Name: studying organelle dynamics in b cells during immune synapse formation
Uploaded: 2019-06-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation at JoVE.com

M.-I.Y. è supportato da una borsa di ricerca di FONDECYT #1180900. J.I., D.F. e J.L. sono stati sostenuti da borse di studio del Comisiàn Nacional de Ciencia y Tecnolog. Ringraziamo David Osorio della Pontificia Universidad Catalia de Chile per la registrazione video e l'editing.

NOTA: i seguenti passaggi sono stati eseguiti utilizzando le celle IIA1.6 B.
1. Attivazione a cellule B con perline rivestite di antigene
<ol><li>Preparazione di perline rivestite di antigene
	<ol>
<li>Per attivare le cellule B, utilizzare le perline NH2rivestite covalentmente con antigene (Ag-coated beads), che vengono preparate utilizzando antigeni 50 (20 x 106) di 3 perline NH2con antigeni di attivazione (BCR-ligand) o non attivanti (BCR-ligand-).</li>
		<li>P...

<ol>
	<li>Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+Acquire+Particulate+Antigen+in+a+Macrophage-Rich+Area+at+the+Boundary+between+the+Follicle+and+the+Subcapsular+Sinus+of+the+Lymph+Node.">Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node.</a> Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+at+the+centrosome+controls+lymphocyte+polarity.">Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+antigen+extraction+in+the+B+cell+synapse.">Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse.</a> Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).</li><li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+Receptor-Mediated+Antigen+Gathering+Requires+Ubiquitin+Ligase+Cbl+and+Adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+Recruit+Dynein+to+the+Signaling+Microcluster.">B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster.</a> Immunity. , (2011).</li><li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap1+&#8211;+cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse.">The Rap1 &#8211; cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).</li><li>Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+ligand+discrimination+through+a+spreading+and+contraction+response.">B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response.</a> Science. 312 (5774), 738-741 (2006).</li><li>Vascotto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin-based+motor+protein+myosin+II+regulates+MHC+class+II+trafficking+and+BCR-driven+antigen+presentation.">The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation.</a> Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).</li><li>Reversat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3+controls+B-cell+receptor+dynamics+and+antigen+extraction+at+the+immune+synapse.">Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse.</a> Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).</li><li>Lankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Major+Histocompatibility+Complex+Class+II+Compartments+during+B+Cell+Receptor&#8211;mediated+Cell+Activation.">Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor&#8211;mediated Cell Activation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).</li><li>Duchez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Polarization+of+T+and+B+Cells+at+the+Immunological+Synapse.">Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse.</a> The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).</li><li>P&#233;rez-Montesinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+the+intracellular+association+of+selected+rab+small+GTPases+with+MHC+class+II+and+DM+during+dendritic+cell+maturation.">Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation.</a> Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).</li><li>Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre&#180;, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume&#180;nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk-dependent+Actin+Dynamics+Regulate+Endocytic+Trafficking+and+Processing+of+Antigens+Internalized+through+the+B-Cell+Receptor.">Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor.</a> Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).</li><li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Isolation+of+Centrosomes+from+Cultured+Cells.">Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).</li><li>Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+centrosomes+from+mammalian+cell+lines.">Purification of centrosomes from mammalian cell lines.</a> Methods in Cell Biology. 129, (2015).</li><li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vamp-7&#8211;dependent+secretion+at+the+immune+synapse+regulates+antigen+extraction+and+presentation+in+B-lymphocytes.">Vamp-7&#8211;dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+B+Cell+Activation+BCR:+B+cell+receptor.">Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor.</a> Annual Review of Immunology. , (2010).</li><li>Yuseff, M. I., Lennon-Dum&#233;nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+use+conserved+polarity+cues+to+regulate+their+antigen+processing+and+presentation+functions.">B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).</li></ol>

Descriviamo un metodo completo per studiare come i linfociti B riorganizzano la loro architettura intracellulare per promuovere la formazione di un IS. Questo studio include l'uso di tecniche di imaging per quantificare la distribuzione intracellulare di organelli, come centrosome, apparato di Golgi e lisosomi durante l'attivazione della cellula B, e come si polarizzano all'IS. Inoltre, descriviamo un approccio biochimico allo studio dei cambiamenti nella composizione centrosoria dopo l'attivazione delle cellule B.
<...

I linfociti B sono una parte essenziale del sistema immunitario adattivo responsabile della produzione di anticorpi contro diverse minacce e dell'invasione degli agenti patogeni. L'efficienza della produzione di anticorpi è determinata dalla capacità delle cellule B di acquisire, elaborare e presentare antigeni incontrati in forma solubile o con tebranda superficiale1,2. Il riconoscimento degli antigeni attaccati alla superficie di una cellula di presentazione, da parte del BCR, porta alla formazione di uno stretto contatto intercellulare chiamato IS3,4. All'interno di questa piattaforma dinamica avviene sia la segnalazione a valle dipendente da BCR che l'internalizzazione degli antigeni in compartimenti endososomi. Gli antigeni assorbiti vengono elaborati e assemblati su molecole MHC-II e successivamente presentati ai linfociti T. Le interazioni B-T produttive, definite cooperazione cellulare B-T, permettono ai linfociti B di ricevere i segnali appropriati, che promuovono la loro differenziazione in plasmacellule o celle di memoria che producono anticorpi o cellule di memoria8.
Due meccanismi sono stati coinvolti nell'estrazione dell'antigene da parte delle cellule B. Il primo si basa sulla secrezione di proteasi provenienti da lisosomi che subiscono il reclutamento e la fusione presso la fessura sinaptica5,6. Il secondo, dipende da forze di trazione mediate Myosin IIA che innesca l'invaginazione dell'antigene contenente membrane che sono internalizzate in pozzi rivestiti di clathrin7 . La modalità di estrazione dell'antigene si basa sulle proprietà fisiche della membrana in cui si trovano gli antigeni. Tuttavia, in entrambi i casi, le cellule B subiscono due grandi eventi di rimodellamento: la riorganizzazione del citoscheletro actin e la polarizzazione degli organelli all'IS. Il rimodellamento del citoscheletro actina comporta una fase iniziale di diffusione, in cui le protrusioni dipendenti dall'actina nella membrana sinaptica aumentano la superficie a contatto con l'antigene. Segue una fase di contrazione, in cui le BCR accoppiate con gli antigeni sono concentrate al centro dell'IS dall'azione concertata dei motori molecolari e del rimodellamento del citoscheletro actina8,9,10, 11. La polarizzazione degli organelli si basa anche sulla ristrutturazione del citoscheletro actin. Ad esempio, il centrosore diventa disaccoppiato dal nucleo, dalla depolimerizzazione locale dell'actina associata,che consente il riposizionamento di questo organello all'IS 5,12. Nelle cellule B, il riposizionamento del centrosore a un polo cellulare (IS) guida il reclutamento di lisomi nella membrana sinaptica, che alla secrezione può facilitare l'estrazione e/o l'elaborazione di antigeni ad essere tesi dalla superficie6. I lisosomici reclutati all'IS sono arricchiti da MHC-II, che favorisce la formazione di complessi peptidi-MHC-II in compartimenti endosomici da presentare alle cellule T13. Inoltre, l'apparato di Golgi è stato osservato anche per essere reclutato da vicino all'IS14, suggerendo che le vesciche derivate da Golgi dal percorso secretoria potrebbero essere coinvolte nell'estrazione e/o nella lavorazione degli antigeni.
Complessivamente, i riarrangiamenti intracellulari di organelli e citoscheletri nelle cellule B durante la formazione di sinapsi sono i passi chiave che consentono un'efficiente acquisizione e elaborazione di antigeni necessari per la loro ulteriore attivazione. In questo lavoro introduciamo protocolli dettagliati su come eseguire l'imaging e l'analisi biochimica nelle cellule B per studiare il rimodellamento intracellulare degli organelli associati alla formazione di un IS. Queste tecniche includono: (i) Immunofluorescenza e analisi delle immagini delle cellule B attivate con perline rivestite di antigeni e su coverlips rivestiti di antigeni, che consente la visualizzazione e la quantificazione di componenti intracellulari mobilitati all'IS e (ii ) isolamento delle frazioni arricchite di centrosomi nelle cellule B mediante ultracentrifugazione su gradienti di saccarosio, che consente l'identificazione delle proteine associate al centroso, potenzialmente coinvolto nella regolazione della polarità cellulare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells</td>
			<td style="width:74px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-208</td>
			<td style="width:172px;">Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without Fc&#947;IIR</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">100% methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular</td>
			<td>Marienfield-Superior</td>
			<td align="right">111500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>LifeTech&#160;</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit &#160;IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A-11071</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A21238</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amaxa Nucleofection kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1003</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amaxa Nucleofector model 2b</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program L-013 used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amino- Dynabeads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14307D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-pericentrin</td>
			<td>&#160;Abcam</td>
			<td>ab4448&#160;</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-rab6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95954</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-sec61</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15575</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BSA</td>
			<td>&#160;Winkler</td>
			<td>&#160;BM-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>CA-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Culture plate T25</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">353014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fiji Software</td>
			<td style="width:74px;">Fiji col.</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fluoromount G</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G7651&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glycine</td>
			<td>Winkler&#160;</td>
			<td>BM-0820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>IIA1.6 positive ligand</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Goat-anti-mouse IgM antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">31186</td>
			<td>IIA1.6 negative ligand</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HyClone Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivate at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>PO-1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Leica SP8 TCS microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>SO-1455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope</td>
			<td>&#160;Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Parafilm</td>
			<td>M</td>
			<td>P1150-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Polybead Amino Microspheres 3.00&#956;m</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>17145-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Dilute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti- alpha tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>1:1000 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti mouse lamp1 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td align="right">3243</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti-cep55&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170414</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody</td>
			<td>&#160;Abcam</td>
			<td>ab16504</td>
			<td>&#160;1:1000 for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RPMI-1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-104-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Saponin</td>
			<td>&#160;Merck</td>
			<td align="right">558255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sucrose</td>
			<td>Winkler&#160;</td>
			<td>SA-1390&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Triton X-100</td>
			<td>&#160;Merck</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying organelle dynamics in b cells during immune synapse formation

Il riconoscimento degli antigeni legati alla superficie da parte del recettore delle cellule B (BCR) innesca la formazione di una sinapsi immunitaria (IS), in cui sono coordinati sia la segnalazione che l'assorbimento dell'antigene. La formazione dell'IS comporta un rimodellamento dinamico dell'actina accompagnato dal reclutamento polarizzato nella membrana sinaptica degli organelli centrocellulari e intracellulari associati come i lisosomi e l'apparato di Golgi. Le fasi iniziali del rimodellamento dell'actin consentono alle cellule B di aumentare la superficie cellulare e massimizzare la quantità di complessi antigene-BCR raccolti alla sinapsi. In determinate condizioni, quando le cellule B riconoscono gli antigeni associati alle superfici rigide, questo processo è accoppiato al reclutamento locale e alla secrezione di lisosomi, che possono facilitare l'estrazione dell'antigene. Gli antigeni assorbiti vengono internalizzati in compartimenti endolsomici specializzati per la lavorazione in peptidi, che vengono caricati su molecole principali del complesso di istocompatibilità II (MHC-II) per un'ulteriore presentazione alle cellule che aiutano T. Pertanto, studiare le dinamiche di orgelli associate alla formazione di un IS è fondamentale per comprendere come vengono attivate le cellule B. Nel presente articolo discuteremo sia l'imaging che una tecnica biochimica utilizzata per studiare i cambiamenti nel posizionamento degli organelli intracellulari e nei riarrangiamenti del citoscheletro associati alla formazione di una IS nelle cellule B.

Il presente articolo mostra come le cellule B possono essere attivate utilizzando antigene immobilizzato su perline o coverlips per indurre la formazione di un IS. Forniamo informazioni su come identificare e quantificare la polarizzazione di diversi organelli mediante immunofluorescenza e come caratterizzare le proteine che subiscono cambiamenti dinamici nella loro associazione al centrosome, che si polarizza all'IS, approccio biochimico.
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation at JoVE.com

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Qui descriviamo due approcci per caratterizzare gli eventi di polarizzazione cellulare nei linfociti B durante la formazione di un IS. Il primo, comporta la quantificazione del reclutamento di organelli e riarrangiamenti del citoscheletro nella membrana sinaptica. Il secondo è un approccio biochimico, per caratterizzare i cambiamenti nella composizione del centrosome, che subisce la polarizzazione alla sinapsi immunitaria.

Studiare le dinamiche di Organelle nelle cellule B durante la formazione immunitaria di sinapsi

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

In questa recensione, discuteremo sia le tecniche di imaging che biochimiche utilizzate per studiare il posizionamento e la composizione degli organelli, nonché i riarrangiamenti del citoscheletro osservati durante la formazione di una sinapsi immunologica. Le fasi iniziali del rimodellamento attivo consentono alle cellule B di aumentare la loro superficie cellulare e massimizzare la quantità di complessi BCR antigeni raccolti alla sinapsi. D'altra parte, il reclutamento locale di lisosomi, insieme al centrosoma alla membrana sinaptica, può essere accoppiato alla secrezione di lisosomi, nota per facilitare l'estrazione di antigeni immobilizzati.L'antigene uptaken viene ulteriormente elaborato all'interno di compartimenti endolisosomi in peptidi, che vengono caricati su molecole MHC di classe II per la presentazione alle cellule di aiuto T. Pertanto, lo studio della dinamica organelle associata alla sinapsi immunitaria è fondamentale per capire come le cellule B sono completamente attivate. L'immunofluorescenza delle cellule B attivate con antigeni immobilizzati ci permette di seguire diversi componenti cellulari e come possono essere reclutati nella sinapsi immunitaria.Le cellule B possono essere attivate attraverso antigeni immobilizzati su una superficie di perline o una superficie di coprispaglia. Le perline rivestite di antigene vengono preparate incubando ligandi specifici con amino-perline precedentemente trattate con glutaraldeide per attivare gli amminoacidi. Resuspend attivava perline in 100 microlitri di PBS e vortice.Nel frattempo, preparare la soluzione di antigene aggiungendo 100 microgrammi per mL di ligando BCR in 150 microlitri di PBS. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di perline attivate alla soluzione di antigene e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Ricorda, usa anche un ligando non correlato come controllo negativo.Dopo l'incubazione, lavare le perline con PBS. Aspirare il supernatante e sostituirlo con PBS. Ripeti tre volte.Successivamente, bloccare i tre ammino gruppi con perline rimescolate in 500 microlitri di una soluzione di BSA. Infine, resuspend perline in 70 microlitri di PBS. Per calcolare la concentrazione finale, è possibile utilizzare un emocitometro per contare le perline.Per l'attivazione delle cellule B, utilizzare un tubo da 50 ml e cellule resuspend ad una concentrazione di 1,5 milioni per ml in CLICK integrata con siero bovino fetale al 5%. Successivamente, aggiungere 150.000 cellule B, corrispondenti a 100 microlitri della miscela di perline cellulari a un coverslip ad incubato rivestito in poli-L-lisina ad incubare a 37 gradi per i diversi punti di tempo. Un secondo approccio per attivare le cellule B è seminarle su coverlips rivestiti di antigene.A questo scopo, rivestire le diapositive con anti-BCR e B220 con migliora l'adesione cellulare. Preparare la soluzione di antigene aggiungendo rispettivamente anti-BRC e B220 in PBS a una concentrazione finale di 10 microgrammi per mL e 0,5 microgrammi per mL. Successivamente, impostare il coperchio su un coperchio di 24 piastre ben coperte con pellicola parafilm e aggiungere 40 microlitri di soluzione di antigene.Sigillare il piatto e quindi incubare a 4 gradi durante la notte. Per iniziare l'attivazione in coverslip, prima lavarli con PBS e lasciarli asciugare per alcuni minuti. Quindi, aggiungere 150.000 cellule B e incubare a 37 gradi per i diversi punti di tempo.In entrambi i casi, quando si attiva con perline o diapositive rivestite di antigene, si consiglia di iniziare con il punto di tempo più lungo e quindi procedere a quelli più brevi. Una volta montato il coverslip asciutto sullo scivolo del microscopio, è possibile utilizzare un'epifluorescenza o un microscopio confocale per visualizzare i campioni, a seconda dei requisiti di risoluzione. Mettere a fuoco il campione utilizzando la luce trasmessa.È necessario cercare i campi in cui celle e perline interagiscono con un rapporto uno e uno. Per le cellule B attivate su coverlip coperte da antigene, utilizzare l'obiettivo 100x per una migliore risoluzione. Per i parametri, prendere in considerazione l'assunzione di uno stack z che copra l'intera cella.È possibile etichettare actin per delimitare i limiti inferiore e superiore della cella. Per le cellule B attivate con perline rivestite di antigene ed etichettarle per organelli confinati in un punto, prima delimitare due aree: l'area cellulare e l'area del tallone. Successivamente, identificare la posizione o l'organelli di un punto e ottenere le sue coordinate di localizzazione.Disegna due vettori:uno tra il centro cellulare e l'organelli e l'altro tra il centro cellulare e il centro del tallone. Misurare la lunghezza di entrambi e misurare l'angolo tra i due vettori, ora indicato come alfa. Fare una proiezione con il vettore tra il centrosoma e il centro cellulare usando il guassian di alfa e quindi calcolare l'indice di polarità dell'organelle dividendo il vettore proiettato, a, per b.Quindi un indice di polarità tra zero e uno indica un fenotipo polarizzato. I valori compreso tra zero e meno uno indicano un fenotipo non polarizzato. Per determinare l'indice di polarità per organelli più dispersi, come i lisosomi, è possibile utilizzare lo stesso algoritmo menzionato in precedenza, cambiando le coordinate di localizzazione degli organelli per le coordinate del centro di massa delle etichette, in questo caso i lisosomi.Analogamente all'analisi descritta in precedenza, un indice di polarità tra zero e uno indica un fenotipo polarizzato, mentre i valori tra zero e meno uno indicano un fenotipo non polarizzato. Per quantificare la quantità di ogni organelle strettamente reclutato nella nuova sinapsi, è possibile calcolare la percentuale della fluorescenza dell'organelle al tallone. Per questo, è necessario delimitare il tallone e l'area cellulare, misurare la rispettiva intensità di fluorescenza e quindi dividere la fluorescenza del tallone per la somma del tallone e della fluorescenza cellulare.Troverete la quantità di ogni organelli che è a contatto con la nuova sinapsi. In alternativa, disegnare un rettangolo opposto alla perla. Utilizzare un peso corrispondente a un quarto della lunghezza della cella, quindi misurare l'intensità della fluorescenza all'interno del rettangolo e dividerlo per la fluorescenza totale.Questo algoritmo sarà sempre quello di ottenere la percentuale di organelli che è strettamente alla nuova sinapsi, ma non necessariamente a diretto contatto con l'interfaccia. Per quantificare i componenti associati al centrosoma nelle celle B a riposo e attivate. In breve, determiniamo tre parametri.L'area della cellula e del tallone e le coordinate di localizzazione centrosomale. Successivamente, definiamo un cerchio che circonda il centrosoma ed eseguiamo un'analisi del profilo radiale dal centro del centrosoma, precedentemente definito. Una volta che si dispone del plottaggio, determinare il raggio in cui viene mantenuto il 70% della fluorescenza massima.Utilizzate questo raggio per disegnare un cerchio che circonda il centrosoma. Infine, ottenere la densità di fluorescenza del componente di interesse nell'area centrosoma e nell'area cellulare, e dividere entrambi i valori per ottenere il rapporto di densità fluorescente. Per misurare la distribuzione degli organelli all'interfaccia della sinapsi immunitaria, identificare prima l'area delle cellule B a contatto con il coverslip rivestito di antigene.Puoi etichettare actin per aiutarti a definire quest'area. Quindi, misurare l'area a contatto con la diapositiva, l'altezza e la larghezza della cella. L'area di fronte allo slittamento del coperchio rivestito di antigene è una misura della diffusione della cellula B all'attivazione della cella B.Utilizzare i valori di altezza e larghezza per delimitare un'area centrale della cella, separata dai limiti da un quarto dei valori di altezza e larghezza. Di solito questi corrispondono a circa un terzo dell'area totale della cella. Infine, calcolare il reclutamento degli organelli al centro della nuova sinapsi, dividendo la densità di fluorescenza nell'area centrale per la densità di fluorescenza dell'intera cellula.I valori positivi di questo indice indicano un arricchimento dell'organelli al centro della nuova sinapsi. Al contrario, i valori negativi indicano una distribuzione periferica. Per misurare la distribuzione degli organelli attraverso i piani Z delle cellule B attivati su coverlips rivestiti di antigene, prima delimitare l'interfaccia sinaptica e il limite superiore della cellula.Quindi, disegna una linea attraverso il centro della cella e riselizza l'immagine per ottenere un'immagine XZ. Misurare la testa della cellula e dividere l'immagine in 10 frazioni della stessa area, dalla sinapsi immunitaria al limite superiore della cellula. Misurare la fluorescenza in ogni frazione z e calcolare la percentuale di fluorescenza dividendo la fluorescenza ad ogni frazione z per la fluorescenza totale della cellula.Infine, tracciare la percentuale di intensità di fluorescenza per frazione z. La frazione uno e due rappresentano l'interfaccia sinaptica. Ecco il flusso di lavoro o la procedura di isolamento centrosoma.Utilizzare 20 milioni di cellule B per condizione. Pre-trattare le cellule con citocalcasina D e Nocodazolo secondo il protocollo richiesto per facilitare il distacco di centrosoma. Quindi, guarda le cellule rimontettandole in 5 mL di buffer TBS.Ripetere utilizzando 1 mL di tampone TBS 0,1x integrato con l'8% di saccarosio. Rimescolare il pellet cellulare con 150 microlitri di tampone dilisi. Centrifuga a 10.000 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius per separare il citosolo e gli organelli dal nucleo.Recuperare con cura il supernatante cellulare e posizionarlo sopra un tubo da 1,5 ml. Riempirlo con 300 microlitri di tampone di gradiente integrati con il 60% di saccarosio. Centrifuga i campioni a 10.000 g per 30 minuti a 4 gradi Celsius.Questo passaggio di centrifugazione è importante per concentrare i centrosomi. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il supernatante fino a raggiungere l'interfaccia. Vortice il campione rimanente nel tubo.Preparare il gradiente di saccarosio discontinuo in un tubo ultracentrifugo sovrapponendo 0,45 ml di saccarosio al 70%, con 0,27 ml di saccarosio al 50%, e quindi 0,27 ml di saccarosio al 40% in tampone di gradiente. Posizionare i campioni arricchiti di centrosoma sul gradiente discontinuo e calibrare il peso di ciascun campione nei rispettivi adattatori. Centrifugare i tubi a 40.000 g per 1 ora a 4 gradi Celsius, con accelerazione minima e senza rottura per evitare di perturbo del gradiente.Dopo la centrifugazione, raccogliere con cura 12 frazioni con lo stesso volume. Riaspensare l'esempio con il buffer di caricamento ed eseguire un SDS-PAGE. Per studiare la distribuzione degli organelli nelle cellule B durante la formazione di una sinapsi immunitaria, abbiamo usato cellule 2A1.6 B attivate con perline rivestite di antigene per diversi punti di tempo.Come controllo, le cellule B sono state attivate con perline contenenti un ligando BCR non correlato. Quindi, usando la colorazione immunofluorescenza, rileviamo diversi organelli, che cambiano la loro localizzazione all'attivazione con antigeni immobilizzati. Mostriamo qui il centrosoma, etichettato con alfa-tubulina e apparato golgi etichettato con Rab6a.Nel grafico, mostriamo l'indice di polarità per la polarità dell'apparato centrosoma e golgi verus ogni punto di attivazione, in cui ogni punto rappresenta una cellula. Durante l'attivazione, possiamo osservare che gli indici di polarità per questi organelli raggiungono valori più vicini a 1, suggerendo un aumento del loro reclutamento nell'IS.Organelles che mostrano una distribuzione più dispersa, come i lisosomi, possono anche essere quantificati usando un indice di polarità. Possiamo osservare che l'indice di polarità del liosoma raggiungerà valori più positivi al momento dell'attivazione, che deriva dal reclutamento nell'IS. Mostriamo un approccio complementare per quantificare il reclutamento di un lisosoma verso la sinapsi immunitaria.Utilizzando lo stesso protocollo di attivazione con perline rivestite di antigene, il reclutamento di lisosomi nell'IS è stato calcolato quantificando l'etichetta di fluorescenza dei liosomi reclutati nell'area definita intorno al tallone o all'interno dell'area sinaptica. Possiamo osservare che l'attivazione aperta. C'è un aumento dei lisosomi accoppiati al sito della sinapsi.Qui presentiamo la quantificazione dell'actina al centrosoma in cellule B attivate con perline rivestite di antigene specifiche e non specifiche. Il pool di actin è indicato con una freccia. La quantificazione dei componenti associati al centrosoma, come l'actina in questo caso, può essere rappresentata da un grafico a punti, in cui ogni punto rappresenta una cella.Dopo l'attivazione, la cellula B diminuisce la quantità di actina intorno al centrosoma. Questo passo è importante per staccare il centrosoma dalla regione perinucleare per consentirne la polarizzazione alla nuova sinapsi. Per le cellule B attivate su superficie rivestita di antigene, è possibile studiare il rimodellamento dell'actina e il reclutamento di organelli nella membrana sinaptica.Qui mostriamo l'analisi degli organelli, come l'apparato golgi e il reticolo endoplasmatico, che mostrano rispettivamente una distribuzione centrale e periferica. Inoltre, possiamo calcolare l'area di diffusione delle cellule B dopo diversi punti di attivazione. A questo scopo, etichettiamo actin per essere in grado di definire il limite di cellule nel piano XY.Nel grafico, è possibile osservare l'aumento dell'area cellulare dopo 30 e 60 minuti di attivazione. La distribuzione di un organelle può anche essere calcolata nel piano XZ in relazione all'interfaccia sinaptica. Il grafico rappresenta la distribuzione dell'actina nel piano z, dove i primi due piani corrispondono all'interfaccia sinaptica.Possiamo osservare che actin si arricchisce in questo settore al momento dell'attivazione. Oltre all'analisi dell'imaging, l'approccio biochimico può anche essere usato per studiare il cambiamento nella composizione centrosomale dopo l'attivazione delle cellule B. Mostriamo qui una macchia occidentale rappresentativa di frazione contenente centrosoma evidenziata dal rettangolo beige.Le frazioni centro-porose sono state isolate su un gradiente di saccarosio discontinuo e rilevate dal livellamento gamma-tubulina. La macchia occidentale sottostante mostra actina e Arp2 in frazioni centrosomali da cellule B a riposo, che si esauriscono al momento dell'attivazione. I linfociti B subiscono cambiamenti dinamici all'interfaccia della membrana al fine di formare una sinapsi immunitaria funzionale.Questo processo può essere studiato mediante imaging e tecniche biochimiche descritte qui in questo video. Crediamo che questa analisi possa fornire informazioni di valore sui meccanismi molecolari coinvolti su come le cellule B possono essere attivate in modo efficiente.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Induzione e Valutazione della ricombinazione Classe Switch in depurata cellule B murini

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sette passi per Stellate Cellule

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Rilevamento Cortex Frammenti Durante la germinazione delle spore batteriche

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Due-fotone videomicroscopia Imaging dei leucociti durante la risposta immunitaria nel fegato Lipopolysaccharide-trattati del topo

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...