Name: characterization of proteins by size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (sec-mals)
Uploaded: 2019-06-20T13:30:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS at JoVE.com

Vi takker Dr. Tsafi Danieli (Wolfson Centre for Applied strukturelle biologi, hebraisk University) for råd og samarbeid. Vi takker også Daniel Biotech Ltd (Rehovot, Israel) for assistanse og etablering av den analytiske FPLC-MALS systemet benyttes i denne studien.

1. utarbeidelse av systemet
<ol><li>Koble MALS-og dRI-detektorer nedstrøms for FPLC UV-detektor. Bypass pH og ledningsevne detektorer siden de vil legge betydelig interdetector volum mellom UV og MALS detektorer. Bruk kapillærrør av 0,25 mm ID fra kolonnen til og mellom detektorer, og 0,75 mm ID kapillær slange på utgangen av detektorer til avfall eller brøkdel samleren.</li>
	<li>Sørg for at de nødvendige signal forbindelsene mellom FPLC og detektorer er etablert, inkludert analog utgang fra UV-detektoren til MALS analoge inngang og digital utgang fra FPLC til MALS Autoinject, via FPLC I/u-boksen.</li>
	<li>Installer en passende analytisk SEC-kolonne som dekker et fraksjonering område på minst 20 kDa til 500 kDa. Sjekk produktinformasjonen for å finne ut om kolonnen er egnet for området MW, pH og andre egenskaper for prøven og den mobile fasen.</li>
</ol>2. utarbeidelse av buffer, f drikker systemet over natten og sjekke renslighet
<ol><li>Bruk reagenser med HPLC-kvalitet til å tilberede 1 L av fosfat-bufret saltvann med 50-100 mM NaCl. Filtrer bufferen til 0,1 μm ved hjelp av en flaske topp polyeter sulfonstrømmen filter eller lignende. Filtrer de første 50-100 mL buffer til en avfalls flaske og kast, for å eliminere partikler fra de tørre filtrene, og deretter filtrere resten til en ren, steril flaske som har blitt vasket grundig med filtrert, de-ionisert vann og avkortet for å hindre støv kommer inn. Merk: andre mobile fase løsemidler som en Tris buffer kan brukes hvis ytterligere proteiner som er fortrinnsvis oppløst i disse løsemidler skal analyseres.</li>
	<li>Skyll over natten med en strømningshastighet på 0,5 mL/min, eller på annen måte anbefalt av Kol onne produsenten, for å likevekt kolonnen i bufferen og fjerne partikler. Bruk FPLC kontinuerlig flyt -modus og sikre at flyten ikke stopper før alle SEC-MALS kjører er fullført.<ol>
<li>Plasser dRI-strømningscellen i PURGE -modus i løpet av natten flush. Slå av PURGE før prøvekjøringer starter.</li>
		<li>Når du starter flush, rampen gradvis strømningshastigheten for å hindre "kolonnen shedding" effekt (eller frigjøring av partikler) forårsaket av en plutselig endring av trykket i kolonnen.</li>
		<li>Hvis systemet er kjent for å være ganske stabilt og partikkel fritt, og i likevekt med den ønskede mobile fasen, Erstatt over natten flush med en kortere, 2-3 h flush.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sjekk systemet renslighet ved lett å trykke på slangen nedstrøms i kolonnen for å løsne akkumulerte partikler og observere signalet i 90 ° detektoren på frontpanel displayet på MALS-instrumentet. Kontroller at peak-to-peak støy er ikke mer enn 50-100 μV.</li>
	<li>Utfør en "blank" injeksjon for å verifisere at injeksjonsstedet er rent partikler. En "blank" er ganske enkelt den løpende bufferen, tilberedt i et friskt, sterilt hetteglass.<ol>
<li>Hvis partikkel toppen ikke er mer enn 1 mL i volum og ikke mer enn 5 mV over Baseline, er systemet klart for prøver. Ellers må du utføre ekstra blanke injeksjoner til rengjøring eller utføre vedlikehold for å rengjøre injeksjonsvæske.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. klargjøre og laste inn prøven
<ol><li>Klargjør minst 200 μL av BSA ved 1-2 mg/mL i SEC-bufferen. Merk: for å unngå utfelling skal BSA aldri oppløses i rent vann.</li>
	<li>Filtrer proteinet til 0,02 μm ved hjelp av et sprøyte tips filter.</li>
	<li>Kast de første par dråper Filtrer for å eliminere partikler fra de tørre filtrene.</li>
	<li>Alternativt, sentrifuger prøven ved 10 000 x g i 15 min for å muliggjøre utfelling av ikke-oppløselige aggregater og andre store partikler.</li>
	<li>Injiser 100 μL av BSA-oppløsningen i løkken. Merk: Dette er den anbefalte mengden av materiale, og mer eller mindre kan injiseres i henhold til omstendighetene i prøven som stabilitet eller tilgjengelighet. Mengden protein som kreves per injeksjon varierer omvendt med molekylvekt-dobbelt så mye protein masse er nødvendig hvis Molekylvekten er 33 kDa, eller halvparten av BSA.</li>
</ol>4. utarbeidelse av MALS programvare
<ol><li>Åpne ny | Eksperimenter fra metode i MALS programvare meny og velg online -metoden fra mappen for lette sprednings system metoder. Hvis en DLS-detektor er til stede, velger du den elektroniske metoden fra lyset spredning | Med QELS -mappen.</li>
	<li>I konfigurasjon -delen angir du parametere for prøven og den mobile fasen.<ol>
<li>I den generiske pumpe visningen setter du strømningshastigheten til den som brukes i FPLC.</li>
		<li>I generisk pumpe visning, løsemiddel gren, navne felt, velg PBS.</li>
		<li>I injeksjons visning, prøve gren, Skriv inn navnet som BSA, og sett DN/DC = 0,185 (standardverdien for uendrede proteiner), a2 = 0, og UV utryddelse = 0,667 ml/(mg-cm). Merk: for andre proteiner, kan UV280 NM utryddelse koeffisient finnes i litteraturen eller beregnet fra sin sekvens ved hjelp av ulike offentlige-domene programvareverktøy.</li>
	</ol>
</li>
	<li>I prosedyrer -delen, grunnleggende samling -visning, merker du av for utløseren på Autoinject og angir varigheten for kjøringen til 70 min, slik at data samles inn for hele eluering til det totale gjennomtrengning volumet av SEC kolonnen er nådd. Merk: den nødvendige tiden kan variere med spalte-og strømningshastighet-35 min. av oppsamling kreves for en standard 7,8 mm x 300 mm HPLC-SEC-kolonne med 0,5 mL/min.</li>
	<li>Start eksperimentet i MALS programvare ved å klikke på Run -knappen. Den vil begynne å lese dataene etter å ha mottatt pulssignalet fra FPLC-instrumentet via MALS-detektoren.</li>
	<li>Null dRI-signalet ved å klikke på Autozero -knappen på instrumentets frontpanel.</li>
</ol>5. utarbeidelse av FPLC programvare
<ol><li>Sett inn navnet på protein og kjøre i FPLC programvare, i manuell | Utfør manuelle instruksjoner | Sett merke.</li>
	<li>Bytt injeksjons ventilen fra manuell belastning for å injisere under strømningsbane | Injeksjons ventil.</li>
	<li>Ta med et pulssignal ved å sette inn en 0,5 -puls under i/u-boksen | Pulse digital ut. Dette vil utløse datainnsamling i MALS programvare.</li>
</ol>6. Injiser prøven i løkken. Klikk Kjør i FPLC-programvaren for å starte eksperimentet.
7. analyse av SEC-MALS BSA-data
<ol><li>Utfør analyse, trinn for trinn, under prosedyrer delen i MALS programvare.<ol>
<li>Kontroller at toppene vises på omtrent samme eluering volum i UV, MALS og RI, ved å merke av for grunnleggende samlings visning.</li>
		<li>I planlagt visning definerer du opprinnelig plan for alle signaler (alle ls-DETEKTORER, UV og dRI). De opprinnelige planene bør defineres for å indikere nivået av rent løsemiddel, å foretrekke strekker seg fra den ene siden av prøven toppene til den andre.</li>
		<li>I topper -visningen definerer du toppene som skal analyseres, ved å klikke og dra musen. Velg det sentrale 50% av hvert høydepunkt. Velg først monomer topp (' peak 1 ') og deretter dimer Peak (' peak 2 '). Bekreft korrekte verdier av DN/DC = 0,185 og UV 280 NM utryddelse koeffisient = 0,667 for BSA under hver topp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utfør toppjustering, korrigering av bånd utvidelse og normalisering av prosedyrer. Merk: vanligvis er SEC-MALS-metoden med jevne mellomrom kalibrert for toppjustering, bånd utvidelse og normalisering av vinkel detektorer til 90 °-detektoren ved hjelp av et monodisperse protein med radius på Gyration Rg &LT; 10 NM som BSA monomer. I dette eksempelet tjener BSA både som kalibrerings molekyl og er i seg selv gjenstand for MW-analyse.<ol>
<li>I prosedyrene | Justerings visning, velger du det sentrale området av toppene ved å klikke og dra musen, klikker Juster signaler og deretter OK.</li>
		<li>I prosedyrene | Band utvide visning, velger den sentrale 50% av monomer peak. Kontroller at RI-detektoren er angitt som Referanse instrument, og klikk deretter på Utfør tilpasning og Påfør for å matche UV-og ls-signalene til ri-signalet.<ol>
<li>Zoom inn på toppene for å bekrefte at de overlapper svært tett innenfor de sentrale 50-70%, og klikk deretter OK.</li>
			<li>Hvis overlappingen ikke er perfekt, (det kan være nødvendig å) utføre passform og "Apply" en eller to ganger til overlappingen er utmerket.</li>
		</ol>
</li>
		<li>I prosedyrene | Normalisering Vis, Velg topp 1, angi 3,0 NM som Rg -verdien, klikker du normalisere deretter OK.</li>
		<li>I prosedyrene | Molar masse og RG fra MALS -visning, se gjennom dataene for å finne ut hvilke, om noen, deteksjons vinkler bør oppheves fra analysen på grunn av overdreven støy. Vanligvis vil disse være den nedre vinkler der støvpartikler scatter en relativt høy intensitet. Velg individuelle sektorer innenfor toppene fra grafen til høyre og vise kantete avhengighet av inverse redusert Rayleigh ratio i grafen til venstre. Hvis de laveste (og noen ganger de høyeste) vinklene konsekvent avviker sterkt fra tilpasningen, fjerner du markeringen fra listen nederst i visningen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vis grafen til resultatene i EASI graf -visning. Velg molar masse fra rullegardin skjermen for visning øverst i vinduet. Bruk Ctrl + klikk og dra for å zoome inn på topp området.</li>
	<li>Se den endelige ordnet vekt-gjennomsnittlig molar masse resultater for monomer og dimer topper i resultatene | Rapport (Sammendrag) visning under peak Results | Molar masse øyeblikk (g/mol) | Det er MW. Renhet rapporteres under peak Results | Masse brøk (%). Merk: andre molar masse øyeblikk er også vist; disse er vanligvis relevant for heterogene polymerer, men ikke proteiner med diskrete størrelser. Mange andre resultater produsert av programvaren kan være inkludert i rapporten som prosent masse utvinning (brøkdel av protein som eluert via konsentrasjonen detektoren i forhold til beløpet injisert), peak Statistics, polydispersitet, Rg og Rh Moments, etc. Når det er angitt, gjenspeiler målene for usikkerhet presisjonen av verdien sitert basert på støyen i måle serien og bør ikke anses å representere nøyaktigheten. Den sanne nøyaktigheten av de rapporterte verdiene avhenger av ulike faktorer som nøyaktigheten av den med følgende DN/DC og utryddelse koeffisient verdier, instrument kalibrering, etc.</li>
	<li>Fra fil menyen, velg Lagre som metode og lagre analysert BSA-data som en standard metode for fremtidige målinger av alle typer proteiner. Den Normalisering og band-utvide parametere bestemmes for BSA vil bli overført i analysen.</li>
</ol>

DS er en ansatt i Wyatt Technology Corporation, der MALS-produktene benyttes i denne protokollen. AT er en ansatt i Danyel Biotech, en distributør av Wyatt MALS og AKTA FPLC instrumenter.

SEC-MALS eksperimentet har gitt god separasjon av monomer, dimer og trimer, og kvantitative resultater for molar massene og hydrodynamisk størrelser av hver topp. Dette i sin tur tydelig identifiserer og karakteriserer hver art til stede, samt kvantifisere renhet. Vanligvis resultatene oppnådd er nøyaktig innenfor 5%, og presis og repeterbar til innen 1-2%3,69. Dette nivået av presisjon og repeterbarhet gjør det mulig å trygt skille mellom arter som kan være nær i MW, så lenge de er adskilt av SEC (kan delvis overlappe innenfor samme høyde). Fordelene for protein kvalitetskontroll og grunnleggende Biofysiske karakterisering er åpenbare.
Verifisering av fravær av partikler er ganske viktig for følsomme, gjentatte SEC-MALS målinger. Partikkel topper vises vanligvis som store MALS-signaler som er ledsaget av sammenlignbare UV-eller RI-signaler. Den mobile fasen og prøven bør være forberedt nøye for å eliminere slike partikler. Bruk av reagenser med HPLC-kvalitet eller bedre, filtrering av mobil fase og fortynnings buffer til 0,1-0,2 μm (forhånds vask av filteret for å eliminere partikler som alltid finnes på tørre membraner), vedlikehold av ekstra rene, mobile fase flasker og andre Glassvarer for SEC-MALS og utvidet kolonne likevekts underflyt (for å fjerne partikler og aggregater som kan ha akkumulert når flyten ble stoppet eller en kolonne som ikke er i bruk) er alle anbefalt. Prøven bør filtreres til minste pore størrelse som ikke fjerner materialet av interesse, vanligvis ikke større enn 0,1 μm og, om mulig, 0,02 μm. Hvis filteret raskt tresko, kan prøven være sentrifugert, filtrert i stadier av synkende pore størrelse, og/eller re-renset. Når systemene er konsekvent opprettholdes med høy kvalitet, frisk og filtrert mobile fase, kolonne sjokk er forhindret, prøvene er rene og ikke holder seg til kolonnen, vil målingene ikke viser de nevnte partikkel støy og vil gi data med høy kvalitet.
MALS er likegyldig til typiske SEC buffere for proteiner; mange andre buffer systemer foruten PBS kan brukes til å optimalisere separasjon og stabilitet, inkludert en rekke hjelpestoffer71. MALS er også likegyldig til den spesifikke kolonnen, som bør velges for optimal separasjon og utvinning. De primære bekymringene for hjelpestoffer vedrørende analyse er vesentlige endringer i brytningsindeks, noe som fører til endring av den spesifikke brytningsindeks økningen DN/DC, og hjelpestoffer som absorberer 280 NM når UV-analyse er nødvendig. For eksempel, arginine er en felles aggregering-reduserende hjelpestoff som kan dramatisk påvirke DN/DC av et typisk protein, selv bringe det inn i det negative regimet (et protein med negativ DN/DC kan fortsatt bli ANALYSERT av SEC-MALS Hvis DN/ DC bestemmes empirisk, men hvis DN/DC = 0 intensiteten av lyset spredt av proteinet vil være null og MW analyse vil være umulig). Temaet DN/DC verdier for proteiner drøftes mye av Zhao et al.35 hvor det er vist at for standard vandige buffere, de aller fleste uendrede proteiner faller innenfor 2-3% av standardverdien (0,185 eller 0,186 ml/g ved = 660 NM) , selv om proteiner under ~ 10 kDa er mer variable, og det er noen få arter som kan gå så høyt som 0,21 mL/g.
MW-profilene på tvers av BSA-monomer og dimer topper i dataene som ble presentert var begge ganske homogene innen 2% eller mindre, noe som indikerer monodisperse arter. Ikke-ensartede MW-verdier over en topp kan oppstå som følge av heterogenitet eller uriktig analyse. Spesielt kan en BSA MW-profil som er konkav (' smile ') eller konveks (' grimase ') skyldes at den ikke er korrekt brukt til å utvide korreksjon av bånd. For andre proteiner, kan en konveks profil også oppstå fra dynamisk likevekt mellom monomerer og oligomers, hvor forholdet mellom monomer til oligomer-og dermed den tilsynelatende MW verdi-avhengig av toppkonsentrasjon (BSA viser ikke dette problemet og brukes ofte som en kontroll prøve for å verifisere riktige bånd utvide parametere). En MW-profil som varierer fra ledende til den etterfølgende kanten og ikke endres med prøve konsentrasjon er typisk for en fordeling av molekylvekt arter som er delvis løst av SEC. dynamisk likevekt skilles lett fra de andre kilder til tilsynelatende inhomogen distribusjoner ved å injisere forskjellige totale mengder protein-fordelingen vil variere med dynamisk likevekt, men ikke med en fast distribusjon eller feil band-utvide korreksjon.
Gitt begrensningene beskrevet ovenfor, SEC-MALS er ikke egnet for ulike oppgaver. Det er ikke egnet for analyse av råolje prøver; prøvene bør være godt renset ved standard affinitet og polering metoder. Det har ikke tilstrekkelig nøyaktighet eller løse makt til å identifisere mutanter og varianter av et protein eller mAb med samme eller svært nær masse, og kan ikke brukes med analytter som ikke eluere fra eller atskilt på en SEC kolonne, men nylig har det vært vist at ion-Exchang e eller Reverse-fase kromatografi kan kombineres med MALS for å skille og karakterisere arter som ikke er løst ved SEC72,73,74. Hvor protein mengdene er sterkt begrenset, kan SEC-MALS ikke være gjennomførbart siden det vanligvis krever 10-200 μg3 og enda mer kan kreves av et FPLC system med rør indre diameter større enn 0,25 mm; mindre mengder kan imidlertid analyseres av UHPLC-SEC-MALS. Svært ustabile proteiner som samlet ved introduksjon til den mobile fasen er ikke egnet for SEC-MALS analyse, selv om buffer optimalisering med off-line dynamisk lysspredning kan overvinne dette problemet75.
Til tross for den ekstra innsats som SEC-MALS innebærer, er det uvurderlig for protein forskning og brukes mye av akademiske og biofarmasøytisk samfunn. I tillegg til karakterisering av monomerer, oligomers og aggregater som beskrevet i protokollen ovenfor, kan SEC-MALS karakterisere modifiserte proteiner som glykoproteiner (bestemme MW av proteinet og glycan komponenter enkeltvis), overflateaktivt middel-eller lipid-solubilized membran proteiner (bestemme MW av protein og solubilizer komponenter enkeltvis), protein forsamlinger som virus-lignende partikler, protein-protein og protein-nukleinsyre acid komplekser, polysakkarider, protein-polysakkarid konjugater, peptider og mange andre biomacromolecules.

Pålitelig analyse av Molekylvekten (MW) av proteiner i løsningen er viktig for Biomolecular forskning1,2,3,4. MW analyse informerer forskeren om riktig protein er produsert og om det er egnet for bruk i videre eksperimentering5,6. Som beskrevet på nettsidene til protein forskning nettverk P4EU7 og ARBRE-Mobieu8, protein kvalitetskontroll må karakterisere ikke bare renheten av det endelige produktet, men også dens oligomer tilstand, homogenitet, identitet, konformasjon, struktur, etter oversettelse modifikasjoner og andre egenskaper.
MW-måling i ikke-denaturering løsning identifiserer form av proteinet som finnes i et vandig miljø, enten monomere eller oligomer. Mens for mange proteiner målet er å produsere monomere form, for andre en bestemt innfødt oligomer er nøkkelen til biologisk aktivitet9,10,11,12. Andre oligomers og ikke-innfødte aggregater er uønsket og vil føre til feil i strukturell bestemmelse av crystallography, kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) eller liten vinkel X-ray spredning, samt gjenstander eller unøyaktigheter i funksjonelle analyser for å kvantifisere binding av isotermiske titrering reaksjonskalorimetri eller Surface Plasmon resonans2,13.
Når det gjelder biotherapeutics som monoklonale antistoffer (mAbs), tjener løsningsbasert MW-analyse et lignende formål for kvalitetskontroll og produkt karakterisering. Overdreven aggregater og fragmenter er et tegn på et ustabilt produkt som ikke er egnet for menneskelig bruk. Reguleringsorganer krever nøye karakterisering, ikke bare av det terapeutiske molekylet, men også potensielle degradants som kan være til stede i det endelige produktet14,15,16,17.
Noen av de mest utbredte metodene for å analysere protein MW er natrium natriumdodecylsulfat sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE), kapillær elektroforese (CE), Native PAGE, Mass massespektrometri (MS), størrelses ekskludering kromatografi (SEC) og analytisk ultracentrifugation (AUC). Av disse er SDS-PAGE, CE og MS ikke utføres i den opprinnelige tilstand og typisk føre til dissosiasjon av oligomers og aggregater, derfor er ikke egnet for å bestemme de innfødte oligomer eller kvantifisere aggregater. Selv om native PAGE gjør, teoretisk, beholde den innfødte staten, i vår erfaring er det vanskelig å optimalisere for mange proteiner, og resultatene er ikke veldig pålitelig. AUC, enten ved sedimentering hastighet eller sedimentering likevekt, er kvantitativ og kan fastslå MW fra første prinsipper, men det er ganske tungvint, krever mye manuell arbeidskraft og betydelig ekspertise innen data tolkning, lang eksperiment tid og en svært kostbart instrument.
Analytical SEC er en kvantitativ og relativt robust, enkel metode som skiller makromolekyler underflyt gjennom en pakket kolonne. Prinsippene og anvendelser av SEC er godt presentert i flere anmeldelser18,19,20 og i håndboken "size utelukkelse kromatografi: prinsipper og metoder"21. Forskjellene i oppbevaring skyldes ulike mengder tid brukt spre inn og ut av porene i den stasjonære fasen før tent fra slutten av kolonnen. Forskjellene oppstår (nominelt) fra den relative størrelser og diffusjon koeffisienter av molekylene22. En kalibrerings kurve er konstruert ved hjelp av en rekke referanse molekyler, som knytter MW av molekylet til eluering volum. For proteiner er referanse molekylene generelt godt oppførte, globular proteiner som ikke samhandler med kolonnen via ladning eller hydrofobe overflate rester. Eluering volum måles med en ultrafiolett (UV) absorbansen detektor. Hvis UV utryddelse koeffisienten er kjent-ofte beregnet fra sekvensen-proteinet peak totale massen kan også være quantitated.
Spesielt er analysen av MW av SEC avhengig av to viktige forutsetninger om proteiner som skal karakteriseres: 1) de deler med referanse standardene den samme konformasjon og spesifikke volum (med andre ord, det samme forholdet mellom diffusjon egenskaper og MW) og 2) som referanse standarder, har de ikke samhandler med kolonnen unntatt ved elektrosteriske egenskaper-de ikke overholder kolonnen pakking av kostnader eller hydrofobe interaksjoner. Avvik fra disse forutsetningene opphever kalibreringskurven og fører til feilaktige MW-bestemmelser. Dette er tilfellet for egen relaterte proteiner som har store Stokes-radier på grunn av sine omfattende ustrukturert områder23,24 eller ikke-sfæriske/lineære oligomer sammenstillinger10. Glykosylert proteiner vil generelt ha en større Stokes radius enn den ikke-glykosylert form, selv når den ekstra karbohydrat massen er tatt hensyn til19. Vaskemiddel-solubilized membran proteiner eluere annerledes enn kalibrering proteiner fordi deres eluering fra SEC avhenger av den totale størrelsen på polypeptid-vaskemiddel-lipider kompleks i stedet for oligomer tilstand og molar massen av proteinet25 ,26. Kolonne kjemi, pH og salt forhold alle påvirker eluering mengder proteiner med ladet eller hydrofobe overflate rester27,28.
SEC blir mye mer allsidig og pålitelig for MW bestemmelse kombinert med multi-vinkel lysspredning (MALS) og differensial brytningsindeks (dRI) detektorer3,4,11,29, 30,31,32. En dRI-detektor bestemmer konsentrasjonen basert på endringen i løsnings brytningsindeksen på grunn av tilstedeværelsen av analytt. En MALS-detektor måler andelen av lys som er spredt av en analytt i flere vinkler i forhold til hendelses laserstrålen. I fellesskap kjent som SEC-MALS, bestemmer denne instrumentering MW uavhengig av eluering tid siden MW kan beregnes direkte fra de første prinsippene ved hjelp av ligning 1,
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59615/59615eq1.jpg">1
hvor M er Molekylvekten av analytt, R (0) redusert Rayleigh ratio (dvs. mengden av lys spredt av analytt i forhold til laser INTENSITET) bestemmes av MALS detektoren og ekstrapolert til vinkel null, c vekt konsentrasjon bestemmes av UV-eller dRI-detektoren, DN/DC brytningsindeks økningen av analytt (i hovedsak forskjellen mellom brytningsindeksen til analytt og bufferen), og K en optisk konstant som avhenger av Systemegenskaper som bølgelengde og løsningsmiddel brytningsindeks29.
I SEC-MALS brukes SEC-kolonnen utelukkende til å skille de ulike artene i løsningen, slik at de går inn i MALS-og konsentrasjons detektor cellene enkeltvis. Den faktiske oppbevaring tid har ingen betydning for analysen unntatt så langt som hvor godt det løser protein arter. Instrumentene kalibreres uavhengig av kolonnen og er ikke avhengig av referanse standarder. Derfor er SEC-MALS betraktet som en "absolutt" metode for MW bestemmelse fra grunnleggende fysiske ligninger. Hvis prøven er heterogen og ikke helt atskilt av kolonnen, vil verdien som oppgis ved hvert eluering volum være et vekt gjennomsnitt av molekylene i hvert eluering volum som renner gjennom strømningscellen per tids sektor, ca. 75 μL.
Ved analyse av kantete variasjon av spredning intensitet, kan MALS også bestemme størrelsen (root-Mean-kvadrat radius, Rg) av makromolekyler og nanopartikler med geometrisk radius større enn ca 12,5 NM29. For mindre arter som monomere proteiner og oligomers, en dynamisk lysspredning (DLS) modul kan legges til MALS instrumentet for å måle hydrodynamisk radier fra 0,5 NM og opp33.
Mens enten UV eller dRI konsentrasjon analyse kan gi verdien av c i EQ. 1, bruk av dRI foretrekkes av to grunner: 1) dRI er en universell konsentrasjon detektor, egnet for å analysere molekyler som sukker eller polysakkarider som ikke inneholder en UV kromoforen34; og 2) konsentrasjons responsen DN/DC av nesten alle rene proteiner i vandig buffer er den samme til innenfor en eller to prosent (0,185 ml/g)35, så det er ikke nødvendig å vite UV utryddelse koeffisient.
Bruken av SEC-MALS i protein forskning er ganske omfattende. Den desidert vanligste bruksområdene er å fastsette om et renset protein er monomere eller oligomer og graden av oligomerisering, og vurdering av aggregat3,10,11,17, 31,36,37,38. Muligheten til å gjøre dette for vaskemiddel-solubilized membran proteiner som ikke kan karakteriseres av tradisjonelle midler er spesielt ettertraktet, og detaljerte protokoller for dette har blitt utgitt31,39,40 , 41 for alle , 42 for alle , 43. andre vanlige anvendelser inkluderer å etablere graden av post-translational modifikasjon og polydispersitet av glykoprotein, lipoproteiner og liknende konjugater4,31,44 , 45 for alle , 46 for alle , for 47; dannelsen (eller mangelen på dem) og absolutt støkiometri (i motsetning til støkiometriske ratio) av heterocomplexes inkludert protein-protein, protein-nukleinsyre syre og protein-polysakkarid komplekser24,46, 48,49,50,51,52; bestemme monomer-dimer likevekt dissosiasjon konstant49,53,54; og evaluere protein konformasjon55,56. Utover proteiner, SEC-MALS er uvurderlig for karakterisering av peptider57,58, bredt heterogene naturlige polymerer som heparins59 og chitosans60,61, små virus62 og de fleste typer syntetiske eller bearbeidede polymerer63,64,65,66. En omfattende bibliografi kan finnes i litteraturen67 og online (på http://www.Wyatt.com/bibliography).
Her presenterer vi en standard protokoll for å kjøre og analysere et SEC-MALS eksperiment. Storfe serum albumin (BSA) er presentert som et eksempel for separasjon og karakterisering av protein monomerer og oligomers. BSA-protokollen bestemmer visse system konstanter som fungerer som et fundament for videre SEC-MALS-analyser, inkludert de av komplekser, glykoproteiner-og overflateaktive membran proteiner.
Vi registrerer at SEC-MALS kan utføres ved hjelp av standard høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) eller rask protein flytende kromatografi (FPLC) utstyr fra mange leverandører. Denne protokollen beskriver bruken av et FPLC-system som vanligvis finnes i laboratorier som produserer proteiner for forskning og utvikling (se tabell over materialer). Før du kjører protokollen, bør FPLC system, MALS og dRI detektorer er installert, sammen med deres respektive programvarepakker for kontroll, datainnsamling og analyse per produsentens instruksjoner og eventuelle nødvendige kalibrering konstanter eller andre innstillinger som er angitt i programvaren. Et inline filter bør plasseres mellom pumpen og injeksjons anlegget med en hydrofile, 0,1 μm pore membran installert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:770px;" width="770">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">AKTA pure</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">29-0182-26</td>
			<td style="width:242px;">fast protein liquid chromatograph (FPLC)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">AKTA UNICORN</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>FPLC control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">ASTRA</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td></td>
			<td>MALS data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Bovine serum albumine (purity &#62;97%)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A1900</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">DAWN or miniDAWN</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:123px;">WH2 or WTREOS</td>
			<td>multi-angle light scattering (MALS) detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Increase 200 10/300</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>size exclusion column, 200 &#197; pores, 10 mm i.d., 300 mm length</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Optilab</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:123px;">WTREX</td>
			<td>differential refractive index (RI) detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">Sodium chloride NaCl</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:123px;">71382</td>
			<td>HPLC grade NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 &#181;m 1000 mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SCVPU11RE</td>
			<td>mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-1002</td>
			<td>sample filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 &#181;m pore, 10 mm diameter</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-1012</td>
			<td>sample filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:266px;">Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">6809-2012</td>
			<td>mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:266px;">WyattQELS</td>
			<td style="width:140px;">Wyatt Technology</td>
			<td>WIQ</td>
			<td>dynamic light scattering detector</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of proteins by size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (sec-mals)

Analytisk størrelse-utelukkelse kromatografi (SEC), vanligvis brukes for fastsettelse av Molekylvekten av proteiner og protein-protein komplekser i løsningen, er en relativ teknikk som er avhengig av eluering volumet av analytt å anslå molekylær Vekt. Når proteinet ikke er globular eller gjennomgår ikke-ideelle kolonnen interaksjoner, kalibreringen kurve basert på protein standarder er ugyldig, og Molekylvekten bestemmes fra eluering volumet er feil. Multi-vinkel lysspredning (MALS) er en absolutt teknikk som bestemmer Molekylvekten av en analytt i løsning fra grunnleggende fysiske ligninger. Kombinasjonen av SEC for separasjon med MALS for analyse utgjør en allsidig, pålitelig måte for karakteriserer løsninger av en eller flere protein arter, inkludert monomerer, innfødte oligomers eller aggregater, og heterocomplexes. Siden målingen utføres ved hvert eluering volum, kan SEC-MALS avgjøre om en tent topp er homogen eller heterogen og skille mellom en fast molekylvekt fordeling kontra dynamisk likevekt. Analyse av modifiserte proteiner som glykoproteiner eller lipoproteiner, eller konjugater som vaskemiddel-solubilized membran proteiner, er også mulig. Herav, SEC-MALS er en betenkelig verktøyet for det protein kjemiker hvem må anerkjenne Biofysiske eiendom og løsning opptreden av molekyler produsert for Biological eller bioteknologisk forskning. Denne protokollen for SEC-MALS analyserer Molekylvekten og størrelsen av ren protein monomerer og aggregater. Dataene ervervet tjene som et grunnlag for videre SEC-MALS analyser inkludert de av komplekser, glykoproteiner og overflateaktivt middel-bundet membran proteiner.

Figur 1a, b viser at tre OLIGOMER former for BSA: monomer, dimer og trimer, ble godt separert på 200-tallet til pore-kolonnen med monomer og dimer, mens figur 2a viser at separasjon på en 75 til pore-kolonne ikke oppnå god monomer-dimer oppløsning. Sistnevnte eksempel var inkludert for å illustrere et "dårlig" resultat; disse forskjellene i separasjon for de to kolonnene kan faktisk forventes i henhold til produsentens angitte separasjon områder. Trimer er ikke helt adskilt fra dimer og høyere oligomers er ikke godt adskilt fra trimer og hverandre. Figur 2b er et eksempel på støyende lys sprednings signal med partikler som finnes i hele kromatogram, noe som UTELUKKER nøyaktig MW-bestemmelse.
Heretter fokuserer vi på figur 1B. Monomer, som eluert ved 13,8 mL, viser en vekt-gjennomsnittlig molar masse Mw av 64,1 ± 0,4 KDA bestemmes av MALS og hydrodynamisk radius Rh på 3,54 ± 0,01 NM. Disse resultatene er enige med sekvensen masse og kjente hydrodynamisk radius av BSA, 66,4 KDA og 3,5 NM henholdsvis68, til innenfor den vanlige nøyaktigheten av SEC-MALS, 5%3,69. Dimer, som eluert ved 12 mL, viste en Mw verdi på 127 ± 1 KDA bestemt av MALS-som forventet, dobbelt så stor som monomer innenfor eksperimentell presisjon-og Rh av 5,68 ± 0,06 NM. Den trimer toppen ble også observert ved 11 mL med Mw på 194 ± 9 KDA bestemt av MALS, tre ganger så monomer innenfor eksperimentell presisjon, som forventet. R h av trimer kunne ikke fastslås på grunn av lav INTENSITET av DLS signalet.
Molar massen poeng beregnet over monomer Peak er uniform til innen 2-5%, noe som indikerer homogenitet. Det er ikke uvanlig å finne en etterfølgende skulder med molar masse i området 38-50 kDa, tilsvarende BSA fragmenter70. Molar massen peker på tvers av dimeric og trimeric topper er ikke ensartet, indikasjon på heterogenitet. Den dimer Peak er noe heterogen på grunn av spor av trimer som blør i dimer peak, og trimer Peak er heterogen på grunn av co-eluering av dårlig løst høyere oligomers.
Signal-til-støy-nivået av monomer Peak er helt akseptabelt i alle tre signaler, over 100:1, som er dimer peak med signal-til-støy av 40:1. Kromatogram regioner utover protein toppene er flatt, med unntak av en topp på grunn av partikler i nærheten av total eksklusjon (void) volum i LS spor og en (positiv) salt peak og en (negativ) oppløst luft Peak i dRI spor, nær den totale gjennomtrengning Volum. Disse er påpekt i figur 1a.
Nivå av renhet kan også beregnes i et SEC-MALS eksperiment: masse brøkdel av monomere topp i rapporten representerer prosent av renhet av monomere form. For BSA-monomer er den beregnede renheten 88%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig1.jpg"> Figur 1 : SEC-MALS analyse av storfe serum albumin (BSA) ved hjelp av en 200 til pore størrelse-utelukkelse kolonne. Kromatogram spor er normalisert til monomer peak og offset for klarhet. (A) vanlige artefakter som kan ignoreres er påpekt, inkludert en partikkel peak nær begynnelsen av lyset spredning signal samt salt og oppløst luft topper nær det totale gjennomtrengning volumet i brytningsindeks signalet. (B) kromatogram utstillinger utmerket monomer-dimer-trimer separasjon og lyset spredning signal utstillinger høy signal-til-støy. De monomer og dimer MW-verdiene viser høy homogenitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig2.jpg"> Figur 2 : Eksempler på lav kvalitet SEC-MALS analyser. Kromatogram spor er normalisert til monomer peak og offset for klarhet. (A) utilstrekkelig separasjon på en 75 til pore størrelse utelukkelse kolonne; en partikkel topp mellom 8-9 min er ikke godt adskilt fra proteinene. (B) utilstrekkelig signal-til-støy-forhold og omfattende partikler ved siden av proteinene er tydelige i lyset SPREDNING (ls) signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS at JoVE.com

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Denne protokollen beskriver kombinasjonen av størrelses ekskludering kromatografi med multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS) for absolutt karakterisering av proteiner og komplekser i løsningen. SEC-MALS bestemmer Molekylvekten og størrelsen av rene proteiner, innfødte oligomers, heterocomplexes og modifiserte proteiner som glykoproteiner.

Karakterisering av proteiner etter størrelses-ekskludering kromatografi koblet til multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

SEC-MALS er en kvantitativ metode for å bestemme molekylvekt, størrelse og konformasjon av makromolekyler i løsning. Det kan identifisere oligomerer og komplekser, og karakterisere vanskelige prøver, som glykoproteiner og membranproteiner. SEC-MALS er en absolutt metode.Det er avhengig av grunnleggende fysikk, og er ikke avhengig av samarbeid mot molekylære standarder, molekylets konformasjon eller hvordan vi samhandler med separasjonsmediet. SEC-MALS kan brukes på mange systemer som er adskilt av sek. Fra peptider og små polymerer til proteiner, nukleocapsids, polysakkarider, syntetiske polymerer, viruslignende partikler og små virus.Det er viktig å kontrollere at systemet og bufferne går glipp av leverandørens anbefalinger for lavt partikkelinnhold. Rådfør deg med leverandørens tekniske støtterepresentant for å være sikker. Start denne prosedyren med utarbeidelse av SEC-MALS-systemet som beskrevet i tekstprotokollen.Bruk hver PLC-klasse reagenser, forberede en liter fosfatbufret saltvann med 50 til 100 millimolar natriumklorid. Filtrer bufferen til 0,1 mikron ved hjelp av et flaskevannscelleskumfilter, eller lignende. Filtrer de første 50 til 100 milliliter buffer til en avfallsflaske for å eliminere partiklene fra de tørre filtrene.Deretter filtrerer du resten til en ren, steril flaske som tidligere har blitt vasket med filtrert, deionisert vann og holdt for å hindre at støv kommer inn. Skyll kolonnen over natten med en strømningshastighet på 0,5 milliliter per minutt for å likevekte kolonnen i bufferen og fjerne partikler. Bruk FPLC kontinuerlig flytmodus og sørg for at flyten ikke stopper før alle SEC-MALS-kjøringer er fullført.Plasser DRI-strømningscellen i rensemodus under innfelt over natten. Når du begynner flush, gradvis rampe strømningshastigheten for å hindre kolonnen shedding effekt, forårsaket av en plutselig endring av trykk i kolonnen. Slå av tømmingen før prøvekjøringen startes.Kontroller systemets renslighet ved å trykke lett på slangen nedstrøms av kolonnen for å frigjøre akkumulerte partikler. Ta hensyn til signalet i 90-gradersdetektoren på frontpanelvisningen på MALS-instrumentet. Kontroller at topp-til-topp-støyen ikke er mer enn 50-100 mikrovolt.Kontroller også at brytningsindeksen, eller RI-signalet, er stabilt til mindre enn 1 ganger ti til minus syv brytningsindeksenheter. Utfør en tom injeksjon for å kontrollere at injektoren er ren for partikler. En blank er rett og slett løpebufferen tilberedt i et friskt, sterilt hetteglass.Hvis partikkeltoppen ikke er mer enn én milliliter i volum, og ikke mer enn fem millivolt over baseline, er systemet klart for prøver. Ellers kan du utføre ekstra tomme injeksjoner til de er rene, eller utføre vedlikehold for å rengjøre injektoren. Nå, forberede minst 200 mikroliter BSA på ett til to milligram per milliliter i SCC buffer.Filtrer proteinet til 02 mikrometer ved hjelp av et sprøytespissfilter. Kast de første dråpene med filtrat, for å eliminere partikler fra de tørre filtrene. Alternativt kan du sentrifugere prøven ved 10 000 ganger G i femten minutter for å muliggjøre nedbør av ikke-løselige aggregater og andre store partikler.Deretter injiserer du 100 mikroliter av BSA-løsningen i løkken. Åpne nytt eksperiment fra metoden i MALS-programvaremenyen. Velg deretter den elektroniske metoden fra mappen for lyssptrøingssystemmetoder.Hvis det finnes en DLS-detektor, velger du den elektroniske metoden fra lyssppingen med QELS-mappen. Angi parametere for eksempel- og mobilfasen i konfigurasjonsdelen. I den generiske pumpevisningen angir du strømningshastigheten til den som brukes i FPLC.Deretter navigerer du til den generiske pumpevisningen, løsningsmiddelgrenen, navnefeltet og velger PBS. Skriv inn navnet som BSA i injektorvisningen. Sett dn/dc til 0,185, sett A2 til 0, og sett UV-utryddelseskoeffisienten til 0,667 milliliter per mg centimeter.Merk av for Utløser ved automatisk injisering i prosedyredelen. Angi varigheten av kjøringen til 70 minutter, slik at data samles inn for hele hentydningen, til det totale permeasjonsvolumet for SEC-kolonnen er nådd. Start eksperimentet i MALS-programvaren ved å klikke på kjør-knappen.Det vil begynne å lese dataene etter å ha mottatt pulssignalet fra FPLC-instrumentet via MALS-detektoren. Null DRI-signalet ved å klikke på auto-null-knappen på instrumentets frontpanel. Arbeide i FPLC-programvaren, naviger til manuell, utfør manuelle instruksjoner, sett merke og sett inn navnet på proteinet og kjøringen.Bytt injeksjonsventilen fra manuell belastning til injeksjonsventil under strømningsbane. Inkluder et pulssignal ved å sette inn en 0,5 sekunders puls under IO-bokspuls digital ut. Dette vil utløse datainnsamling i MALS-programvaren.Nå injiserer du prøven i løkken. Klikk på utfør i FPLC-programvaren for å starte eksperimentkjøringen. Utfør analyse trinnvis under prosedyredelen i MALS-programvaren.Kontroller at topper vises med omtrent samme hentydningsvolum i UV, MALS og RI ved å kontrollere den grunnleggende samlingsvisningen. I den opprinnelige planen definerer du grunnlinjen for alle signaler. I toppvisningen definerer du toppene som skal analyseres, ved å klikke og dra musen.Velg de sentrale 50 % av hver topp. Velg først monomertoppen, og deretter dimertoppen. Under hver topp må du kontrollere de riktige verdiene for dn/dc og utryddelseskoeffisient ved 280 nanometer for BSA.Velg det sentrale området for toppene i prosedyrene, justeringsvisningen ved å klikke og dra musen. Klikk juster signaler, og deretter greit. I prosedyrene, band utvidelse visning, velg den sentrale 50% av monomer toppen.Kontroller at den brytningsindeksdetektoren er angitt som referanseinstrument. Deretter klikker du utfør passform, og gjelder for å matche UV- og lysspømesignalene til det brytningsindekssignalet. Zoom inn i toppene for å kontrollere at de overlapper svært tett innenfor de sentrale 50 til 70%, og klikk deretter greit.Velg topp én i prosedyrene, normaliseringsvisningen. Skriv inn 3.0 nanometer som RG-verdien, klikk normaliser, og klikk deretter ok. Vis grafen over resultatene i EASI-grafvisningen.Velg molarmasse fra rullegardinmenyen øverst i vinduet. Bruk kontroll, klikk og dra for å zoome inn i toppområdet. Hvis du vil vise de endelige tabulerte vektgjennomsnittsmasseresultatene for monomer- og dimertoppene, navigerer du til toppresultater, molarmasseøyeblikk, MW og velger resultatene, rapportsammendrag.Renhet rapporteres under toppresultater, massefraksjon. Fra filmenyen velger du lagre som metode, og lagrer de analyserte BSA-dataene som en standardmetode for fremtidige målinger av alle typer proteiner. Normaliserings- og båndoppdysningsparametrene som bestemmes for BSA, vil bli overført i analysen.Vist her er SEC-MALS analyser av BSA, ved hjelp av en 200 Angstrom pore størrelse utelukkelse kolonne. Kromatrammespor normaliseres til monomertoppen, og kompenseres for klarhet. Vanlige artefakter som kan ignoreres påpekes, inkludert en partikkeltopp nær begynnelsen av lysspødsignalet, samt salt- og oppløste lufttopper nær det totale permeasjonsvolumet i det brytningsindekssignalet.Kromatrammet viser utmerket monomer-dimer-trimer separasjon, og lysspistende signalet viser høyt signal til støy. Monomer og dimer vekt gjennomsnittlig molar masse verdier viser høy homogenitet. Her er eksempler på lav kvalitet SEC-MALS analyser.I dette eksemplet resulterer utilstrekkelig separasjon på en 75 Angstrom pore størrelse ekskluderingskolonne i en partikkeltopp mellom åtte til ni minutter, som ikke er godt skilt fra proteinene. Her er det et utilstrekkelig signal til støyforhold, og omfattende partikler ved siden av proteinene er tydelige i lysspistende signalet. Tastene til gode SEC-MALS-resultater velger en passende kolonne, slik at systemet er kalibrert med svakt lysspødstøy, og forhåndsfiltrering eller sentrifugering av prøvene for å fjerne partikler.Etter SEC-MALS kan proteinprøver analyseres ytterligere for binding av affinitet, bioliza, overflateplasmonresonans, isotermisk titreringskalorimetri, biolerid phorometry, mikroskala termoforese eller sammensetningsgradient, multivinklet lyssppreding. Proteinstrukturen kan bestemmes av røntgenkrystallografi, kryoelektronfeilkopi eller NMR.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Size-eksklusjon og ionebytterkromatografi på en SAXS tros

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode for å visualisere og analysere Membran samspill proteiner av transmisjonselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskjellige dimensjoner bruke automatisert krystallisering kombinert med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøyelse, ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi å optimalisere isolering av Exosomes fra menneskelig blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionebytte kromatografi (IEX) koblet til multi-Angle lysspredning (MALS) for proteiner og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte