de MALS en dRI detectoren stroomafwaarts van de FPLC UV-detector. Bypass de pH en geleidbaarheid detectoren, omdat zij zal significante interdetector volume toe te voegen tussen de UV-en MALS detectoren. Gebruik capillaire slang van 0,25 mm id van de kolom naar en tussen de detectoren, en 0,75 mm id capillaire slang op de output van de detectoren te verspillen of fractie verzamelaar.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de nodige signaalverbindingen tussen de FPLC en detectoren zijn vastgesteld, met inbegrip van analoge uitgang van de UV-detector naar de MALS analoge ingang, en digitale uitgang van de FPLC naar de MALS autoinject, via de FPLC I/O Box.</li>
	<li>Installeer een geschikte analytische SEC-kolom met een breuk bereik van ten minste 20 kDa tot 500 kDa. Controleer het productinfo om te bepalen of de kolom geschikt is voor het bereik van MW, pH en andere eigenschappen van het monster en mobiele fase.</li>
</ol>2. voorbereiding van de buffer, f weelderige het systeem 's nachts en het controleren van reinheid
<ol><li>Met behulp van HPLC-grade reagentia, bereid 1 L van fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 50-100 mM NaCl. Filter de buffer op 0,1 µm met behulp van een fles-top polyether sulfon filter of iets dergelijks. Filter de eerste 50-100 mL buffer op een afval fles en gooi, om deeltjes uit de droge filters te elimineren, en filtreer vervolgens de rest naar een schone, steriele fles die grondig is gewassen met gefilterd, de-geioniseerd water en afgetopt om te voorkomen dat stof uit te voeren. Opmerking: andere mobiele fase oplosmiddelen zoals een tris buffer kunnen worden gebruikt als extra eiwitten die bij voorkeur opgelost in deze oplosmiddelen worden geanalyseerd.</li>
	<li>Spoel 's nachts met een debiet van 0,5 mL/min, of zoals anderszins aanbevolen door de kolom fabrikant, om de kolom in de buffer te equilibrate en deeltjes te verwijderen. Gebruik de continue stroom modus van de FPLC en zorg ervoor dat de stroom niet stopt totdat alle SEC-MALS-runs zijn voltooid.<ol>
<li>Plaats de dRI flow cel in Purge modus tijdens de nachtelijke flush. Zet de zuivering uit voor het begin van het monster wordt uitgevoerd.</li>
		<li>Bij het begin van de flush, geleidelijk oprit het debiet te voorkomen "kolom vergieten" effect (of het vrijkomen van deeltjes) veroorzaakt door een plotselinge verandering van druk in de kolom.</li>
		<li>Als het systeem is bekend dat het vrij stabiel en deeltjes vrij, en in evenwicht met de gewenste mobiele fase, vervangt u de overnachting flush met een korter, 2-3 h flush.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controleer het systeem reinheid door licht te tikken op de slang stroomafwaarts van de kolom om geaccumuleerde deeltjes vrij te geven en het observeren van het signaal in de 90 ° detector op de front-panel display van de MALS instrument. Controleer of het piek-tot-piek geluid niet meer is dan 50-100 µV.</li>
	<li>Voer een ' blanco ' injectie om te verifiëren dat de injector schoon is van deeltjes. Een ' blanco ' is gewoon de running buffer, bereid in een frisse, steriele flacon.<ol>
<li>Als de deeltjes piek niet meer dan 1 mL in volume en niet meer dan 5 mV boven basislijn is, dan is het systeem klaar voor steekproeven. Anders, voer extra lege injecties tot schoon, of voer onderhoud uit om de injector schoon te houden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. voorbereiden en laden van het monster
<ol><li>Bereid ten minste 200 µ L van BSA op 1-2 mg/mL in de SEC buffer. Nota: om precipitatie te verhinderen, zou BSA nooit in zuiver water moeten worden opgelost.</li>
	<li>Filter het eiwit op 0,02 µm met behulp van een spuit-Tip filter.</li>
	<li>Gooi de eerste paar druppels filtraat om deeltjes uit de droge filters te elimineren.</li>
	<li>Alternatief, Centrifugeer het monster bij 10.000 x g 15 min om precipitatie van niet oplosbare complexen en andere grote deeltjes toe te laten.</li>
	<li>Injecteer 100 µ L van de BSA oplossing in de lus. Opmerking: dit is de aanbevolen hoeveelheid materiaal, en meer of minder kan worden geïnjecteerd op basis van omstandigheden van het monster, zoals stabiliteit of beschikbaarheid. De hoeveelheid proteïne die per injectie wordt vereist varieert omgekeerd met moleculair gewicht-tweemaal zo veel eiwitmassa is nodig als het moleculaire gewicht 33 kDa is, of de helft die van BSA.</li>
</ol>4. voorbereiding van de MALS software
<ol><li>Open Nieuw | Experimenteer vanuit de methode in het MALS software menu en selecteer de online methode in de map met licht verspreidende systeem methoden. Als een DL'S detector aanwezig is, selecteert u de online methode van de Light verstrooiing | Met QELS map.</li>
	<li>In de configuratie sectie, Stel parameters van het monster en mobiele fase.<ol>
<li>Stel in de algemene pomp weergave de stroomsnelheid in op de FPLC.</li>
		<li>In de generieke pomp weergave, solvent Branch, naam veld, selecteert u PBS.</li>
		<li>In de injector te bekijken, monster Branch, voer de naam als BSA, en stel DN/DC = 0,185 (de standaardwaarde voor ongewijzigde eiwitten), a2 = 0, en UV-extinctiecoëfficiënt = 0,667 ml/(mg-cm). Opmerking: voor andere eiwitten, de UV280 nm extinctiecoëfficiënt kan worden gevonden in de literatuur of berekend uit de volgorde met behulp van verschillende Public-Domain software tools.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In de sectie procedures , basiscollectie weergave, selecteert u de checkbox trigger op autoinjecteren en stel de duur van de run op 70 min, zodat de gegevens worden verzameld voor de gehele elutie tot het totale doordringen volume van de SEC kolom is bereikt. Nota: de noodzakelijke hoeveelheid tijd kan met kolom en stroomtarief variëren-35 min van inzameling is vereist voor een norm 7,8 mm x 300 mm HPLC-SEC kolom bij 0,5 mL/min.</li>
	<li>Start het experiment in de MALS software door te klikken op de knop uitvoeren . Het zal beginnen met het lezen van de gegevens na ontvangst van het puls signaal van de FPLC instrument via de MALS detector.</li>
	<li>Zero het dRI-signaal door te klikken op de autozero-knop op het voorpaneel van het instrument.</li>
</ol>5. voorbereiding van de FPLC software
<ol><li>Plaats de naam van het eiwit en de run in de FPLC software, in de handleiding | Handmatige instructies uitvoeren | Teken instellen.</li>
	<li>Schakel de injectie klep van handmatige belasting te injecteren onder flow Path | Injectie ventiel.</li>
	<li>Inclusief een puls signaal door het invoegen van een 0,5 s Pulse onder I/O Box | Pulse digitaal uit. Dit zal leiden tot het verzamelen van gegevens in de MALS software.</li>
</ol>6. Injecteer het monster in de lus. Klik op uitvoeren in de FPLC software om het experiment te starten.
7. analyse van de SEC-MALS BSA gegevens
<ol><li>Voeranalyse, stap voor stap, in het kader van de procedures sectie in MALS software.<ol>
<li>Controleer of pieken worden weergegeven, op ongeveer hetzelfde elutie volume in UV, MALS en RI, door de basis verzamelings weergave te controleren.</li>
		<li>Definieer in de basislijn weergave de basislijn voor alle signalen (alle ls-detectoren, UV en dRI). De basislijnen moeten worden gedefinieerd om het niveau van zuiver oplosmiddel, de voorkeur stretching van de ene kant van de steekproef pieken aan de andere aan te geven.</li>
		<li>Definieer in de weergave pieken de pieken die moeten worden geanalyseerd door de muis te klikken en te slepen. Selecteer het centrale 50% van elke piek. Selecteer eerst de monomeer Peak (' Peak 1 ') en vervolgens de dimeer Peak (' Peak 2 '). Controleer de juiste waarden van DN/DC = 0,185 en UV 280 nm extinctiecoëfficiënt = 0,667 voor BSA onder elke piek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer Peak Alignment, band-verbreding correctie en normalisatieprocedures. Nota: normaal wordt de SEC-MALS methode periodiek gekalibreerd voorpiek groepering, band het verbreden en normalisatie van de hoekige detectors aan de detector 90 ° gebruikend een monodispers proteïne met straal van Gyration Rg &LT; 10 nm zoals BSA Monomeer. In dit voorbeeld, dient BSA zowel als de kalibratie-molecuul en is zelf het onderwerp van MW-analyse.<ol>
<li>In de procedures | Uitlijning weergave, selecteert u de centrale regio van de pieken door te klikken en te slepen met de muis, klik op Uitlijnen signalen en vervolgens op OK.</li>
		<li>In de procedures | Band verbreding, kiest u de centrale 50% van de monomeer piek. Zorg ervoor dat de RI-detector is opgegeven als het referentie-instrument, klik op uitvoeren fit en van toepassing zijn op de UV-en LS-signalen overeenkomen met de RI-signaal.<ol>
<li>Zoom in op de pieken om te controleren of ze elkaar overlappen zeer nauw binnen de centrale 50-70%, klik op OK.</li>
			<li>Als de overlapping is niet perfect, (het kan nodig zijn om) het uitvoeren van de fit en "Apply" een of twee keer tot de overlap is uitstekend.</li>
		</ol>
</li>
		<li>In de procedures | Normaliseren bekijken, selecteert u Peak 1, voer 3,0 nm als de Rg -waarde, klik op normaliseren dan OK.</li>
		<li>In de procedures | Maal massa en RG van MALS bekijken, herziening van de gegevens om te bepalen welke, indien aanwezig, detectie hoeken moeten worden uitgeschakeld uit de analyse als gevolg van buitensporige ruis. Typisch, zullen deze de lagere hoeken zijn waarin de stofdeeltjes een vrij hoge intensiteit verstrooien. Selecteer afzonderlijke segmenten binnen de toppen van de grafiek aan de rechterkant en Bekijk de hoekige afhankelijkheid van de inverse verminderde Rayleigh ratio in de grafiek aan de linkerkant. Als de laagste (en soms de hoogste) hoeken consequent sterk afwijken van de pasvorm, dan deselecteren ze uit de lijst aan de onderkant van de weergave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De grafiek van de resultaten weergeven in de EASI grafiek weergave. Selecteer Kies massa in de vervolgkeuzelijst weergeven boven in het venster. Gebruik CTRL + klik en sleep om in te zoomen op het Peak-gebied.</li>
	<li>Bekijk de laatste tabel gewicht-gemiddelde maal massa resultaten voor het monomeer en dimeer pieken in de resultaten | Rapport (samenvatting) weergave onder piek resultaten | Maal massa ogenblikken (g/mol) | MW. Zuiverheid wordt gerapporteerd onder piek resultaten | Massa fractie (%). Nota: andere maal massa ogenblikken worden ook getoond; Deze zijn meestal relevant voor heterogene polymeren, maar niet om eiwitten met discrete maten. Veel andere resultaten geproduceerd door de software kan worden opgenomen in het rapport, zoals procent massa herstel (de Fractie van eiwitten die geëlueerd via de concentratie detector ten opzichte van het bedrag geïnjecteerd), Peak statistieken, polydispersie, Rg en Rh momenten, enz. Op voorwaarde dat de maatregelen van onzekerheid weerspiegelen de precisie van de waarde aangehaald op basis van het geluid binnen de meting serie en mag niet worden beschouwd als de nauwkeurigheid te vertegenwoordigen. De werkelijke nauwkeurigheid van de gerapporteerde waarden hangt af van verschillende factoren, zoals de nauwkeurigheid van de verstrekte DN/DC en extinctiecoëfficiënt waarden, instrument kalibratie, enz.</li>
	<li>In het menu bestand , selecteert u Opslaan als methode en sla de geanalyseerde BSA gegevens als een standaardmethode voor toekomstige metingen van alle soorten eiwitten. De normalisering en band-verbreding parameters vastgesteld voor BSA zal worden overgedragen in de analyse.</li>
</ol>

DS is een medewerker van Wyatt Technology Corporation, wiens MALS producten worden gebruikt in dit protocol. AT is een medewerker van Danyal Biotech, een distributeur van Wyatt MALS en AKTA FPLC Instruments.

De SEC-MALS experiment heeft gezorgd voor een goede scheiding van monomeer, dimeer en Trimer, en kwantitatieve resultaten voor de molaren massa's en hydrodynamica maten van elke piek. Dit op zijn beurt duidelijk identificeert en kenmerkt elke soort aanwezig, evenals het kwantificeren van zuiverheid. Gewoonlijk zijn de verkregen resultaten nauwkeurig tot binnen 5%, en nauwkeurig en herhaalbaar aan binnen 1-2%3,69. Dit niveau van precisie en herhaalbaarheid maakt het mogelijk om zelfverzekerd onderscheid te maken tussen soorten die kunnen worden gesloten in MW, zolang ze worden gescheiden door SEC (kan gedeeltelijk overlappen binnen dezelfde piek). De voordelen voor eiwit kwaliteitscontrole en fundamentele biofysische karakterisering zijn duidelijk.
Verificatie van het ontbreken van deeltjes is zeer belangrijk voor gevoelige, herhaalbare SEC-MALS metingen. Deeltjes pieken verschijnen over het algemeen als grote MALS signalen zonder begeleiding van vergelijkbare UV-of RI-signalen. De mobiele fase en de steekproef moeten zorgvuldig worden voorbereid om dergelijke deeltjes te elimineren. Gebruik van HPLC-grade reagentia of beter, filtratie van mobiele fase en verdunning buffer tot 0,1-0,2 µm (pre-wassen van de filter om deeltjes die altijd aanwezig zijn op droge membranen), het onderhoud van extra-clean mobiele fase flessen en andere glaswerk voor te elimineren SEC-MALS en uitgebreide kolom evenwicht onder flow (voor het verwijderen van deeltjes en aggregaten die kunnen hebben opgebouwd wanneer de stroom werd gestopt of een kolom niet in gebruik) zijn allemaal aanbevolen. Het monster moet worden gefilterd op de kleinste poriegrootte die niet verwijderen van het materiaal van belang, meestal niet groter dan 0,1 µm en, indien mogelijk, 0,02 µm. Als het filter snel klompen, het monster kan worden gecentrifugeert, gefilterd in stadia van dalende poriegrootte, en/of opnieuw gezuiverd. Wanneer de systemen constant met hoogstaande, verse en gefiltreerde mobiele fase worden gehandhaafd, worden de kolom schokken verhinderd, zijn de steekproeven schoon en houden niet aan de kolom, zullen de metingen niet het voornoemde deeltjes lawaai tentoonstellen en zullen verstrekken kwalitatief hoogstaande gegevens.
MALS is neutraal voor de typische SEC buffers voor eiwitten; vele andere buffersystemen naast PBS kunnen worden gebruikt om scheiding en stabiliteit, met inbegrip van een verscheidenheid van hulpstoffen71te optimaliseren. MALS is ook neutraal voor de specifieke kolom, die moet worden geselecteerd voor een optimale scheiding en herstel. De belangrijkste aandachtspunten voor de hulpstoffen met betrekking tot analyse zijn significante veranderingen in de brekingsindex, wat leidt tot wijziging van de specifieke brekingsindex increment DN/DC, en hulpstoffen die absorberen 280 nm wanneer UV-analyse nodig is. Bijvoorbeeld, arginine is een gemeenschappelijke aggregatie-reducerende excipiëns dat kan dramatisch invloed op de DN/DC van een typisch eiwit, zelfs om het in het negatieve regime (een eiwit met negatieve DN/DC kan nog steeds worden GEANALYSEERD door SEC-MALS als DN/ DC is empirisch bepaald, maar als DN/DC = 0 de intensiteit van het licht verspreid door het eiwit zal worden Null en MW-analyse zal onmogelijk zijn). Het onderwerp van DN/DC- waarden voor eiwitten wordt uitvoerig besproken door Zhao et al.35 waar wordt aangetoond dat voor standaard waterige buffers, de overgrote meerderheid van de ongewijzigde eiwitten vallen binnen 2-3% van de standaardwaarde (0,185 of 0,186 ml/g bij = 660 nm) , hoewel de proteïnen onder ~ 10 kDa meer veranderlijk zijn, en er zijn een paar soorten die zo hoog kunnen gaan zoals 0,21 mL/g.
De MW-profielen over de BSA monomeer en dimeer pieken in de gepresenteerde gegevens waren beide vrij homogeen tot binnen 2% of minder, met vermelding van monodispers soorten. Niet-uniforme MW-waarden over een piek kunnen voortvloeien uit heterogeniteit of onjuiste analyse. In het bijzonder, een BSA MW profiel dat is concave (' Smile ') of convex (' grimas ') kan het gevolg zijn van het niet correct toepassen van de band-verbreding correctie. Voor andere eiwitten kan een convex profiel ook voortkomen uit dynamisch evenwicht tussen monomeren en oligomeren, waarbij de verhouding tussen monomeer en oligomeren-en dus de schijnbare MW-waarde-afhankelijk is van piek concentratie (BSA vertoont dit gedrag niet en wordt vaak gebruikt Als een controlemonster om te controleren of de juiste band verbreding parameters). Een MW-profiel dat varieert van de leiden tot de trailing edge en verandert niet met monster concentratie is typerend voor een verdeling van de moleculaire gewicht soorten die gedeeltelijk worden opgelost door SEC. dynamisch evenwicht is gemakkelijk te onderscheiden van de andere bronnen van schijnbaar onhomogene distributies door het injecteren van verschillende totale hoeveelheden eiwit-de verdeling zal variëren met dynamisch evenwicht, maar niet met een vaste verdeling of onjuiste band-verbreding correctie.
Gezien de hierboven beschreven beperkingen is SEC-MALS niet geschikt voor verschillende taken. Het is niet geschikt voor de analyse van ruwe monsters; de monsters moeten goed gezuiverd worden door standaard affiniteit en polijst methoden. Het heeft niet voldoende nauwkeurigheid of oplossings vermogen om mutanten en varianten van een eiwit of mAb met dezelfde of zeer nauwe massa te identificeren, en kan niet worden gebruikt met analyten die niet Elueer of gescheiden zijn op een SEC-kolom, hoewel onlangs is aangetoond dat ion-uitwisseling e of reverse-phase chromatografie kan worden gecombineerd met MALS te scheiden en te karakteriseren soorten die niet zijn opgelost door SEC72,73,74. Wanneer de eiwit hoeveelheden streng worden beperkt, kan de SEC-MALS niet haalbaar zijn aangezien het typisch 10-200 µ g3 vereist en zelfs meer door een FPLC systeem met buizenstelsel binnendiameter groter dan 0,25 mm nodig kan zijn; kleinere hoeveelheden kunnen echter worden geanalyseerd door UHPLC-SEC-MALS. Zeer instabiele eiwitten die aggregaat bij de invoering van de mobiele fase zijn niet geschikt voor SEC-MALS analyse, hoewel buffer optimalisatie met behulp van off-line dynamische lichtverstrooiing kan overwinnen dit probleem75.
Ondanks de extra inspanning die SEC-MALS met zich meebrengt, is het van onschatbare waarde voor eiwit onderzoek en wordt veelvuldig gebruikt door de academische en biofarmaceutische Gemeenschappen. In aanvulling op de karakterisering van monomeren, oligomeren en aggregaten zoals beschreven in het protocol hierboven, kan SEC-MALS karakteriseren gemodificeerde eiwitten zoals glycoproteïnen (bepaling van de MW van de eiwitten en glycanen onderdelen afzonderlijk), oppervlakteactieve stof-of lipide-solubilized membraan proteïnen die (MW van de proteïne en oplosmiddel componenten individueel bepalen), eiwit assemblage zoals virus-als deeltjes, eiwit-eiwit en eiwit-Nucleic zure complexen, polysaccharides, eiwit-polysaccharide geconjugeerde, peptiden en vele andere biomacro moleculen.

Betrouwbare analyse van het molecuulgewicht (MW) van eiwitten in oplossing is essentieel voor biomoleculaire onderzoek1,2,3,4. MW-analyse informeert de wetenschapper of het juiste eiwit is geproduceerd en of het geschikt is voor gebruik bij verdere experimenten5,6. Zoals beschreven op de websites van eiwit onderzoeknetwerken P4EU7 en ARBRE-Mobieu8, eiwit kwaliteitscontrole moet niet alleen de zuiverheid van het eindproduct karakteriseren, maar ook de oligomere staat, homogeniteit, identiteit, conformatie, structuur, post-Translation wijzigingen en andere eigenschappen.
MW-meting in niet-denaturerende oplossing identificeert de vorm van het eiwit dat aanwezig is in een waterige omgeving, hetzij monomeer of oligomere. Terwijl voor vele proteïnen het doel de monomeer vorm moet veroorzaken, voor anderen is een specifieke inheemse oligomeren sleutel aan biologische activiteit9,10,11,12. Andere oligomeren en niet-inheemse aggregaten zijn ongewenst en zal leiden tot gebreken in de structurele bepaling door kristallografie, nucleaire magnetische resonantie (NMR) of Small-angle X-Ray verstrooiing, evenals artefacten of onnauwkeurigheden in functionele analyses om kwantificeren bindend door isotherme titratie calorimetrie of oppervlak Plasmon resonantie2,13.
In het geval van biotherapeuten zoals monoclonal antilichamen (Matthew), dient de oplossing-gebaseerde analyse van MW een gelijkaardig doel van kwaliteitsbeheersing en product karakterisering. Overmatige aggregaten en fragmenten zijn indicatief voor een instabiel product dat niet geschikt is voor menselijk gebruik. Regelgevende instanties vereisen een zorgvuldige karakterisering, niet alleen van de therapeutische molecule, maar ook potentiële degradants die aanwezig kunnen zijn in het eindproduct14,15,16,17.
Enkele van de meest voorkomende methoden voor het analyseren van eiwit MW zijn natrium dodecyl sulfaat Polyacrylamide gel elektroforese (SDS-pagina), capillaire elektroforese (CE), native PAGE, massaspectrometrie (MS), grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) en analytische ultracentrifugation (AUC). Van deze, SDS-pagina, CE en Mej. worden niet uitgevoerd in de inheemse staat en leiden typisch tot dissociatie van oligomeren en complexen, vandaar zijn niet geschikt voor het bepalen van de inheemse oligomeren of het kwantificeren van complexen. Hoewel de inheemse pagina, theoretisch, de inheemse staat behoudt, in onze ervaring is het moeilijk om voor vele proteïnen te optimaliseren, en de resultaten zijn niet zeer betrouwbaar. AUC, hetzij door sedimentatiesnelheid of sedimentatie evenwicht, is kwantitatief en kan MW van eerste principes bepalen, maar het is vrij omslachtig, vergend veel handarbeid en significante deskundigheid in gegevensinterpretatie, lange experiment tijd en een zeer kostbaar instrument.
Analytische SEC is een kwantitatieve en relatief robuuste, eenvoudige methode die macromoleculen scheidt tijdens de stroom door een ingepakte kolom. De principes en toepassingen van SEC zijn goed gepresenteerd in verschillende reviews18,19,20 en in het handboek "grootte uitsluiting chromatografie: principes en methoden"21. De verschillen in retentie zijn te wijten aan verschillende hoeveelheden tijd besteed verspreiden in en uit de poriën in de stationaire fase vóór eluting vanaf het einde van de kolom. De verschillen doen zich (nominaal) van de relatieve grootte en de verspreidingscoëfficiënten van de molecules22voor. Een kalibratiecurve is gebouwd met behulp van een reeks van referentie-moleculen, met betrekking tot de MW van het molecuul om elutie volume. Voor eiwitten, de referentie-moleculen zijn over het algemeen goed gedragen, bolvormige eiwitten die niet interageren met de kolom via charge of hydrofobe oppervlakte residuen. Elutie volume wordt gemeten met een ultraviolette (UV) absorptie detector. Als de UV-extinctiecoëfficiënt is bekend-vaak berekend op basis van de sequentie-de eiwit piek totale massa kan ook worden quantitated.
Met name de analyse van MW per SEC berust op twee belangrijke veronderstellingen met betrekking tot de te kenmerken eiwitten: 1) zij delen met de referentienormen dezelfde conformatie en specifieke volume (met andere woorden, dezelfde relatie tussen diffusie-eigenschappen en MW) en 2) net als de referentie-normen, ze niet interageren met de kolom, behalve door sterische eigenschappen-ze zich niet houden aan de kolom verpakking door charge of hydrofobe interacties. Afwijkingen van deze veronderstellingen ongeldig de kalibratiecurve en leiden tot foutieve MW-bepalingen. Dit is het geval voor intrinsiek ongeordende eiwitten die grote Stokes stralen te wijten aan hun uitgebreide ongestructureerde regio's23,24 of niet-sferische/lineaire oligomere assemblages10hebben. Geglycosyleerd eiwitten zullen over het algemeen een grotere Stokes RADIUS dan de niet-geglycosyleerd vorm, zelfs wanneer de toegevoegde koolhydraten massa wordt rekening gehouden met19. Detergent-solubilized de proteïnen van het membraan Elueer verschillend dan kaliber bepalings proteïnen omdat hun elutie van SEC van de totale grootte van het polypeptide-detergens-complexe lipiden eerder afhangt dan de oligomere staat en maal massa van proteïne25 ,26. Kolom chemie, pH en zout voorwaarden allen beïnvloeden elutie volumes van proteïnen met geladen of hydrofobe oppervlakte residu's27,28.
SEC wordt veel meer veelzijdig en betrouwbaar voor MW bepaling in combinatie met multi-angle lichtverstrooiing (MALS) en differentiële brekingsindex (dRI) detectoren3,4,11,29, 30,31,32. Een dRI detector bepaalt de concentratie op basis van de verandering in de oplossing brekingsindex als gevolg van de aanwezigheid van de analyt. Een MALS detector meet het aandeel van het licht verspreid door een analyt in meerdere hoeken ten opzichte van de invallende laserstraal. Gezamenlijk bekend als SEC-MALS, deze instrumentatie bepaalt MW onafhankelijk van elutie tijd sinds MW kan direct worden berekend vanaf de eerste beginselen met behulp van vergelijking 1,
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59615/59615eq1.jpg">1
waarbij M het molecuulgewicht van de analyt is, R (0) de verminderde verhouding Rayleigh (d.w.z. de hoeveelheid licht die door de analyt wordt verspreid ten opzichte van de laser intensiteit), bepaald door de MALS detector en geëxtrapoleerd naar hoek nul, c de gewichts concentratie bepaald door de UV-of dRI -detector, DN/DC de brekingsindex van de analyt (in wezen het verschil tussen de brekingsindex van de analyt en de buffer), en K een optische constante die afhankelijk is van de Systeemeigenschappen zoals golflengte en oplosmiddel brekingsindex29.
In SEC-MALS, de SEC kolom wordt alleen gebruikt om de verschillende soorten in oplossing te scheiden, zodat ze de MALS en concentratie detector cellen afzonderlijk in te voeren. De daadwerkelijke retentietijd heeft geen betekenis voor de analyse behalve voor zover hoe goed het de eiwit soorten oplost. De instrumenten zijn onafhankelijk van de kolom gekalibreerd en vertrouwen niet op referentienormen. Vandaar, SEC-MALS wordt beschouwd als een ' absolute ' methode voor MW bepaling van elementaire fysieke vergelijkingen. Als de steekproef heterogeen is en niet volledig door de kolom wordt gescheiden, dan zal de waarde die bij elk elutie volume wordt verstrekt een gewichts gemiddelde van de molecules in elk elutie volume zijn dat door de stroom cel per tijdsegment, ongeveer 75 l stroomt.
Door analyse van de hoek variatie van verstrooiings intensiteit, kan MALS ook de grootte (wortel-gemiddelde-vierkante straal, Rg) van macromoleculen en nanodeeltjes met geometrische straal groter dan ongeveer 12,5 nm29bepalen. Voor kleinere soorten, zoals monomeer eiwitten en oligomeren, kan een dynamische lichtverstrooiing (DL'S) module worden toegevoegd aan het MALS instrument om hydrodynamica stralen te meten van 0,5 nm en33.
Hoewel hetzij UV-of dRI-concentratie analyse kan de waarde van c in EQ. 1, gebruik van dri heeft de voorkeur om twee redenen: 1) dri is een universele concentratie detector, geschikt voor het analyseren van moleculen zoals suikers of polysaccharides die niet bevatten een UV- chromophore34; en 2) de concentratie respons DN/DC van bijna alle zuivere eiwitten in waterige buffer is hetzelfde als binnen een of twee procent (0,185 ml/g)35, dus er is geen noodzaak om de UV-extinctiecoëfficiënt weten.
Het gebruik van SEC-MALS in eiwit onderzoek is vrij uitgebreid. Veruit de meest voorkomende toepassingen zijn vast te stellen of een gezuiverd eiwit is monomeer of oligomere en de mate van oligomerization, en de beoordeling van aggregaten3,10,11,17, 31,36,37,38. De mogelijkheid om dit te doen voor wasmiddel-solubilized membraaneiwitten die niet kunnen worden gekenmerkt door traditionele middelen is vooral gewaardeerd, en gedetailleerde protocollen voor deze zijn gepubliceerd31,39,40 , 41 , 42 , 43. andere gemeenschappelijke toepassingen omvatten de vaststelling van de mate van posttranslationele modificatie en polydispersieiteit van glycoproteïne, lipoproteïnen en dergelijke geconjugeerden4,31,44 , 45 , 46 , 47; de vorming (of het gebrek daarvan) en absolute stoichiometrie (in tegenstelling tot stoichiometrische verhouding) van heterocomplexes met inbegrip van proteïne-proteïne, eiwit-nucleic zuur en eiwit-polysaccharide complexen24,46, 48,49,50,51,52; bepaling van de monomeer-dimeer evenwicht dissociatieconstante49,53,54; en evaluatie van de eiwit conformatie55,56. Beyond proteins, SEC-MALS is van onschatbare waarde voor de karakterisering van peptiden57,58, ruim heterogene natuurlijke polymeren zoals heparine59 en chitosans60,61, kleine virussen62 en de meeste soorten synthetische of verwerkte polymeren63,64,65,66. Een uitgebreide bibliografie kan worden gevonden in de literatuur67 en online (op http://www.Wyatt.com/Bibliography).
Hier presenteren we een standaardprotocol voor het uitvoeren en analyseren van een SEC-MALS experiment. Boviene serum albumine (BSA) wordt gepresenteerd als een voorbeeld voor de scheiding en karakterisering van eiwit monomeren en oligomeren. Het BSA-protocol bepaalt bepaalde systeem constanten die dienen als basis voor verdere SEC-MALS analyses, waaronder die van complexen, glycoproteïnen en oppervlakteactieve-gebonden membraaneiwitten.
Wij merken op dat SEC-MALS kan worden uitgevoerd met behulp van standaard high-performance vloeibare chromatografie (HPLC) of snelle eiwit vloeistofchromatografie (FPLC) apparatuur van vele leveranciers. Dit protocol beschrijft het gebruik van een FPLC systeem dat vaak voorkomt in laboratoria die eiwitten produceren voor onderzoek en ontwikkeling (Zie tabel van materialen). Voorafgaand aan het uitvoeren van het Protocol, de FPLC systeem, MALS en dRI detectoren moeten zijn geïnstalleerd, samen met hun respectieve softwarepakketten voor controle, data-acquisitie en analyse per fabrikanten ' instructies en eventuele vereiste kalibratie constanten of andere instellingen die in de software zijn ingevoerd. Een inline filter moet worden geplaatst tussen de pomp en injector met een hydrofiele, 0,1 µm porie membraan geïnstalleerd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:770px;" width="770">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">AKTA pure</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">29-0182-26</td>
			<td style="width:242px;">fast protein liquid chromatograph (FPLC)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">AKTA UNICORN</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>FPLC control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">ASTRA</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td></td>
			<td>MALS data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Bovine serum albumine (purity &#62;97%)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A1900</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">DAWN or miniDAWN</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:123px;">WH2 or WTREOS</td>
			<td>multi-angle light scattering (MALS) detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Increase 200 10/300</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>size exclusion column, 200 &#197; pores, 10 mm i.d., 300 mm length</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Optilab</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:123px;">WTREX</td>
			<td>differential refractive index (RI) detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Sodium chloride NaCl</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:123px;">71382</td>
			<td>HPLC grade NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 &#181;m 1000 mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SCVPU11RE</td>
			<td>mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-1002</td>
			<td>sample filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 &#181;m pore, 10 mm diameter</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-1012</td>
			<td>sample filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-2012</td>
			<td>mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">WyattQELS</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td>WIQ</td>
			<td>dynamic light scattering detector</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of proteins by size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (sec-mals)

Analytische grootte-uitsluiting chromatografie (SEC), vaak gebruikt voor de bepaling van het molecuulgewicht van eiwitten en eiwit-eiwitcomplexen in oplossing, is een relatieve techniek die berust op de elutie volume van de analyt te schatten moleculaire Gewicht. Wanneer het eiwit niet bolvormig is of niet-ideale kolom interacties ondergaat, is de kaliberbepalingskromme die op eiwit normen wordt gebaseerd ongeldig, en het moleculaire gewicht dat van elutie volume wordt bepaald is onjuist. Multi-Angle lichtverstrooiing (MALS) is een absolute techniek die het molecuulgewicht van een analyt in oplossing van fundamentele fysische vergelijkingen bepaalt. De combinatie van SEC voor de scheiding met MALS voor analyse vormt een veelzijdig, betrouwbaar middel voor het karakteriseren van oplossingen van een of meer eiwit soorten, waaronder monomeren, inheemse oligomeren of aggregaten, en heterocomplexes. Aangezien de meting wordt uitgevoerd op elk elutie volume, SEC-MALS kan bepalen of een eluting piek is homogeen of heterogeen en onderscheid te maken tussen een vaste molecuulgewicht distributie versus dynamisch evenwicht. Analyse van gemodificeerde eiwitten zoals glycoproteïnen of lipoproteïnen, of geconjugeerde, zoals detergent-solubilized membraaneiwitten, is ook mogelijk. Vandaar, SEC-MALS is een kritisch instrument voor de eiwit chemicus die moet bevestigen de biofysische eigenschappen en de oplossing gedrag van moleculen geproduceerd voor biologisch of biotechnologisch onderzoek. Dit protocol voor SEC-MALS analyseert het molecuulgewicht en de grootte van zuivere eiwit monomeren en aggregaten. De verkregen gegevens dienen als basis voor verdere SEC-MALS analyses, waaronder die van complexen, glycoproteïnen en oppervlakteactieve-gebonden membraaneiwitten.

Figuur 1a, b tonen aan dat drie OLIGOMERE vormen van BSA: monomeer, dimeer en Trimer, waren goed gescheiden op de 200 å porie kolom met Baseline resolutie van monomeer en dimeer, terwijl Figuur 2a toont aan dat de scheiding op een 75 å porie kolom niet goede monomeer-dimeer resolutie te bereiken. Het laatstgenoemde voorbeeld werd omvat om een "slecht" resultaat te illustreren; deze verschillen in scheiding voor de twee kolommen kunnen, in feite, volgens de verklaarde de scheidings waaiers van de fabrikant worden verwacht. De Trimer is niet volledig gescheiden van de dimeer en hogere oligomeren zijn niet goed gescheiden van de Trimer en elkaar. Figuur 2b is een voorbeeld van lawaaierig licht verstrooiend signaal met deeltjes aanwezig in de chromatogram, die nauwkeurige MW-bepaling uitsluit.
Voortaan richten we ons op Figuur 1b. Het monomeer, dat geëlueerd bij 13,8 mL, vertoont een gewicht-gemiddelde molaren massa Mw van 64,1 ± 0,4 kDa bepaald door MALS en hydrodynamica straal Rh van 3,54 ± 0,01 nm. Deze resultaten zijn in overeenstemming met de opeenvolgings massa en de bekende hydrodynamica straal van BSA, 66,4 kDa en 3,5 nm respectievelijk68, aan binnen de gebruikelijke nauwkeurigheid van SEC-MALS%3,69. De dimeer, die geëlueerd op 12 mL, exposeerde een Mw waarde van 127 ± 1 kDa bepaald door MALS-zoals verwacht, tweemaal die van het monomeer om binnen experimentele precisie-en Rh van 5,68 ± 0,06 nm. De Trimer piek werd ook waargenomen bij 11 mL met Mw van 194 ± 9 kDa bepaald door MALS, drie keer die van het monomeer om binnen experimentele precisie, zoals verwacht. R h van de Trimer kon niet worden bepaald als gevolg van lage intensiteit van de distributielijsten signaal.
De molaren massa punten die over de monomeer piek worden berekend zijn eenvormig aan binnen 2-5%, die op homogeniteit wijst. Het is niet ongebruikelijk om een slepende schouder met Kies massa in de waaier van 38-50 kDa te vinden, die aan BSA fragmenten70correspondeert. De molaren massa punten over de dimeer en trimere pieken zijn niet uniform, indicatief voor heterogeniteit. De dimeer Peak is enigszins heterogeen te wijten aan sporen van Trimer die bloeden in de dimeer Peak, en de Trimer piek is heterogeen te wijten aan co-elutie van slecht opgeloste hogere oligomeren.
Het signaal-ruisniveau van de monomeer piek is heel acceptabel in alle drie de signalen, meer dan 100:1, net als de dimeer Peak met signaal-ruis van 40:1. Chromatogram gebieden buiten de eiwit pieken zijn plat, met uitzonderingen van een piek als gevolg van deeltjes in de buurt van de totale uitsluiting (void) volume in de LS trace en een (positieve) zout piek en een (negatieve) opgelost lucht piek in de dRI Trace, in de buurt van de totale doordringen Volume. Deze worden in Figuur 1aaangegeven.
Niveau van zuiverheid kan ook worden berekend in een SEC-MALS experiment: massa fractie van de monomeer piek in het rapport vertegenwoordigt het percentage van de zuiverheid van de monomeer vorm. Voor BSA-monomeer is de berekende zuiverheid 88%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig1.jpg"> Figuur 1 : SEC-MALS analyse van boviene serum albumine (BSA) met behulp van een 200 Å poriegrootte-uitsluitings kolom. Chromatogram sporen worden genormaliseerd naar de monomeer piek en offset voor de duidelijkheid. (A) gemeenschappelijke artefacten die kunnen worden genegeerd worden opgemerkt, met inbegrip van een deeltjes piek in de buurt van het begin van het lichtverstrooiing signaal, alsmede zout en opgeloste lucht pieken in de buurt van de totale doordringen volume in de brekingsindex signaal. (B) de chromatogram vertoont uitstekende monomeer-dimeer-de scheiding van de Trimer en het lichte verstrooiende signaal vertoont hoog signaal-aan-lawaai. De waarden van het monomeer en dimeer MW stellen hoge homogeniteit tentoon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig2.jpg"> Figuur 2 : Voorbeelden van lage kwaliteit SEC-MALS analyses. Chromatogram sporen worden genormaliseerd naar de monomeer piek en offset voor de duidelijkheid. (A) ontoereikende scheiding op een 75 Å poriegrootte uitsluitings kolom; een deeltjes piek tussen 8-9 min is niet goed gescheiden van de eiwitten. (B) onvoldoende signaal-ruisverhouding en uitgebreide deeltjes naast de eiwitten zijn zichtbaar in het lichtverstrooiing (LS) signaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS at JoVE.com

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Dit protocol beschrijft de combinatie van grootte uitsluiting chromatografie met multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS) voor absolute karakterisering van eiwitten en complexen in oplossing. SEC-MALS bepaalt het molecuulgewicht en de grootte van zuivere eiwitten, native oligomeren, heterocomplexes en gemodificeerde eiwitten zoals glycoproteïnen.

Karakterisering van eiwitten door grootte-uitsluiting chromatografie gekoppeld aan multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

SEC-MALS is een kwantitatieve methode voor het bepalen van het molecuulgewicht, de grootte en de conformatie van macromoleculen in oplossing. Het kan oligomers en complexen identificeren en moeilijke monsters karakteriseren, zoals glycoproteïnen en membraaneiwitten. SEC-MALS is een absolute methode.Het is afhankelijk van fundamentele fysica, en is niet afhankelijk van samenwerking tegen moleculaire normen, de conformatie van het molecuul, of hoe we omgaan met het scheidingsmedium. SEC-MALS kan worden toegepast op vele systemen die worden gescheiden door sec. Van peptiden en kleine polymeren tot eiwitten, nucleocapsids, polysaccharides, synthetische polymeren, virusachtige deeltjes en kleine virussen.Het is belangrijk om te controleren of uw systeem en buffers de aanbevelingen van de leverancier voor een laag deeltjesgehalte missen. Raadpleeg voor de zekerheid contact met de medewerker van de technische ondersteuning van de leverancier. Begin deze procedure met de voorbereiding van het SEC-MALS-systeem zoals beschreven in het tekstprotocol.Bereid met behulp van elke PLC-grade reagentia een liter fosfaatgebufferde zoutoplossing voor met 50 tot 100 millimolar natriumchloride. Filter de buffer op 0,1 micron met behulp van een gebotteld polyether cel schuim filter, of iets dergelijks. Filter de eerste 50 tot 100 milliliter buffer naar een afvalfles om de deeltjes uit de droge filters te verwijderen.Vervolgens filtert u de rest op een schone, steriele fles die eerder is gewassen met gefilterd, gedeïoniseerd water en bewaard om te voorkomen dat stof binnenkomt. Spoel de kolom 's nachts door met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut om de kolom in de buffer te equiliberen en deeltjes te verwijderen. Gebruik de continue stroommodus van de FPLC en zorg ervoor dat de stroom niet stopt totdat alle SEC-MALS-runs zijn voltooid.Plaats de DRI-stroomcel in de zuiveringsmodus tijdens de nachtelijke flush. Bij het starten van de flush, geleidelijk oprit van de stroomsnelheid om te voorkomen dat de kolom vergieten effect, veroorzaakt door een plotselinge verandering van druk in de kolom. Schakel de zuivering uit voordat het voorbeeld wordt uitgevoerd.Controleer de netheid van het systeem door licht op de slang stroomafwaarts van de kolom te tikken om opgehoopte deeltjes vrij te geven. Let op het signaal in de 90 graden detector op het voorpaneel display van het MALS-instrument. Controleer of het piek-tot-piekgeluid niet meer dan 50-100 microvolts is.Controleer ook of de brekingsindex, of RI-signaal, stabiel is tot minder dan 1 keer tien tot de min zeven brekingsindex-eenheden. Voer een blanco injectie uit om te controleren of de injector schoon is van deeltjes. Een blanco is gewoon de lopende buffer bereid in een verse, steriele flacon.Als de deeltjespiek niet meer dan één milliliter in volume is, en niet meer dan vijf millivolt boven de basislijn, dan is het systeem klaar voor monsters. Voer anders extra blanco injecties uit totdat ze schoon zijn, of voer onderhoud uit om de injector schoon te maken. Nu, bereid ten minste 200 microliter BSA op een tot twee milligram per milliliter in de SCC buffer.Filter het eiwit op 02 micron, met behulp van een spuittipfilter. Gooi de eerste paar druppels filtraat weg om deeltjes uit de droge filters te verwijderen. Als alternatief, centrifugeren het monster op 10.000 keer G gedurende vijftien minuten om neerslag van niet-oplosbare aggregaten en andere grote deeltjes mogelijk te maken.Injecteer vervolgens 100 microliter van de BSA-oplossing in de lus. Open nieuw experiment vanuit de methode in het MALS-softwaremenu. Selecteer vervolgens de onlinemethode in de map met methoden voor lichtverstrooiingsinstallaties.Als er een DLS-detector aanwezig is, selecteert u de onlinemethode in de lichtverstrooiing met de QELS-map. Stel parameters in van het voorbeeld en de mobiele fase in de configuratiesectie. Stel in de algemene pompweergave de stroomsnelheid in op die in de FPLC.Navigeer vervolgens naar de algemene pompweergave, oplosmiddeltak, naamveld en selecteer PBS. Voer in de injectorweergave de voorbeeldbranch in de naam BSA in. Stel dn/dc in op 0,185, stel A2 in op 0 en stel de UV-extinctiecoëfficiënt in op 0,667 milliliter per milligram centimeter.Schakel in de sectie procedures de basisverzamelingsweergave in om de trigger van het selectievakje automatisch te injecteren. Stel de duur van de run in op 70 minuten, zodat gegevens worden verzameld voor de gehele toespeling, totdat het totale permeatievolume van de SEC-kolom is bereikt. Start het experiment in de MALS-software door op de run-knop te klikken.Het zal beginnen met het lezen van de gegevens na ontvangst van het pulssignaal van het FPLC-instrument via de MALS-detector. Nul het DRI-signaal door op de auto-zero-knop op het voorpaneel van het instrument te klikken. Werken in de FPLC-software, navigeren naar handmatige, handmatige instructies uit te voeren, merk, en voeg de naam van het eiwit en de run.Schakel de injectieklep van handmatige belasting te injecteren, onder de stroom pad, injectieklep. Neem een pulssignaal op door een puls van 0,5 seconde onder IO-boxpuls digitaal uit te voegen. Dit zal leiden tot het verzamelen van gegevens in de MALS-software.Injecteer het monster in de lus. Klik op uitvoeren in de FPLC-software om de experimentrun te starten. Voer de analyse stap voor stap uit, volgens de sectie procedures in de MALS-software.Controleer of pieken worden weergegeven op ongeveer hetzelfde zinspelingsvolume in UV, MALS en RI door de basisverzamelingsweergave te controleren. Definieer in de basislijnweergave de basislijn voor alle signalen. Definieer in de toppenweergave de pieken die moeten worden geanalyseerd door op de muis te klikken en te slepen.Selecteer de centrale 50% van elke piek. Selecteer eerst de monomeerpiek en vervolgens de dimerpiek. Controleer onder elke piek de juiste waarden van dn/dc en uitstervingscoëfficiënt op 280 nanometer voor BSA.Selecteer in de uitlijningsweergave in de uitlijningsweergave het centrale gebied van de pieken door op de muis te klikken en te slepen. Klik op signalen uitlijnen en vervolgens in orde. In de procedures, band verbreding uitzicht, kies de centrale 50% van de monomeer piek.Controleer of de brekingsindexdetector is opgegeven als referentie-instrument. Klik vervolgens op Fit presteren en breng aan om de UV- en lichtverstrooiingssignalen aan te passen aan het brekingsindexsignaal. Zoom in op de pieken om te controleren of ze elkaar zeer nauw overlappen binnen de centrale 50 tot 70%en klik vervolgens op oke.Selecteer in de procedure, normalisatieweergave, piek. Voer 3,0 nanometer in als de RG-waarde, klik op normaliseren en klik vervolgens op oke. Bekijk de grafiek van de resultaten in de EASI-grafiekweergave.Selecteer de molaire massa in de display drop down aan de bovenkant van het venster. Gebruik het besturingselement, klik en sleep om in te zoomen op het piekgebied. Als u de uiteindelijke getabuleerde gewichtsgemiddelde resultaten voor de monomeer- en dimerpieken wilt bekijken, navigeert u naar piekresultaten, molaire massamomenten, MW en selecteert u de resultaten, rapportsamenvatting.Zuiverheid wordt gemeld onder piekresultaten, massafractie. Selecteer opslaan als methode in het bestandsmenu en sla de geanalyseerde BSA-gegevens op als standaardmethode voor toekomstige metingen van alle soorten eiwitten. De normalisatie en bandbreedte parameters bepaald voor BSA zal worden overgedragen in de analyse.Hier worden SEC-MALS-analyses van BSA weergegeven, met behulp van een 200 Angstrom porie grootte uitsluiting kolom. Chromatogramsporen worden genormaliseerd naar de monomeerpiek en worden gecompenseerd voor helderheid. Veelvoorkomende artefacten die kunnen worden genegeerd, worden opgemerkt, waaronder een deeltjespiek in de buurt van het begin van het lichtverstrooiingssignaal, evenals zout en opgeloste luchtpieken in de buurt van het totale permeatievolume in het brekingsindexsignaal.Het chromatogram vertoont een uitstekende monomeer-dimer-trimer scheiding, en het licht verstrooiingssignaal vertoont een hoog signaal naar ruis. De gemiddelde molaire massawaarden van de monomeer en het dimergewicht vertonen een hoge homogeniteit. Hier zijn voorbeelden van lage kwaliteit SEC-MALS analyses.In dit voorbeeld resulteert onvoldoende scheiding op een 75 Angstrom porie grootte uitsluiting kolom resulteert in een deeltjespiek tussen acht tot negen minuten, die niet goed gescheiden is van de eiwitten. Hier is er een onvoldoende signaal naar ruisverhouding, en uitgebreide deeltjes grenzend aan de eiwitten zijn zichtbaar in het lichtverstrooiingssignaal. De sleutels tot goede SEC-MALS resultaten zijn het selecteren van een geschikte kolom, ervoor te zorgen dat het systeem is gekalibreerd met weinig licht verstrooiingsgeluid, en pre-filtering of centrifuging de monsters om deeltjes te verwijderen.Na SEC-MALS kunnen eiwitmonsters verder worden geanalyseerd op bindingsaffiniteit, bioliza, oppervlakteplasmon resonantie, isothermale titratiecalorimetrie, bioleroïde phorometry, microschaal thermoforese of samenstellinggradiënt, multi-angle lichtverstrooiing. De eiwitstructuur kan worden bepaald door x-ray kristallografie, cryo-elektronen miscroscopie, of NMR.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Grootte-uitsluiting en ionenuitwisselingschromatografie op een SAX Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionenwisselingschromatografie (IEX) gekoppeld aan meerdere hoek lichtverstrooiing (MALS) voor eiwit scheiding en karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning