Name: studying organelle dynamics in b cells during immune synapse formation
Uploaded: 2019-06-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation at JoVE.com

M.-I.Y. é apoiado por uma subvenção de pesquisa da FONDECYT #1180900. J.I., D.F. e JL foram apoiados por bolsas do Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Agradecemos a David Osorio da Pontificia Universidad Católica de Chile pela gravação e edição de vídeo.

Nota: as seguintes etapas foram executadas usando células IIA 1.6 B.
1. B célula de ativação com antígeno-revestido de contas
<ol><li>Preparação de grânulos revestidos com antígeno
	<ol>
<li>Para ativar as células B, use o NH2-Beads covalentemente revestido com antígeno (grânulos revestidos por AG), que são preparados usando 50 μL (~ 20 x 106 grânulos) de 3 μm NH2-Beads com ativação (BCR-ligand +) ou não-ativando (BCR-ligand-) antígenos.</li>
...

<ol>
	<li>Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+Acquire+Particulate+Antigen+in+a+Macrophage-Rich+Area+at+the+Boundary+between+the+Follicle+and+the+Subcapsular+Sinus+of+the+Lymph+Node.">Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node.</a> Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+at+the+centrosome+controls+lymphocyte+polarity.">Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+antigen+extraction+in+the+B+cell+synapse.">Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse.</a> Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).</li><li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+Receptor-Mediated+Antigen+Gathering+Requires+Ubiquitin+Ligase+Cbl+and+Adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+Recruit+Dynein+to+the+Signaling+Microcluster.">B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster.</a> Immunity. , (2011).</li><li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap1+&#8211;+cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse.">The Rap1 &#8211; cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).</li><li>Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+ligand+discrimination+through+a+spreading+and+contraction+response.">B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response.</a> Science. 312 (5774), 738-741 (2006).</li><li>Vascotto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin-based+motor+protein+myosin+II+regulates+MHC+class+II+trafficking+and+BCR-driven+antigen+presentation.">The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation.</a> Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).</li><li>Reversat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3+controls+B-cell+receptor+dynamics+and+antigen+extraction+at+the+immune+synapse.">Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse.</a> Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).</li><li>Lankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Major+Histocompatibility+Complex+Class+II+Compartments+during+B+Cell+Receptor&#8211;mediated+Cell+Activation.">Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor&#8211;mediated Cell Activation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).</li><li>Duchez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Polarization+of+T+and+B+Cells+at+the+Immunological+Synapse.">Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse.</a> The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).</li><li>P&#233;rez-Montesinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+the+intracellular+association+of+selected+rab+small+GTPases+with+MHC+class+II+and+DM+during+dendritic+cell+maturation.">Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation.</a> Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).</li><li>Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre&#180;, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume&#180;nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk-dependent+Actin+Dynamics+Regulate+Endocytic+Trafficking+and+Processing+of+Antigens+Internalized+through+the+B-Cell+Receptor.">Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor.</a> Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).</li><li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Isolation+of+Centrosomes+from+Cultured+Cells.">Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).</li><li>Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+centrosomes+from+mammalian+cell+lines.">Purification of centrosomes from mammalian cell lines.</a> Methods in Cell Biology. 129, (2015).</li><li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vamp-7&#8211;dependent+secretion+at+the+immune+synapse+regulates+antigen+extraction+and+presentation+in+B-lymphocytes.">Vamp-7&#8211;dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+B+Cell+Activation+BCR:+B+cell+receptor.">Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor.</a> Annual Review of Immunology. , (2010).</li><li>Yuseff, M. I., Lennon-Dum&#233;nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+use+conserved+polarity+cues+to+regulate+their+antigen+processing+and+presentation+functions.">B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).</li></ol>

Nós descrevemos um método detalhado para estudar como os linfócitos de B re-organizam sua arquitetura intracelular para promover a formação de um is. Este estudo inclui o uso de técnicas de imagem para quantificar a distribuição intracelular de organelas, como centrosoma, aparato de Golgi e lisossomas durante a ativação da célula B, e como elas se polarizam com o IS. Adicionalmente, nós descrevemos uma aproximação bioquímica para estudar mudanças na composição do centrosome em cima da ativação da pilh...

Os linfócitos B são uma parte essencial do sistema imunológico adaptativo responsável pela produção de anticorpos contra diferentes ameaças e patógenos invasores. A eficiência da produção de anticorpos é determinada pela capacidade das células B de adquirir, processar e apresentar antígenos encontrados em uma forma solúvel ou superfície-tethered1,2. O reconhecimento dos antígenos anexados à superfície de uma célula de apresentação, pelo BCR, conduz à formação de um contato intercelular próximo denominado é3,4. Dentro desta plataforma dinâmica a sinalização a jusante BCR-dependente e a internalização dos antígenos em compartimentos Endo-lysosome acontecem. Os antígenos de uptomado são processados e montados em moléculas de MHC-II e apresentados subseqüentemente aos linfócitos de T. As interações produtivas do B-T, denominadas cooperação da pilha de B-T, permitem que os linfócitos de B recebam os sinais apropriados, que promovem sua diferenciação em pilhas de plasma de produção de anticorpos ou em pilhas de memória8.
Dois mecanismos foram envolvidos na extração do antígeno por pilhas de B. A primeira conta com a secreção de proteases originadas de lisossomos que passam por recrutamento e fusão na fenda sináptica5,6. O segundo, depende das forças de tração miosina IIA-mediadas que desencadeia a invaginação do antígeno contendo membranas que são internalizadas em Poços revestidos com clathrin7. A modalidade da extração do antígeno confia nas propriedades físicas da membrana em que os antígenos são encontrados. Não obstante, em ambos os casos, as pilhas de B submetem-se a dois eventos de remodelação principais: reorganização do citoesqueleto do actina e polarização das organelas ao is. A remodelação do citoesqueleto de Actin envolve um estágio de espalhamento inicial, onde as saliências Actin-dependentes na membrana sináptica aumentam a superfície no contato com o antígeno. Isto é seguido por uma fase de contração, onde os BCRS acoplados com antígenos são concentrados no centro do é pela ação concertada de motores moleculars e do citoesqueleto do actina que remodelam8,9,10, 11. polarization das organelas igualmente confia na remodelação do cytoskeleton do actina. Por exemplo, o centrosome torna-se desacoplado do núcleo, por despolimerização local de actina associada, o que permite o reposicionamento desta organela ao is5,12. Nas células B, o reposicionamento do centrosome para um pólo celular (IS) orienta o recrutamento lisossome para a membrana sináptica, que após a secreção pode facilitar a extração e/ou processamento de antígenos de superfície-tethered6. Os lisossomas recrutados no IS são enriquecidos com MHC-II, o que favorece a formação de complexos peptídeos-MHC-II em compartimentos endossômicos a serem apresentados às células T13. Adicionalmente, o aparelho de Golgi também tem sido observado para ser estreitamente recrutado para o IS14, sugerindo que as vesículas derivadas de Golgi da via secretora poderiam estar envolvidas na extração e/ou processamento de antígenos.
Completamente, os rearranjos intracelular do organela e do citoesqueleto em pilhas de B durante a formação do sinapse são as etapas chaves que permitem a aquisição e o processamento eficientes do antígeno exigidos para sua ativação mais adicional. Neste trabalho apresentamos protocolos detalhados sobre como realizar exames de imagem e bioquímica em células B para estudar a remodelação intracelular de organelas associadas à formação de um IS. Essas técnicas incluem: (i) imunofluorescência e análise de imagens de células B ativadas com grânulos revestidos por antígeno e em coberturas revestidas com antígeno, o que permite a visualização e quantificação de componentes intracelulares que são mobilizados para o IS e (II ) isolamento de frações enriquecidas centrosome em células B por ultracentiogação em gradientes de sacarose, o que permite a identificação de proteínas associadas ao centrosome, potencialmente envolvidas na regulação da polaridade celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells</td>
			<td style="width:74px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-208</td>
			<td style="width:172px;">Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without Fc&#947;IIR</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">100% methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular</td>
			<td>Marienfield-Superior</td>
			<td align="right">111500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>LifeTech&#160;</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit &#160;IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A-11071</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A21238</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amaxa Nucleofection kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1003</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amaxa Nucleofector model 2b</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program L-013 used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amino- Dynabeads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14307D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-pericentrin</td>
			<td>&#160;Abcam</td>
			<td>ab4448&#160;</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-rab6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95954</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-sec61</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15575</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BSA</td>
			<td>&#160;Winkler</td>
			<td>&#160;BM-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>CA-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Culture plate T25</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">353014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fiji Software</td>
			<td style="width:74px;">Fiji col.</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fluoromount G</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G7651&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glycine</td>
			<td>Winkler&#160;</td>
			<td>BM-0820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>IIA1.6 positive ligand</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Goat-anti-mouse IgM antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">31186</td>
			<td>IIA1.6 negative ligand</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HyClone Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivate at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>PO-1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Leica SP8 TCS microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>SO-1455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope</td>
			<td>&#160;Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Parafilm</td>
			<td>M</td>
			<td>P1150-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Polybead Amino Microspheres 3.00&#956;m</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>17145-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Dilute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti- alpha tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>1:1000 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti mouse lamp1 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td align="right">3243</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti-cep55&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170414</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody</td>
			<td>&#160;Abcam</td>
			<td>ab16504</td>
			<td>&#160;1:1000 for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RPMI-1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-104-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Saponin</td>
			<td>&#160;Merck</td>
			<td align="right">558255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sucrose</td>
			<td>Winkler&#160;</td>
			<td>SA-1390&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Triton X-100</td>
			<td>&#160;Merck</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying organelle dynamics in b cells during immune synapse formation

O reconhecimento de antígenos superfície-tethered pelo receptor da pilha de B (BCR) desencadeia a formação de um sinapse imune (is), onde a sinalização e a captação do antígeno são coordenadas. A formação do is envolve a remodelação dinâmica do actina acompanhada do recrutamento polarizado à membrana sináptica do centrosome e das organelas intracelular associadas tais como lisossomos e o instrumento de Golgi. Os estágios iniciais da remodelação do actina permitem que as pilhas de B aumentem sua superfície da pilha e maximizam a quantidade de complexos do antígeno-BCR recolhidos na sinapse. certas condições, quando as células B reconhecem antígenos associados a superfícies rígidas, este processo é acoplado ao recrutamento local e secreção de lisossomos, o que pode facilitar a extração do antígeno. Os antígenos uptomadas são internalizados em compartimentos Endo-lysosome especializados para processar nos peptídeos, que são carregados em moléculas principais do complexo II do histocompatibilidade (MHC-II) para uma apresentação mais adicional às pilhas do ajudante de T. Conseqüentemente, estudar a dinâmica do organela associou com a formação de um is é crucial a compreender como as pilhas de B são ativadas. No presente artigo, discutiremos a imagem e uma técnica bioquímica usada para estudar as mudanças no posicionamento da organela intracelular e nos rearranjos de citoesqueleto que estão associados à formação de um IS em células B.

O artigo atual mostra como as pilhas de B podem ser ativadas usando o antígeno imobilizado em grânulos ou em COVERSLIP para induzir a formação de um IS. Fornecemos informações sobre como identificar e quantificar a polarização de diferentes organelas por imunofluorescência e como caracterizar proteínas que passam por mudanças dinâmicas em sua associação ao centrosome, que polariza para o IS, utilizando um abordagem bioquímica.
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Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Nisto nós descrevemos duas aproximações para caracterizar eventos da polarização da pilha em linfócitos de B durante a formação de um IS. O primeiro, envolve a quantificação do recrutamento organela e rearranjos de citoesqueleto na membrana sináptica. A segunda é uma abordagem bioquímica, para caracterizar as mudanças na composição do centrosome, que sofre polarização para a sinapse imune.

Estudando a dinâmica organelle em células B durante a formação de sinapse imune

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Nesta revisão, discutiremos tanto técnicas de imagem quanto bioquímicas utilizadas para estudar posicionamento e composição de organelas, bem como rearranjos de citoesqueleto observados durante a formação de uma sinapse imunológica. Os estágios iniciais de remodelação ativa permitem que as células B aumentem sua superfície celular e maximizem a quantidade de complexos de antígeno BCR reunidos na sinapse. Por outro lado, o recrutamento local de licomentosomos, juntamente com o centro na membrana sináptica, pode ser acoplado à secreção líssótimo, que é conhecida por facilitar a extração de antígenos imobilizados.O antígeno retomado é ainda mais processado dentro de compartimentos endolíssomos em peptídeos, que são carregados em moléculas mhc classe II para apresentação às células auxiliares T. Portanto, estudar a dinâmica organela associada à sinapse imunológica é crucial para entender como as células B são totalmente ativadas. A imunofluorescência de células B ativadas com antígenos imobilizados nos permite seguir diferentes componentes celulares e como eles podem ser recrutados para a sinapse imunológica.As células B podem ser ativadas através de antígenos imobilizados em uma superfície de contas ou uma superfície de deslizamento de tampa. As contas revestidas de antígeno são preparadas incubando ligantes específicos com amino-contas previamente tratadas com glutaraldeído para ativar grupos de amino. Resuspend contas ativadas em 100 microliters de PBS e vórtice.Enquanto isso, prepare a solução de antígeno adicionando 100 microgramas por mL de ligante BCR em 150 microliters de PBS. Em seguida, adicione 50 microliters de contas ativadas à solução de antígeno e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Lembre-se, também use um ligante não relacionado como controle negativo.Após a incubação, lave as contas com PBS. Aspire o supernaste e substitua por PBS. Repita três vezes.Em seguida, bloqueie os três grupos de amino por contas resuspended em 500 microliters de uma solução de BSA. Finalmente, resuspend contas em 70 microliters de PBS. Para calcular a concentração final, você pode usar um hemótmetro para contar as contas.Para ativação de células B, use um tubo de 50 mL e células resuspendadas para uma concentração de 1,5 milhão por mL em CLICK suplementado com soro bovino fetal de 5%. Em seguida, adicione 150.000 células B, correspondendo a 100 microliters da mistura de contas celulares a uma camada de tampa revestida de poli-L-lisina incubada a 37 graus para os diferentes pontos de tempo. Uma segunda abordagem para ativar células B é semeá-las em tampas revestidas de antígeno.Para isso, o revestimento desliza com anti-BCR e B220 com melhora a adesão celular. Prepare a solução de antígeno adicionando anti-BRC e B220 em PBS a uma concentração final de 10 microgramas por mL e 0,5 microgramas por mL, respectivamente. Em seguida, coloque o deslizamento sobre uma tampa de 24 placas de bem coberta com filme parafilm e adicione 40 microliters de solução de antígeno.Sele a placa e, em seguida, incubar a 4 graus durante a noite. Para iniciar a ativação em deslizamento de cobertura, primeiro lave-os com PBS e deixe-os secar por alguns minutos. Em seguida, adicione 150.000 células B e incubar a 37 graus para os diferentes pontos de tempo.Em ambos os casos, ao ativar com contas ou slides revestidos de antígeno, recomendamos começar com o ponto de maior tempo e, em seguida, seguir para os mais curtos. Uma vez que você tenha montado o deslizamento de cobertura seca no slide do microscópio, você pode usar uma epifluorescência ou um microscópio confocal para visualizar suas amostras, dependendo dos requisitos de resolução. Concentre a amostra usando a luz transmitida.Você deve procurar por campos onde células e contas estão interagindo em uma e uma razão. Para células B ativadas em tampas cobertas de antígeno, use o objetivo de 100x para uma melhor resolução. Para parâmetros, considere tomar uma pilha de z que cubra toda a célula.Você pode rotular actin para delimitar os limites inferiores e superiores da célula. Para células B ativadas com contas revestidas de antígeno e rotulá-la para organelas confinadas a um ponto, primeiro delimitar duas áreas: a área celular e a área de contas. Em seguida, identifique a posição ou a organela por um ponto e obtenha suas coordenadas de localização.Desenhe dois vetores: um entre o centro celular e a organela, e outro entre o centro celular e o centro de contas. Meça o comprimento de ambos e meça o ângulo entre os dois vetores, agora chamados de alfa. Faça uma projeção com o vetor entre o centro e o centro celular usando o guassiano de alfa e, em seguida, calcule o índice de polaridade da organela dividindo o vetor projetado, a, por b.Assim, um índice de polaridade entre zero e um indica um fenótipo polarizado. Valores entre zero e menos um indicam um fenótipo não polarizado. Para determinar o índice de polaridade para organelas mais dispersas, como os lysosomes, você pode usar o mesmo algoritmo mencionado anteriormente, alterando as coordenadas de localização da organela para as coordenadas do centro de massa dos rótulos, neste caso, lysososomes.Da mesma forma que a análise descrita anteriormente, um índice de polaridade entre zero e um indica um fenótipo polarizado, enquanto os valores entre zero e menos um indicam um fenótipo não polarizado. Para quantificar a quantidade de cada organela bem recrutada para a nova sinapse, você pode calcular a porcentagem da fluorescência organela na conta. Para isso, você deve delimitar a conta e a área celular, medir a respectiva intensidade de fluorescência e, em seguida, dividir a fluorescência das contas pela soma da conta e da fluorescência celular.Você obterá a quantidade de cada organela que está em contato com a nova sinapse. Alternativamente, desenhe um retângulo oposto à conta. Use um peso correspondente a um quarto do comprimento celular, em seguida, meça a intensidade da fluorescência dentro do retângulo e divida-o pela fluorescência total.Este algoritmo sempre obterá a porcentagem da organela que está próxima da nova sinapse, mas não necessariamente em contato direto com a interface. Para quantificar os componentes associados ao centro-ao-ano em células B em repouso e ativadas. Resumidamente, determinamos três parâmetros.A área de células e contas, e a localização centrosorial coordena. Em seguida, definimos um círculo em torno do centro e executamos uma análise de perfil radial a partir do centro do centro, previamente definido. Uma vez que você tenha o enredo, determine o raio em que 70% da fluorescência máxima é mantida.Use este raio para desenhar um círculo em torno do centro. Por fim, obtenha densidade de fluorescência do componente de interesse na área central e na área celular, e divida ambos os valores para obter a razão de densidade fluorescente. Para medir a distribuição de organelas na interface da sinapse imunológica, primeiro identifique a área das células B em contato com o deslizamento revestido de antígeno.Você pode rotular actin para ajudá-lo a definir esta área. Em seguida, meça a área em contato com o escorregador, a altura e a largura da célula. A área voltada para o deslizamento de cobertura revestido de antígeno é uma medida de célula B que se espalha após a ativação da célula B.Use os valores de altura e largura para delimitar uma área central na célula, que é separada dos limites por um quarto da altura e dos valores de largura. Geralmente, estes correspondem a aproximadamente um terço da área celular total. Finalmente, calcule o recrutamento de organelas no centro da nova sinapse, dividindo a densidade de fluorescência na área central pela densidade de fluorescência de toda a célula.Valores positivos desse índice indicam um enriquecimento organela no centro da nova sinapse. Pelo contrário, valores negativos indicam uma distribuição periférica. Para medir a distribuição de organelas através dos z-planos de células B ativadas em tampas revestidas de antígeno, primeiro delimitar a interface sináptica e o limite superior da célula.Em seguida, desenhe uma linha através do centro celular e recira a imagem para obter uma imagem XZ. Meça a cabeça da célula e divida a imagem em 10 frações da mesma área, da sinapse imunológica até o limite superior da célula. Meça a fluorescência em cada fração z e calcule a porcentagem de fluorescência dividindo a fluorescência em cada fração z pela fluorescência total da célula.Por fim, plote a porcentagem de intensidade de fluorescência por fração z. A fração um e dois representam a interface sináptica. Aqui está o fluxo de trabalho ou o procedimento de isolamento central.Use 20 milhões de células B por condição. Pré-tratamento de células com Citochalasina D e Nocodazole de acordo com o protocolo necessário para facilitar o descolamento centrista. Em seguida, observe as células reutilizando-as em 5 mL de buffer TBS.Repita usando 1 mL de tampão tbs de 0,1x complementado com 8% de sacarose. Resuspense a pelota celular com 150 microliters de tampão de lise. Centrífuga a 10.000 g por 10 minutos a 4 graus Celsius para separar o citosol e organelas do núcleo.Recupere cuidadosamente a célula sobrenante e coloque em cima de um tubo de 1,5 mL. Encha-o com 300 microlitres de tampão de gradiente suplementado com 60% de sacarose. Centrífuga amostras a 10.000 g por 30 minutos a 4 graus Celsius.Esse passo de centrifugação é importante para concentrar os centrossomos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o supernatante até chegar à interface. Vórtice a amostra restante no tubo.Prepare o gradiente de sacarose descontínua em um tubo ultracentrífuga sobrepondo 0,45 mL de 70% de sacarose, com 0,27 mL de 50% de sacarose e, em seguida, 0,27 mL de 40% de sacarose no tampão de gradiente. Coloque as amostras enriquecidas com centroso no gradiente descontínuo e calibrar o peso de cada amostra nos respectivos adaptadores. Centrifugar os tubos a 40.000 g por 1 hora a 4 graus Celsius, com aceleração mínima e sem quebra para evitar perturbação do gradiente.Após a centrifugação, colecione cuidadosamente 12 frações com o mesmo volume. Resuspenda a amostra com buffer de carregamento e execute um SDS-PAGE. Para estudar a distribuição de organelas em células B durante a formação de uma sinapse imunológica, utilizamos células 2A1.6 B ativadas com contas revestidas de antígeno para diferentes pontos de tempo.Como controle, as células B foram ativadas com contas contendo um ligante BCR não relacionado. Em seguida, utilizando a coloração da imunofluorescência, detectamos diferentes organelas, que alteram sua localização após ativação com antígenos imobilizados. Mostramos aqui o centro, rotulado com alfa-tubulin e aparelho golgi rotulado com Rab6a.No gráfico, mostramos o índice de polaridade para o centro e o aparelho golgi polaridade verus cada ponto de ativação, no qual cada ponto representa uma célula. Durante a ativação, observa-se que os índices de polaridade dessas organelas atingem valores mais próximos de 1, sugerindo um aumento em seu recrutamento para o IS.Organelas que exibem uma distribuição mais dispersa, como os lysosomes, também podem ser quantificados usando um índice de polaridade. Observa-se que o índice de polaridade do lyosossom atingirá valores mais positivos após a ativação, o que resulta do recrutamento para o EI. Mostramos uma abordagem complementar para quantificar o recrutamento de um lysosome em direção à sinapse imunológica.Usando o mesmo protocolo de ativação com contas revestidas de antígeno, o recrutamento lysosome para o EI foi calculado quantificando o rótulo de fluorescência de lyossomos recrutados para a área definida em torno da conta ou dentro da área sináptica. Podemos observar essa ativação aberta. Há um aumento de lysossosomes acoplado ao local da sinapse.Aqui apresentamos a quantificação de actina no centro em células B ativadas com contas específicas e não específicas revestidas de antígeno. A piscina de actin é indicada com uma flecha. A quantificação de componentes associados ao centro-ao-ano, como o actin neste caso, pode ser representada por um gráfico de pontos, no qual cada ponto representa uma célula.Após a ativação, a célula B diminui na quantidade de actin ao redor do centro. Esse passo é importante para desvincular o centro da região perinuclear para permitir sua polarização à nova sinapse. Para células B ativadas na superfície revestida de antígeno, você pode estudar a remodelagem de actin, bem como o recrutamento de organelas para a membrana sináptica.Aqui mostramos a análise de organelas, como o aparelho golgi e o ânticulo endoplasmático, que apresentam distribuição central e periférica, respectivamente. Além disso, podemos calcular a área de disseminação das células B após diferentes pontos de tempo de ativação. Para isso, rotulamos actin para ser capaz de definir o limite de célula no plano XY.No gráfico, você pode observar o aumento na área celular após 30 e 60 minutos de ativação. A distribuição de uma organela também pode ser calculada no plano XZ, respectivamente, para a interface sináptica. O gráfico representa a distribuição de actin em z-plane, onde os dois primeiros planos correspondem à interface sináptica.Podemos observar que a actina se torna enriquecida nesta área após a ativação. Além da análise de imagens, a abordagem bioquímica também pode ser usada para estudar a mudança na composição centralosome após a ativação celular B. Mostramos aqui uma mancha ocidental representativa de fração de centro-contendo destacada pelo retângulo bege.Frações centrais foram isoladas em um gradiente de sacarose descontínua e detectadas pelo nivelamento gama-tubulina. A mancha ocidental abaixo mostra actin e Arp2 em frações centrais de células B descansando, que se esgotam após a ativação. Linfócitos B sofrem alterações dinâmicas na interface da membrana, a fim de formar uma sinapse imunológica funcional.Esse processo pode ser estudado por meio de técnicas de imagem e bioquímicas descritas aqui neste vídeo. Acreditamos que esta análise pode fornecer informações de valor sobre os mecanismos moleculares envolvidos sobre como as células B podem ser ativadas eficientemente.

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Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

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