Name: a mouse model of vascularized heterotopic spleen transplantation for studying spleen cell biology and transplant immunity
Uploaded: 2019-06-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity at JoVE.com

Gli autori ringraziano il centro di trapianto completo di Northwestern University e il programma Feinberg School of Medicine Research core per il supporto di risorse e finanziamenti. In particolare, la citometria a flusso e i servizi di istologia sono stati forniti dalla Northwestern University Flow citometria Core Facility e mouse istologia e fenotipizzazione laboratorio, rispettivamente, entrambi i quali sono supportati da NCI P30-CA060553 assegnato al Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Ringraziamo il signor nate Esparza per la correzione di questo manoscritto.

Tutte le procedure e l'uso animale in questo studio sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato interno per la cura e l'uso degli animali della Northwestern University (IACUC). In questo studio, 8 a 10 settimana vecchio CD 45.2 e CD 45.1 topi (entrambi su sfondo BALB/c, dal laboratorio di Jackson) sono stati utilizzati come donatori di milza e riceventi, rispettivamente, per creare modelli di trapianto di milza singenici. Tutti gli animali sono stati ospitati nell'ambiente sterile nelle strutture animal...

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Prove convincenti suggeriscono che i monociti derivati dalla milza giocano un ruolo importante nei processi infiammatori sterili come l'aterosclerosi19, il cervello ischemico acuto20 o il trauma polmonare18, così come I/R del miocardio lesioni e rimodellamento21,22,23. Questi rapporti evidenziano il ruolo di sotto-riconoscimento della milza in molte malatti...

La milza è il più grande organo linfoide secondario nel corpo ed è critica nei sistemi immunitari e ematopoietici. Le sue funzioni sono principalmente svolte da due compartimenti morfologicamente distinti, la polpa rossa e la polpa bianca1. La polpa rossa è un reticolo tridimensionale di seni venosi e corde spleniche costituite da fibre reticolari, cellule reticolari e macrofagi associati. Questa struttura unica permette alla polpa rossa di agire come un filtro del sangue efficace che rimuove i materiali estranei e gli eritrociti vecchi o danneggiati. La polpa bianca comprende i follicoli, la zona marginale e le guaine linfoidi periarteriolari (PALS) ed è un sito importante per l'intrappolamento e l'elaborazione di antigene, la produzione di linfociti, la trasformazione, la proliferazione e la maturazione2. Tuttavia, la milza è stata comunemente considerata come un organo dispensabile perché altri organi linfatici, come i linfonodi, possono anche svolgere alcune delle sue funzioni e la perdita della milza non porta di solito alla morte. La splenectomia è stata quindi ampiamente eseguita come metodo terapeutico per i pazienti con lesione splenica o malattie ematologiche benigne3. Tuttavia, i pazienti con splenectomia affrontano una serie di complicazioni a lungo termine. Le infezioni batteriche sono le complicanze più riconosciute della splenectomia4,5. Recentemente, la schiacciante sepsi post-splenectomia è stata riconosciuta come una complicazione intensiva di splenectomia associata ad un'alta mortalità6. Inoltre, recenti studi epidemiologici indicano che la splenectomia può essere associata al verificarsi di malattie cardiovascolari, suggerendo che ulteriori funzioni fisiologiche della milza restano da esplorare7,8.
Nella clinica sono stati utilizzati sia l'autotrandisplazione della milza che l'allotrapianto della milza. Attualmente, la milza autotrandisplazione impiantando sezioni di tessuto splenico in sacchetti creati nel maggiore omento è considerata l'unica possibilità per preservare la funzione splenica dopo la splenectomia traumatica9,10. Tuttavia, l'efficacia di questo intervento chirurgico è discutibile come complicazioni post-chirurgia come necrosi asettica del tessuto splenico e piccola ostruzione intestinale a causa di aderenze postoperatorie potrebbe verificarsi11. L'allotrapianto della milza è coinvolto nel trapianto multiviscerale12. Le evidenze cliniche del trapianto multiviscerale suggeriscono che l'allotrapianto della milza può svolgere un ruolo protettivo nel rigetto dell'alloinnesto dell'intestino tenue senza causare la malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD)12. Eppure la letteratura riguardante l'effetto benefico dell'allotrapianto della milza come componente del trapianto multiviscerale è ancora limitata e i meccanismi sottostanti restano da definire. Nel 2006, Yair Reisner et al. ha riferito che trapiantare il tessuto della milza embrionale suina che non ha cellule T ai topi potrebbe curare l'emofilia A, una malattia genetica senza causare GVHD13, sostenendo che il trapianto di milza detiene una promessa terapeutica in alcune malattie. Pertanto, vi è la necessità di ulteriori indagini sul potenziale terapeutico del trapianto di milza.
I modelli animali di trapianto di milza sono preziosi per esplorare la funzione non apprezzata delle cellule immunitarie derivate dalla milza nella progressione della malattia e per testare il potenziale effetto terapeutico del trapianto di milza. I modelli sperimentali di trapianto di milza interi sono stati documentati fin dai primi anni del 1900, come Recensito da Cohen14. Nel 1969, Coburn Richard J. e Lee et al. dettagliato la tecnica del trapianto di milza in ratti15,16. Più di recente, Swirski FK et al. ha descritto un modello murino di trapianto di milza17. Rispetto ai modelli di ratto, i modelli murini di trapianto di milza sono più attraenti a causa dei suoi numerosi vantaggi intrinseci. Ad esempio, utilizzando un modello di mouse, possiamo accedere a un'ampia varietà di reagenti non disponibili a quello dei modelli di ratto. Inoltre, utilizzando topi Congenici (ad es. topi con CD 45.1/CD 45.2 background), un trapianto di milza singenici permette di tracciare il destino, la longevità e la funzione delle splenociti18. Sulla base del lavoro di Swirski FK et al.17, abbiamo ulteriormente istituito questo protocollo semplificato e migliorato del trapianto di milza nei topi. Il protocollo descritto di seguito combina l'affidabilità e la fattibilità in modo standardizzato e può essere utilizzato come strumento per studiare la biologia della milza e l'immunità ai trapianti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Wyeth</td>
			<td>206205-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin solution</td>
			<td>Abraxis Pharmaceutical Products</td>
			<td>504031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection grade normal saline</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Pharmco Products Inc.</td>
			<td>111000140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoCare Small Animal ICU System</td>
			<td>Thermocare, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments</td>
			<td>RS-5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Derf Needle Holder</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments</td>
			<td>RS-7822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments</td>
			<td>RS-5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-clip</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments</td>
			<td>RS-5420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 silk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle</td>
			<td>Sharpoint DR4</td>
			<td>AK-2119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD45.2 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD45.1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms B220 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly6C antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-5932-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>565614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11c antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>558079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0032-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>552051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>563786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD&#8482; Fixable Violet Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L34955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model of vascularized heterotopic spleen transplantation for studying spleen cell biology and transplant immunity

La milza è un organo linfoide unico che svolge un ruolo critico nell'omeostasi dei sistemi immunitari e ematopoietici. I pazienti che sono stati sottoposti a splenectomia indipendentemente dalle cause precipitose sono inclini a sviluppare un'infezione post-splenectomia travolgente e sperimentano un aumento dei rischi di trombosi venosa profonda e neoplasie maligne. Recentemente, studi epidemiologici hanno indicato che la splenectomia potrebbe essere associata al verificarsi di malattie cardiovascolari, suggerendo che le funzioni fisiologiche della milza non sono ancora state pienamente riconosciute. Qui, introduciamo un modello murino di trapianto di milza eterotopica vascolarizzata, che non solo può essere utilizzato per studiare la funzione e l'attività comportamentale dei sottogruppi di cellule immunitarie spleniche in diversi processi biologici, ma può anche essere un potente strumento per testare il potenziale terapeutico del trapianto di milza in certe malattie. Le principali fasi chirurgiche di questo modello includono la raccolta della milza del donatore, la rimozione della milza nativa ricevente e la rivascolarizzazione del trapianto di milza. Usando ceppi di topo Congenici (ad es. topi con CD 45.1/CD 45.2 background), abbiamo osservato che dopo il trapianto syngeneico, entrambi i linfociti splenici e le cellule mieloidi derivate dal donatore migrarono fuori dal trapianto già nel giorno 1 post-operatorio, in concomitanza con l'afflusso di molteplici tipi di cellule riceventi, generando così una chimera unica.  Nonostante le tecniche relativamente impegnative, questa procedura può essere eseguita con > 90% tasso di successo. Questo modello consente di tracciare il destino, la longevità e la funzione dei splenociti durante lo steady state e in un setting di malattia a seguito di un trapianto di milza, offrendo così una grande opportunità per scoprire il ruolo distinto delle cellule immunitarie derivate dalla milza in diversi processi di malattia.

L'intera procedura del trapianto di milza del topo può essere completata entro 90 minuti da microchirurghi esperti. Il nostro laboratorio ha eseguito oltre 100 trapianti di milza nei topi. Il tasso di successo è superiore al 90%, come definito dalla sopravvivenza sia del topo ricevente che dell'innesto della milza al giorno post-operatorio (POD) 1 o POD 7 (il nostro endpoint di studio). La sopravvivenza dell'innesto della milza è stata confermata dall'aspetto macroscopico e dall'analis...

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A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity

Un modello murino del trapianto di milza eterotopica vascolarizzata per studiare la biologia delle cellule della milza e l'immunità ai trapianti

Questo protocollo descrive le fasi chirurgiche di un modello murino di trapianto di milza eterotopica vascolarizzata, un modello tecnicamente impegnativo che può fungere da potente strumento per studiare il destino e la longevità delle cellule della milza, i meccanismi della milza distinta popolazioni di cellule nella progressione della malattia e immunità ai trapianti.

The spleen is a unique lymphoid organ that plays a critical role in the homeostasis of the immune and hematopoietic systems. Patients that have undergone ...

Il modello di topo del trapianto di milza offre una grande opportunità per scoprire il ruolo delle cellule di milza nella regolazione delle risposte immunitarie locali e sistemiche nelle malattie infiammatorie. Il principale vantaggio di questo protocollo è che utilizzando topi congenici, il trapianto di milza consente di controllare il destino, la longevità e la funzione delle cellule di milza. Prima di iniziare la procedura, posizionare un drappo monouso sterile sulla piattaforma chirurgica e confermare la mancanza di risposta al dito del piedi nel topo donatore anestetizzato.Radere i capelli da tutta l'area addominale e posizionare il mouse su una piattaforma chirurgica sterile sotto un microscopio operativo con un ingrandimento da 6 a 10X. Sterilizzare la pelle esposta con un tampone di preparazione alcolica e fissare gli arti con nastro chirurgico. Entra nell'addome tramite un'incisione verticale della pelle della linea mediana da tre a quattro centimetri dal pube al processo xifoide.Cauterizzare i vasi cutanei ed estendere l'incisione all'addome laterale su entrambi i lati per ottenere una migliore esposizione. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, spostare l'intestino sul fianco destro dell'addome per esporre la milza e utilizzare un cautery sterile a bassa temperatura per cauterizzare la vena gastrica corta attaccata alla milza. Posizionare un pezzo di garza sterile imbevuto di 37 gradi Celsius salina sopra la milza per mantenerlo umido e separato e mobilitare la vena porta dal tessuto pancreatico.Ligate i rami della vena portale come dimostrato. Posizionare una sutura intorno alla vena porta distale dalla vena splenica e capovolgere la milza sul lato destro per esporre l'aorta e l'arteria splenica sul tronco celiaco. Sezionare e mobilitare le arterie spleniche celiache aortiche e posizionare una sutura intorno all'aorta prossimale all'arteria celiaca.Iniettare 100 unità internazionali di eparina nella vena cava inferiore o nell'IVC per eparinare tutto il corpo. Dopo tre minuti, legare le arterie epatiche e gastriche nell'aorta prossimale all'arteria celiaca. Trasezionare la vena porta e perfondire tutto il corpo con 10 millilitri di quattro gradi Celsius eparinato salina dall'aorta addominale distale al tronco celiaco.Raccogliere l'innesto di milza e bloccare con il segmento splenico celiaco aortico associato nella vena porta insieme al segmento della vena splenica e una piccola porzione di tessuto pancreatico. Quindi conservare l'innesto in cinque millilitri di quattro gradi Celsius salina. Entra nell'addome ricevente tramite incisione della linea mediana dopo che l'area chirurgica è preparata come lo è per il donatore e rimuovi la milza nativa ricevente legando la vena e l'arteria splenica.Coprire i tessuti dell'intestino con una garza imbevuta di 37 gradi Celsius e spostare attentamente l'intestino sul lato sinistro. Sezionare e ligare i rami lombari dell'aorta infrarenale nell'IVC e bloccare l'aorta infrarenale nell'IVC con due morsetti microvascolari a quattro millilitri. Posizionare una sutura di nylon 11-0 attraverso l'aorta infrarenale e ritrarre il vaso per consentire la creazione di un'aortotomia ellittica con microscissori.Utilizzare un ago calibro 30 per perforare l'IVC per creare una velenotomia ellittica ed estendere l'apertura alla lunghezza della vena portale del donatore. Sciacquare l'aorta e l'IVC con 500 microlitri di soluzione salina eparinizzata per cancellare il sangue intraluminale o i coaguli di sangue dai vasi e posizionare l'innesto di milza del donatore nel fianco destro dell'addome ricevente. Identificare attentamente il polsino aortico del donatore e la vena porta.Dopo aver confermato che i vasi non sono attorcigliati, coprire l'innesto di milza con garza salina a quattro gradi Celsius imbevuta. Utilizzando due suture di permanenza 11-0, collegare il polsino aortico donatore all'apice prossimale e distale dell'aortotomia ricevente e fare un'anastomosi con due o tre morsi di suture di nylon continue 11-0 tra il polsino aortico del donatore e la parete anteriore dell'aortotomia ricevente. Ruotare l'innesto di milza sul lato sinistro del ricevente e fare l'anastomosi tra il polsino aortico del donatore e la parete posteriore dell'aortotomia ricevente.Eseguire l'anastomosi venosa tra la vena portale del donatore e l'IVC ricevente con da quattro a cinque morsi di suture continue su ciascun lato. Suturare prima la parete posteriore all'interno del lume del vaso e poi chiudere la parete anteriore usando la stessa sutura. Completare l'anastomosi con un nodo posto nell'angolo inferiore all'esterno dell'IVC.Ora rilasciare i morsetti del recipiente e utilizzare un batuffolo di cotone sterile per tamponare il sanguinamento fino a quando il colore della milza non viene recuperato. Chiudere l'addome con una sutura Vicryl sintetica assorbibile 5-0 in un motivo continuo e chiudere lo strato cutaneo con una sutura di nylon 5-0 in un motivo interrotto. Quindi iniettare 250 microlitri di soluzione salina calda sottocutaneamente in quattro posizioni separate e riscaldare il mouse in un incubatore a temperatura controllata di 30 gradi Celsius per le prime ore dopo l'operazione con monitoraggio fino a quando l'animale non ha ripreso sufficiente coscienza per il trasferimento nella gabbia domestica.L'ematossilina e l'eosina degli isografti di milza giorni uno e sette dopo il trapianto rivelano che l'architettura degli isografti di milza rimane intatta durante la prima settimana post operatoria. L'analisi citometrica del flusso per indagare la migrazione delle cellule di milza del donatore dopo il trapianto dimostra che circa il 50% delle cellule di milza sono derivate da donatori un giorno dopo il trapianto e circa il 46% è derivato dal ricevente. Sette giorni dopo il trapianto, i leucociti derivati dal donatore rappresentano circa il 32% delle cellule di milza totale, mentre le cellule derivate dal ricevente sono aumentate fino a circa il 53% I leucociti splenici donatori migrati anche nei linfonodi, nel sangue e nel midollo osseo già dal primo giorno e vengono mantenuti ad almeno il settimo giorno generando una Chimera unica preziosa per la ricerca sul traffico di splenociti.L'uso di topi knock-in geneticamente modificati come donatori di milza consentirà di investigare il ruolo dei mediatori derivati dalle cellule di milza o delle principali vie di segnalazione nei processi di malattia. Questo modello potrebbe essere un potente strumento per esplorare i meccanismi delle popolazioni di cellule di milza in risposta a agenti patogeni, lesioni, infiammazioni o rigetto del trapianto.

Research

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Medicine

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