Name: studying organelle dynamics in b cells during immune synapse formation
Uploaded: 2019-06-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation at JoVE.com

M.-I.Y. stöds av ett forskningsanslag från FONDECYT #1180900. J.I., D.F. och J.L. stöddes av stipendier från Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Vi tackar David Osorio från Pontificia Universidad Católica de Chile för videoinspelning och redigering.

Anmärkning: följande steg utfördes med hjälp av IIA 1.6 B-celler.
1. B cell aktivering med antigen-belagda pärlor
<ol><li>Beredning av antigen-belagda pärlor
	<ol>
<li>För att aktivera B-celler, Använd NH2-pärlor kovalent belagda med antigen (AG-belagda pärlor), som bereds med 50 μl (~ 20 x 106 pärlor) av 3 μm NH2-pärlor med aktiverande (BCR-ligand +) eller icke-aktiverande (BCR-ligand-) antigener.</li>
		<li>För IIA 1.6 B celler använda anti-IgG-...

<ol>
	<li>Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+Acquire+Particulate+Antigen+in+a+Macrophage-Rich+Area+at+the+Boundary+between+the+Follicle+and+the+Subcapsular+Sinus+of+the+Lymph+Node.">Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node.</a> Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+at+the+centrosome+controls+lymphocyte+polarity.">Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+antigen+extraction+in+the+B+cell+synapse.">Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse.</a> Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).</li><li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+Receptor-Mediated+Antigen+Gathering+Requires+Ubiquitin+Ligase+Cbl+and+Adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+Recruit+Dynein+to+the+Signaling+Microcluster.">B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster.</a> Immunity. , (2011).</li><li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap1+&#8211;+cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse.">The Rap1 &#8211; cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).</li><li>Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+ligand+discrimination+through+a+spreading+and+contraction+response.">B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response.</a> Science. 312 (5774), 738-741 (2006).</li><li>Vascotto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin-based+motor+protein+myosin+II+regulates+MHC+class+II+trafficking+and+BCR-driven+antigen+presentation.">The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation.</a> Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).</li><li>Reversat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3+controls+B-cell+receptor+dynamics+and+antigen+extraction+at+the+immune+synapse.">Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse.</a> Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).</li><li>Lankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Major+Histocompatibility+Complex+Class+II+Compartments+during+B+Cell+Receptor&#8211;mediated+Cell+Activation.">Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor&#8211;mediated Cell Activation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).</li><li>Duchez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Polarization+of+T+and+B+Cells+at+the+Immunological+Synapse.">Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse.</a> The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).</li><li>P&#233;rez-Montesinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+the+intracellular+association+of+selected+rab+small+GTPases+with+MHC+class+II+and+DM+during+dendritic+cell+maturation.">Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation.</a> Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).</li><li>Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre&#180;, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume&#180;nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk-dependent+Actin+Dynamics+Regulate+Endocytic+Trafficking+and+Processing+of+Antigens+Internalized+through+the+B-Cell+Receptor.">Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor.</a> Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).</li><li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Isolation+of+Centrosomes+from+Cultured+Cells.">Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).</li><li>Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+centrosomes+from+mammalian+cell+lines.">Purification of centrosomes from mammalian cell lines.</a> Methods in Cell Biology. 129, (2015).</li><li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vamp-7&#8211;dependent+secretion+at+the+immune+synapse+regulates+antigen+extraction+and+presentation+in+B-lymphocytes.">Vamp-7&#8211;dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+B+Cell+Activation+BCR:+B+cell+receptor.">Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor.</a> Annual Review of Immunology. , (2010).</li><li>Yuseff, M. I., Lennon-Dum&#233;nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+use+conserved+polarity+cues+to+regulate+their+antigen+processing+and+presentation+functions.">B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).</li></ol>

Vi beskriver en omfattande metod för att studera hur B-lymfocyter omorganisera sin intracellulära arkitektur för att främja bildandet av en IS. Denna studie omfattar användning av avbildningstekniker för att kvantifiera den intracellulära fördelningen av organeller, såsom centrosome, Golgi apparat och lysosomer under B cell aktiveringen, och hur de polariserar till IS. Dessutom beskriver vi en biokemisk metod för att studera förändringar i centrosom komposition vid B-cellsaktivering.
<p class="jove_conten...

B-lymfocyter är en viktig del av det adaptiva immunsystemet som ansvarar för att producera antikroppar mot olika hot och invaderande patogener. Effektiviteten i produktionen av antikroppar bestäms av B-cellernas förmåga att förvärva, bearbeta och presentera antigener som påträffas antingen i en löslig eller ytuppbundna form1,2. Erkännande av antigener som är knutna till ytan av en presenterande cell, av BCR, leder till bildandet av en nära intercellulära kontakt kallas är3,4. Inom denna dynamiska plattform sker både BCR-beroende nedströms signalering och internalisering av antigener till endo-lysosome fack. Uptaken antigener bearbetas och monteras på MHC-II molekyler och därefter presenteras för T-lymfocyter. Produktiva B-T interaktioner, benämnd B-T cell samarbete, tillåta B-lymfocyter att ta emot lämpliga signaler, som främjar deras differentiering till antikroppsproducerande plasmaceller eller minnesceller8.
Två mekanismer har varit inblandade i antigen utvinning av B-celler. Den första är beroende av utsöndringen av proteaser från lysosomer som genomgår rekrytering och fusion vid den synaptiska spalten5,6. Den andra, beror på myosin IIA-medierade dragkrafter som utlöser invagination av antigen som innehåller membran som internaliseras i clathrin-belagda gropar7. Läget för antigen utvinning förlitar sig på de fysikaliska egenskaperna hos det membran där antigener påträffas. Ändå, i båda fallen, B-celler genomgår två stora remodeling händelser: aktin cytoskelettet omorganisering och polarisering av organeller till is. Actin cytoskelettet remodeling innebär en första spridning skede, där Actin-beroende utskjutande på Synaptic membranet öka ytan i kontakt med antigenet. Detta följs av en kontraktion arrangerar gradvis, var bcrs tillsammans med antigener koncentreras i centrera av är vid den samordnade handlingen av molekylära motorer och aktin cytoskelettet remodeling8,9,10, 11. polarisering av organeller förlitar sig också på ombyggnad av aktin cytoskeleton. Till exempel blir centrosom unhopkopplad från kärnan, av lokala depolymerization av tillhörande aktin, som gör det möjligt att repositionera av denna organell till är5,12. I B-celler, ompositionering av centrosom till en cell Pole (is) guider Lysosomen rekrytering till Synaptic membranet, som vid sekretion kan underlätta utvinning och/eller bearbetning av ytbundna antigener6. Lysosomer rekryteras på IS är berikade med MHC-II, som gynnar bildandet av peptid-MHC-II komplex i endosomalt fack som skall presenteras för T-celler13. Dessutom har den Golgi apparaten också observerats för att vara nära rekryteras till IS14, vilket tyder på att Golgi-härledda blåsor från den sekretoriska vägen kan vara inblandade i antigen utvinning och/eller bearbetning.
Helt och hållet, intracellulära organell och cytoskelettet rearrangemang i B-celler under synapsen bildas är de viktigaste stegen som möjliggör effektiv antigen förvärv och bearbetning krävs för deras vidare aktivering. I detta arbete introducerar vi detaljerade protokoll om hur man utför avbildning och biokemisk analys i B-celler för att studera den intracellulära remodeling av organeller i samband med bildandet av en IS. Dessa tekniker inkluderar: (i) immunofluorescens och bildanalys av B-celler som aktiveras med antigen-belagda pärlor och på antigen-belagda täckglas, vilket möjliggör visualisering och kvantifiering av intracellulära komponenter som mobiliseras till IS och (II ) isolering av centrosome-berikade fraktioner i B-celler genom ultracentrifugering på sackaros gradienter, som gör det möjligt att identifiera proteiner i samband med centrosome, potentiellt involverade i regleringen av cellernas polaritet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells</td>
			<td style="width:74px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-208</td>
			<td style="width:172px;">Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without Fc&#947;IIR</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">100% methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular</td>
			<td>Marienfield-Superior</td>
			<td align="right">111500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>LifeTech&#160;</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit &#160;IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A-11071</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A21238</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amaxa Nucleofection kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1003</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amaxa Nucleofector model 2b</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program L-013 used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amino- Dynabeads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14307D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-pericentrin</td>
			<td>&#160;Abcam</td>
			<td>ab4448&#160;</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-rab6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95954</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-sec61</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15575</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BSA</td>
			<td>&#160;Winkler</td>
			<td>&#160;BM-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>CA-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Culture plate T25</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">353014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fiji Software</td>
			<td style="width:74px;">Fiji col.</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fluoromount G</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G7651&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glycine</td>
			<td>Winkler&#160;</td>
			<td>BM-0820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>IIA1.6 positive ligand</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Goat-anti-mouse IgM antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">31186</td>
			<td>IIA1.6 negative ligand</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HyClone Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivate at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>PO-1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Leica SP8 TCS microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>SO-1455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope</td>
			<td>&#160;Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Parafilm</td>
			<td>M</td>
			<td>P1150-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Polybead Amino Microspheres 3.00&#956;m</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>17145-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Dilute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti- alpha tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>1:1000 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti mouse lamp1 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td align="right">3243</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti-cep55&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170414</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody</td>
			<td>&#160;Abcam</td>
			<td>ab16504</td>
			<td>&#160;1:1000 for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RPMI-1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-104-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Saponin</td>
			<td>&#160;Merck</td>
			<td align="right">558255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sucrose</td>
			<td>Winkler&#160;</td>
			<td>SA-1390&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Triton X-100</td>
			<td>&#160;Merck</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying organelle dynamics in b cells during immune synapse formation

Erkännande av ytbundna antigener av B-cellreceptorn (BCR) utlöser bildandet av en immunsynapse (IS), där både signalering och antigen upptag samordnas. Är bildandet innebär dynamisk aktin remodeling åtföljs av den polariserade rekrytering till Synaptic membranet i centrosom och tillhörande intracellulära organeller såsom lysosomer och Golgi apparaten. Inledande stadier av aktin remodeling tillåta B-celler att öka sin cellyta och maximera mängden antigen-BCR komplex samlades vid synapsen. Under vissa förhållanden, när B-celler känner igen antigener i samband med stela ytor, är denna process kopplad till den lokala rekryteringen och utsöndringen av lysosomer, vilket kan underlätta antigen utvinning. Uptaken antigener internaliseras till specialiserade endo-lysosome fack för bearbetning till peptider, som lastas på större histocompatibility complex II (MHC-II) molekyler för vidare presentation till T Helper celler. Därför är att studera organell dynamik i samband med bildandet av en är avgörande för att förstå hur B-celler aktiveras. I den nuvarande artikeln kommer vi att diskutera både avbildning och en biokemisk teknik som används för att studera förändringar i intracellulär organell positionering och cytoskelettet rearrangemang som är förknippade med bildandet av en är i B-celler.

Den nuvarande artikeln visar hur B-celler kan aktiveras med hjälp av immobiliserade antigen på pärlor eller täckglas för att inducera bildandet av en IS. Vi ger information om hur man identifierar och kvantifiera polarisering av olika organeller av immunofluorescensen och hur man karakteriserar proteiner som genomgår dynamiska förändringar i deras förening till centrosome, som polariserar till IS, med hjälp av en biokemisk metod.
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation at JoVE.com

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Häri beskriver vi två metoder för att karakterisera cellpolariseringshändelser i B-lymfocyter under bildandet av en IS. Den första, innebär kvantifiering av organell rekrytering och cytoskelettet rearrangemang vid Synaptic membranet. Den andra är en biokemisk metod, att karakterisera förändringar i sammansättningen av centrosome, som genomgår polarisering till immun synapsen.

Studera Organelledynamik i B-celler under Immunsynapsebildningen

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

I denna översyn kommer vi att diskutera både bildbehandling och biokemiska tekniker som används för att studera organell positionering och sammansättning, samt cytoskelett rearrangements observerats under bildandet av en immunologiska synaps. Inledande stadier av aktiv ombyggnad tillåter B-celler att öka sin cellyta och maximera mängden av antigen BCR-komplex som samlats vid synapsen. Å andra sidan kan lokal rekrytering av lysosomer, tillsammans med centrosome vid synapsmembranet, kopplas till lysosomsekretion, som är känt för att underlätta extraktion av immobiliserade antigener.Uppsprunget antigen bearbetas vidare inom endolysomfack till peptider, som lastas på MHC klass II molekyler för presentation till T-hjälpceller. Därför är det avgörande att studera organelldynamik som är associerad med immunsynapsen för att förstå hur B-celler aktiveras fullt ut. Immunofluorescens av B-celler som aktiveras med immobiliserade antigener gör att vi kan följa olika cellkomponenter och hur de kan rekryteras till immunsynapsen.B-celler kan aktiveras genom immobiliserade antigener vid en pärlyta eller en täckyta. Antigenbelagda pärlor bereds genom att inkubera specifika ligander med aminopärlor som tidigare behandlats med glutaraldehyd för att aktivera aminogrupper. Resuspend aktiverade pärlor i 100 mikroliter av PBS och virvel.Under tiden, förbereda antigenlösningen genom att lägga till 100 mikrogram per mL bcr ligand i 150 mikroliter pbs. Därefter lägger du till 50 mikroliter av aktiverade pärlor till antigenlösningen och inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Kom ihåg, använd också en icke-närstående ligand som negativ kontroll.Efter inkubation, tvätta pärlor med PBS. Aspirera supernatanten och byt ut mot PBS. Upprepa tre gånger.Därefter blockera de tre amino grupperna genom resuspended pärlor i 500 mikroliter av en lösning av BSA. Slutligen, resuspend pärlor i 70 mikroliter av PBS. För att beräkna den slutliga koncentrationen kan du använda en hemocytometer för att räkna pärlorna.För B-cell aktivering, använd en 50 mL rör och resuspend celler till en koncentration av 1,5 miljoner per mL i CLICK kompletteras med 5%fetala nötkreatur serum. Därefter lägger du till 150, 000 B-celler, motsvarande en 100 mikroliter av cellpärla blandningen till en poly-L-lysinbelagd täckslip ad inkubera vid 37 grader för de olika tidpunkterna. En andra metod för att aktivera B-celler är sådd dem på antigen-belagda täcken.För detta ändamål, coat diabilder med anti-BCR och B220 med förbättrar cellen vidhäftning. Bered antigenlösningen genom att tillsätta anti-BRC och B220 i PBS till en slutkoncentration på 10 mikrogram per mL respektive 0, 5 mikrogram per mL. Därefter ställer du in täckskydden över ett lock av 24 brunnsplatta täckt med parafilmfilm och lägger till 40 mikroliter av antigenlösning.Täta plattan och sedan inkubera vid 4 grader över natten. För att starta aktiveringen i coverslip, tvätta dem först med PBS och låt dem torka i några minuter. Därefter lägger du till 150, 000 B-celler och inkuberar i 37 grader för de olika tidspunkterna.I båda fallen, vid aktivering antingen med pärlor eller antigenbelagda objektglas, rekommenderar vi att man börjar med den längsta tidspunkten och sedan fortsätter till de kortare. När du har monterat den torra täckskydd på mikroskop bild, kan du använda en epifluorescens eller ett konfokalmikroskop för att se dina prover, beroende på upplösningskrav. Fokusera provet med hjälp av det överförda ljuset.Du bör söka efter fält där celler och pärlor interagerar på ett och ett förhållande. För B-celler som aktiveras på antigentäckta täckslips, använd 100x-målsättningen för bättre upplösning. För parametrar, överväg att ta en z-stack som täcker hela cellen.Du kan märka aktin för att avgränsa cellens nedre och övre gränser. För B-celler som aktiveras med antigenbelagda pärlor och etikett den för organeller begränsas till en punkt, först avgränsa två områden: cellområdet och pärla området. Därefter identifiera positionen eller organellen genom en punkt och få dess lokaliseringskoordinater.Rita två vektorer:en mellan cellens centrum och organellen, och andra mellan cellens centrum och pärlans centrum. Mät längden på båda och mät vinkeln mellan de två vektorerna, som nu kallas alfa. Gör en projektion med vektorn mellan centrosome och cellen centrum med hjälp av Guassian av alfa och sedan beräkna polaritetsindexet för organellen genom att dividera den projicerade vektorn, a, med b.Således indikerar ett polaritetindex mellan nolla och en en polariserad fenotyp. Värden mellan noll och minus ett anger en icke-polariserad fenotyp. För att bestämma polaritetsindex för mer skingra organeller, såsom lysosomer, kan du använda samma algoritm som nämnts tidigare, ändra organellelokaliseringskoordinaterna för masscentrets koordinater av etiketterna, i detta fall, lysosomer.På samma sätt som den analys som beskrivits tidigare anger ett polaritetsindex mellan noll och ett en polariserad fenotyp, medan värden mellan noll och minus ett indikerar en icke-polariserad fenotyp. För att kvantifiera mängden av varje organell som rekryterats nära till den nya synapsen kan du beräkna andelen av organellfluorescensen vid pärlan. För detta måste du avgränsa pärla och cell område, mäta respektive fluorescens intensitet och sedan dela pärla fluorescens med summan av pärla och cellen fluorescens.Du kommer att erhålla mängden av varje organell som är i kontakt med den nya synapsen. Alternativt ritar du en rektangel mittemot pärlan. Använd en vikt som motsvarar en fjärdedel av celllängden, mät sedan fluorescensintensiteten inom rektangeln och dela den med den totala fluorescensen.Denna algoritm kommer alltid att få den andel av organelle som är nära den nya synapsen, men inte nödvändigtvis i direkt kontakt med gränssnittet. Att kvantifiera de centrosome-associerade komponenterna i vilande och aktiverade B-celler. Kortfattat, vi bestämmer tre parametrar.Cell- och pärlområdet, och centrosomala lokaliseringskoordinaterna. Därefter definierar vi en cirkel som omger centrosome och kör en radiell profilanalys från mitten av centrosome, tidigare definierade. När du har tomten, bestämma den radie vid vilken 70%av den maximala fluorescensen bibehålls.Använd denna radie för att rita en cirkel som omger centrosome. Slutligen, erhålla fluorescens densitet av den komponent av intresse vid centrosome området och cellen området, och dela båda värdena för att erhålla fluorescerande densitet förhållandet. För att mäta fördelningen av organeller vid immunsynapssnittet, identifiera först området för de B-celler som kommer i kontakt med det antigenbelagda täcket.Du kan märka actin som hjälper dig att definiera det här området. Därefter mäter du området i kontakt med bilden, höjden och bredden på cellen. Det område som är mot den antigenbelagda täcksnedsteget är ett mått på B-cell som sprids vid B-cellaktivering.Använd värdena för höjd och bredd för att avgränsa ett centralt område i cellen, som är separerat från gränserna med en fjärdedel av höjden och breddvärdena. Vanligt motsvarars dessa till ungefärligt en third av den sammanlagda cellen område. Slutligen beräkna organell rekrytering i mitten av den nya synapsen, dela fluorescens densitet vid det centrala området med fluorescens densitet av hela cellen.Positiva värden av detta index indikerar en organellberikning i centrum av den nya synapsen. Tvärtom tyder negativa värden på en perifer fördelning. För att mäta fördelningen av organeller över z-plan av B-celler aktiveras på antigen-belagda täcken, först avgränsa synaptiska gränssnittet och den övre gränsen för cellen.Därefter ritar du en linje över cellens centrum och reslice bilden för att få en XZ-bild. Mät cellens huvud och dela upp bilden i 10 fraktioner av samma område, från immunsynapsen till cellens övre gräns. Mät fluorescensen i varje z-bråk och beräkna procenten fluorescens genom att dividera fluorescensen vid varje z-fraktion med cellens totala fluorescens.Slutligen rita andelen fluorescens intensitet per z-fraktion. Bråk ett och två representerar synapsgränssnittet. Här är arbetsflödet eller centrosome isolering förfarande.Använd 20 miljoner B-celler per villkor. Pre-behandla celler med Cytochalasin D och Nocodazole enligt det protokoll som krävs för att underlätta centrosome avlossning. Därefter titta på celler genom att återutgöra dem i 5 mL TBS-buffert.Upprepa genom att använda 1 mL 0,1x TBS-buffert kompletterad med 8%sackaros. Resuspend cell pelleten med 150 mikroliter av lys buffert. Centrifugera vid 10, 000 g i 10 minuter vid 4 grader Celsius för att separera cytosolen och organeller från kärnan.Återkräv försiktigt cellens supernatant och placera ovanpå ett 1,5 mL-rör. Fyll den med 300 mikroliter gradientbuffert kompletterat med 60%sackaros. Centrifugera prover vid 10, 000 g i 30 minuter vid 4 grader Celsius.Detta centrifugeringssteg är viktigt för att koncentrera centrosomerna. Efter centrifugeringen ska du försiktigt ta bort supernatanten tills du når gränssnittet. Vortexa provet kvar i röret.Förbered diskontinuerlig sackarosgradient i ett ultracentrifugrör genom överlagring av 0,45 mL 70%sackaros, med 0,27 mL på 50%sackaros, och därefter 0,27 mL 40%sackaros i gradientbuffert. Placera de centrosomeberikade proverna på den diskontinuerliga gradienten och kalibrera vikten av varje prov i respektive adaptrar. Centrifugera rören vid 40, 000 g i 1 timme vid 4 grader Celsius, med minimal acceleration och utan paus för att undvika att blidkar lutningen.Efter centrifugeringen, samla försiktigt 12 fraktioner med lika stor volym. Resuspend provet med lastning buffert och köra en SDS-PAGE. För att studera organellfördelning i B-celler under bildandet av en immunsynaps, använde vi 2A1.6 B-celler som aktiveras med antigenbelagda pärlor för olika tidspunkter.Som kontroll aktiverades B-celler med pärlor som innehåller en icke-närstående BCR-ligand. Vi sedan, med hjälp av immunofluorescens färgning, upptäcker olika organeller, som ändrar deras lokalisering vid aktivering med immobiliserade antigener. Vi visar här centrosome, märkt med alfa-tubulin och golgi apparat märkt med Rab6a.I diagrammet visar vi polaritetsindex för centrosome och golgi apparat polaritet verus varje tidpunkt för aktivering, där varje punkt representerar en cell. Under aktiveringen kan vi konstatera att polaritetsindexen för dessa organeller når värden närmare 1, vilket tyder på en ökning av deras rekrytering till IS.Organelles som visar en mer spridd fördelning, såsom lysosomer, också kan kvantifieras med hjälp av ett polaritetsindex. Vi kan konstatera att polaritetsindexet för lyosomen kommer att nå mer positiva värden vid aktivering, vilket är resultatet av rekryteringen till IS. Vi visar ett kompletterande tillvägagångssätt för att kvantifiera rekryteringen av en lyssom mot immunsynapsen.Med hjälp av samma protokoll för aktivering med antigenbelagda pärlor beräknades lysosomrekrytering till IS genom att kvantifiera fluorescensetiketten för lyosomer som rekryterats till det område som definieras runt pärlan eller inom synapsområdet. Vi kan observera att öppen aktivering. Det finns en ökning av lysosomer kopplade till platsen för synaps.Här presenterar vi kvantifieringen av aktin vid centrosome i B-celler aktiveras med specifika och icke-specifika antigen-belagda pärlor. Poolen av aktin indikeras med en pil. Kvantifiering av centrosome-associerade komponenter, såsom aktin i detta fall, kan representeras av dot plot, där varje punkt representerar en cell.Efter aktiveringen minskar B-cellen i mängden aktin runt centrosome. Detta steg är viktigt att lossa centrosome från perinuclear regionen för att tillåta dess polarisering till den nya synapsen. För B-cell som aktiveras på antigenbelagd yta kan du studera aktinremodellering samt rekrytering av organeller till synapsmembranet.Här visar vi analysen av organeller, såsom golgi apparaten och endoplasmatiska retikulum, som visar en central och perifera fördelning, respektive. Dessutom kan vi beräkna spridningsområdet för B-celler efter olika tidpunkter för aktivering. För detta ändamål, vi etikett aktin för att kunna definiera cellen gränsen i XY planet.I grafen kan du observera ökningen i cellområdet efter 30 och 60 minuters aktivering. Fördelningen av en organell kan också beräknas i XZ-planet i respektive till synapsgränssnittet. Grafen representerar fördelningen av aktin i z-plan, där de två första planen motsvarar synapsgränssnittet.Vi kan konstatera att aktin blir berikad på detta område vid aktivering. Förutom bildframställningsanalys kan biokemisk metod också användas för att studera förändring av centrosome sammansättning vid B-cellaktivering. Vi visar här en representativ västerländsk blot av centrosome-innehållande fraktion markeras av den beige rektangeln.Centrosome fraktioner var isolerade på en diskontinuerlig sackaros gradient och upptäcks av gamma-tubulin utjämning. Western blot nedan visar aktin och Arp2 i centrosome fraktioner från vilande B-celler, som blir uttömda vid aktivering. B-lymfocyter genomgår dynamiska förändringar vid membrangränssnittet för att bilda en funktionell immunsynaps.Denna process kan studeras av bildbehandling och biokemiska tekniker som beskrivs här i denna video. Vi tror att denna analys kan ge värdeinformation om de molekylära mekanismer som är involverade om hur B-celler kan bli effektivt aktiverade.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Induktion och Bedömning av klass Switch rekombination i Renad mus B-celler

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Använda fluorescerande proteiner för att visualisera och kvantifiera<em&gt; Klamydia</em&gt; Vacuole tillväxtdynamiken i levande celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

En Endothelial Planar Cell Modell för Imaging Immunologisk Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Upptäcka Cortex Fragment Under Bacterial sporgroning

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Metoder för att studera<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilmer som en modell för att karakterisera Small Molecule Biofilm hämmare

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapsen i det mänskliga systemet använder Imaging flödescytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualisera den aktin och mikrotubuli Cytoskeletons på B-cellen immun synapsen använder stimulerad Emission utarmning (STED) mikroskopi

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Två-foton Intravital avbildning av leukocyter under immunsvaret i lipopolysackarid-behandlade mus lever

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...