Name: studying organelle dynamics in b cells during immune synapse formation
Uploaded: 2019-06-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation at JoVE.com

M.-I.Y. FONDECYT #1180900 bir araştırma hibe tarafından desteklenmektedir. J.I., D.F. ve si., Comisión Nacional de ciencia y Tecnología 'dan Burslar tarafından destekleniyor. Biz video kayıt ve düzenleme için Pontificia Universidad Católica de Chile David Osorio teşekkür ederiz.

Not: aşağıdaki adımları ııA 1,6 B hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi.
1. antijen kaplı boncuk ile B hücresi aktivasyonu
<ol><li>Antijen kaplı boncuklar hazırlanması
	<ol>
<li>B hücrelerini etkinleştirmek için, 3 μm NH2' nin 50 μL (~ 20 x 106 boncuk) kullanılarak hazırlanan (BCR-ligand +) veya aktifleştirmeden (BCR-ligand-) antijenlere sahip olan, kovalent antijen (AG kaplı boncuk) ile kaplı NH2-boncuk kullanın.</li>
		<li>IIA 1,6 B...

<ol>
	<li>Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+Acquire+Particulate+Antigen+in+a+Macrophage-Rich+Area+at+the+Boundary+between+the+Follicle+and+the+Subcapsular+Sinus+of+the+Lymph+Node.">Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node.</a> Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+at+the+centrosome+controls+lymphocyte+polarity.">Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+antigen+extraction+in+the+B+cell+synapse.">Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse.</a> Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).</li><li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+Receptor-Mediated+Antigen+Gathering+Requires+Ubiquitin+Ligase+Cbl+and+Adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+Recruit+Dynein+to+the+Signaling+Microcluster.">B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster.</a> Immunity. , (2011).</li><li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap1+&#8211;+cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse.">The Rap1 &#8211; cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).</li><li>Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+ligand+discrimination+through+a+spreading+and+contraction+response.">B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response.</a> Science. 312 (5774), 738-741 (2006).</li><li>Vascotto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin-based+motor+protein+myosin+II+regulates+MHC+class+II+trafficking+and+BCR-driven+antigen+presentation.">The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation.</a> Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).</li><li>Reversat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3+controls+B-cell+receptor+dynamics+and+antigen+extraction+at+the+immune+synapse.">Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse.</a> Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).</li><li>Lankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Major+Histocompatibility+Complex+Class+II+Compartments+during+B+Cell+Receptor&#8211;mediated+Cell+Activation.">Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor&#8211;mediated Cell Activation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).</li><li>Duchez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Polarization+of+T+and+B+Cells+at+the+Immunological+Synapse.">Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse.</a> The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).</li><li>P&#233;rez-Montesinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+the+intracellular+association+of+selected+rab+small+GTPases+with+MHC+class+II+and+DM+during+dendritic+cell+maturation.">Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation.</a> Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).</li><li>Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre&#180;, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume&#180;nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk-dependent+Actin+Dynamics+Regulate+Endocytic+Trafficking+and+Processing+of+Antigens+Internalized+through+the+B-Cell+Receptor.">Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor.</a> Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).</li><li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Isolation+of+Centrosomes+from+Cultured+Cells.">Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).</li><li>Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+centrosomes+from+mammalian+cell+lines.">Purification of centrosomes from mammalian cell lines.</a> Methods in Cell Biology. 129, (2015).</li><li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vamp-7&#8211;dependent+secretion+at+the+immune+synapse+regulates+antigen+extraction+and+presentation+in+B-lymphocytes.">Vamp-7&#8211;dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+B+Cell+Activation+BCR:+B+cell+receptor.">Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor.</a> Annual Review of Immunology. , (2010).</li><li>Yuseff, M. I., Lennon-Dum&#233;nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+use+conserved+polarity+cues+to+regulate+their+antigen+processing+and+presentation+functions.">B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).</li></ol>

B lenfositlerinin bir IS oluşumunu teşvik etmek için hücre içi mimarisini nasıl yeniden organize ettiğini incelemek için kapsamlı bir yöntem tarif ediyoruz. Bu çalışmada, B hücresi aktivasyonu sırasında centrosome, Golgi aparatı ve lisosomlar gibi organellerin hücre içi dağılımını ölçmek için görüntüleme tekniklerini ve IS 'e nasıl polarize edildiğini içerir. Ayrıca, B hücresi aktivasyonu üzerine centrosome bileşiminde değişiklikleri incelemek için bir biyokimyasal yaklaşım açı...

B lenfositler farklı tehditler ve istila patojenlere karşı antikorlar üreten sorumlu adaptif bağışıklık sisteminin önemli bir parçasıdır. Antikor üretiminin verimliliği, B hücrelerinin elde edilmesi, işleyişlerine ve mevcut antijenlere, çözünür veya yüzeye bağlı bir formda1,2' de karşılaşılan yeteneğine göre belirlenir. Sunma hücresinin yüzeyine bağlı antijenlerin tanınması, BCR tarafından, yakın bir hücresel temas oluşumuna yol açar3,4. Bu dinamik platformda BCR 'ye bağımlı akım sinyalizasyon ve antijenlerin Endo-lysosome bölmeler içine inilemasyonu gerçekleşir. Alınan antijenler MHC-II molekülleri üzerine işlenmiş ve monte edilir ve daha sonra T lenfositlerine sunulmuştur. Üretken B-T etkileşimleri, B-T hücre işbirliği olarak adlandırılan, B lenfositlerin antikor üreten plazma hücreleri veya bellek hücreleri içine farklılaşma teşvik uygun sinyalleri almak için izin8.
İki mekanizma B hücreleri tarafından antijen ekstraksiyon dahil edilmiştir. Birincisi Sinaptik yarık5,6' da işe alma ve füzyon geçmesi lisosomlar kaynaklanan proteazların salgılanmasını dayanır. İkincisi, Myosin ııA-mediated Çekme güçleri bu Clathrin kaplı çukurları içine oyulmuş olan antijen içeren membranların invaginasyon tetikler bağlıdır7. Antijenlerin bulunduğu membranın fiziksel özelliklerine antijen ekstraksiyon modu dayanır. Yine de, her iki durumda da, B hücreleri iki büyük remodeling olaylar geçmesi: aktin siterit yeniden yapılanma ve Is için organizler kutuplaşma. Actin sitroiskelet remodeling, sinaptik membranda akin bağımlı çıkıntılar antijen ile temas yüzeyini artıran bir ilk yayılan aşama içerir. Bu bir kasılma aşaması tarafından izlenir, nerede BCrs antijenler ile birleştiğinde, molekül motorları ve aktin sitofülit remodeling tarafından uyumlu eylem tarafından merkezi yoğunlaşmıştır8,9,10, 11. organizasyonun polarizasyon da aktin sitajin remodeling dayanır. Örneğin, centrosome çekirdeğinden, ilişkili actin yerel depolimerizasyon tarafından, bu organel yeniden konumlandırılması için5,12sağlar tarafından unoupled olur. B hücrelerinde, bir hücre Kutbu centrosome yeniden konumlandırılması (IS) sinaptik membran için liksosome işe kılavuzları, hangi salgılanma üzerine çıkarma ve/veya yüzey-gergin antijenlerin işlenmesi kolaylaştırabilir6. Is 'de istihdam edilen lysosomes, T hücrelerinin13' e sunulması için endosomal bölmeler içinde Peptide-MHC-II kompleksleri oluşumunu sağlayan MHC-II ile zenginleştirilmiştir. Ayrıca, Golgi aparatının da yakın Is14için işe olduğu gözlenmiştir, Golgi-sır yolu gelen veziküller antijen ekstraksiyon ve/veya işleme dahil olabileceğini düşündürmektedir.
Sinaps oluşumu sırasında B hücrelerinde hücre içi organel ve siteron yeniden düzenlemeleri, daha fazla aktivasyonu için gerekli olan verimli antijen alımı ve işlenmesine izin veren önemli adımlara sahiptir. Bu çalışmada, B hücrelerinde görüntüleme ve biyokimyasal analizlerin nasıl yapılacağı hakkında ayrıntılı protokoller tanıtmak, bir IS oluşumu ile ilişkili organellerin hücre içi remodeling çalışma. Bu teknikler şunlardır: (i) antijen kaplı boncuklar ile aktif B hücrelerinin Immünofluorescence ve görüntü analizi ve IS ve (ii) için seferber edilmiş hücre içi bileşenlerin görüntüleme ve ölçümleme sağlayan antijen kaplı kapak ) B hücrelerinde centrosome-zenginleştirilmiş fraksiyonları izolasyonlu, sukroz degradeler üzerinde ultracent, protein ile ilişkili proteinlerin tanımlanması, potansiyel Hücre polaritesi düzenleyen dahil sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells</td>
			<td style="width:74px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-208</td>
			<td style="width:172px;">Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without Fc&#947;IIR</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">100% methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular</td>
			<td>Marienfield-Superior</td>
			<td align="right">111500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>LifeTech&#160;</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit &#160;IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A-11071</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A21238</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amaxa Nucleofection kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1003</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amaxa Nucleofector model 2b</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program L-013 used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amino- Dynabeads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14307D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-pericentrin</td>
			<td>&#160;Abcam</td>
			<td>ab4448&#160;</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-rab6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95954</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-sec61</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15575</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BSA</td>
			<td>&#160;Winkler</td>
			<td>&#160;BM-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>CA-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Culture plate T25</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">353014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fiji Software</td>
			<td style="width:74px;">Fiji col.</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fluoromount G</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G7651&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glycine</td>
			<td>Winkler&#160;</td>
			<td>BM-0820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>IIA1.6 positive ligand</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Goat-anti-mouse IgM antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">31186</td>
			<td>IIA1.6 negative ligand</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HyClone Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivate at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>PO-1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Leica SP8 TCS microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Winkler</td>
			<td>SO-1455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope</td>
			<td>&#160;Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Parafilm</td>
			<td>M</td>
			<td>P1150-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Polybead Amino Microspheres 3.00&#956;m</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>17145-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Dilute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti- alpha tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>1:1000 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti mouse lamp1 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td align="right">3243</td>
			<td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit anti-cep55&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170414</td>
			<td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody</td>
			<td>&#160;Abcam</td>
			<td>ab16504</td>
			<td>&#160;1:1000 for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RPMI-1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-104-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Saponin</td>
			<td>&#160;Merck</td>
			<td align="right">558255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sucrose</td>
			<td>Winkler&#160;</td>
			<td>SA-1390&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Triton X-100</td>
			<td>&#160;Merck</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying organelle dynamics in b cells during immune synapse formation

B hücresi reseptörü (BCR) tarafından yüzeye bağlı antijenlerin tanınması, hem sinyalizasyon hem de antijen alımı koordine edilen bir bağışıklık sinapse (IS) oluşumunu tetikler. Is oluşumu, centrosome ve lisosomlar ve Golgi aparatları gibi hücre içi organellerin sinaptik membranına polarize işe alımı ile birlikte dinamik aksinlerin yeniden biçimlendirilmesi içerir. Aktin remodeling ilk aşamaları B hücreleri kendi hücre yüzeyini artırmak ve antijen-BCR kompleksler sinaps toplanan miktarını maksimize izin verir. Belirli koşullar altında, B hücreleri sert yüzeylerle ilişkili antijenleri tanırken, bu süreç antijen ekstraksiyonu kolaylaştırabilen liksosomların yerel işe alma ve salgılanmasını birleştirilmiştir. Alınan antijenler, büyük histouyumluluk kompleksi II (MHC-II) molekülleri T helper hücrelerine daha fazla sunum için yüklü peptitler içine işleme için özel Endo-lysosome bölmeleri içine emdirilmiş vardır. Bu nedenle, bir IS oluşumu ile ilişkili organel dinamikleri eğitim B hücrelerinin nasıl aktif olduğunu anlamak için çok önemlidir. Bu yazıda hem görüntüleme hem de hücre içi organel konumlandırma ve B hücrelerinde bir IS oluşumu ile ilişkili siterografi yeniden düzenlemeleri değişiklikleri incelemek için kullanılan bir biyokimyasal tekniği tartışacağız.

Bu makalede, B hücrelerinin bir IS oluşumunu teşvik etmek için boncuk veya Cover, immobilize antijen kullanılarak nasıl aktive edilebilir gösterir. Biz nasıl tanımlanacağı ve immünofluorescence tarafından farklı organizlerin polarizasyon ölçmek ve nasıl, Is için polarize centrosome, kendi birlikteliği dinamik değişiklikler geçmesi proteinleri karakterize hakkında bilgi sağlamak bir kullanarak biyokimyasal yaklaşım.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation at JoVE.com

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Burada bir IS oluşumu sırasında B lenfositlerinde hücre kutuplaşma olaylarını karakterize etmek için iki yaklaşım açıklanmaktadır. İlk olarak, sinaptik membranda organel işe alma ve sitroiskelet yeniden düzenlemelerinin ölçülmesini içerir. İkinci bir biyokimyasal yaklaşım, sentez bileşiminde değişiklikleri karakterize etmek, hangi bağışıklık sinaps için polarizasyon uğrar.

Immün SYNAPSE oluşumu sırasında B hücrelerinde organelle dinamikleri eğitimi

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Bu derlemede hem organel konumlandırma ve bileşimini incelemek için kullanılan görüntüleme ve biyokimyasal tekniklerin yanı sıra immünolojik sinaps oluşumu sırasında gözlenen sitoiskelet yeniden düzenlemeleri tartışacağız. Etkin yeniden şekillendirmenin ilk aşamaları, B hücrelerinin hücre yüzeylerini artırmalarına ve sinapsta toplanan antijen BCR komplekslerinin miktarını en üst düzeye çıkarmalarına olanak sağlar. Öte yandan, sinaptik membrandaki centrozomile birlikte, lizozomların lokal olarak işe alınması, immobilize antijenlerin çıkarılmasını kolaylaştırdığı bilinen lizom sekresyonu ile birleşebilir.Alınan antijen, t yardımcı hücrelerine sunulmak üzere MHC sınıf II moleküllerine yüklenen peptidlere endoskopik kompartımama içinde daha fazla işlenir. Bu nedenle, bağışıklık sinaps ile ilişkili organel dinamikleri incelenmesi Nasıl B hücreleri tam olarak aktive olduğunu anlamak için çok önemlidir. İmmobilize antijenlerle aktive edilen B hücrelerinin immünororesansı farklı hücre bileşenlerini ve bağışıklık sinapslarına nasıl girebileceklerini takip etmemizi sağlar.B hücreleri bir boncuk yüzeyinde veya kapak kayması yüzeyinde immobilize antijenler aracılığıyla aktive edilebilir. Antijen kaplı boncuklar amino grupları aktive etmek için daha önce glutaraldehit ile tedavi amino boncukile belirli ligandlar kuluçka tarafından hazırlanır. PBS ve girdap 100 mikrolitre aktif boncukresuspend.Bu arada, 150 mikrolitre PBS'ye BCR ligand'ın mL başına 100 mikrogramını ekleyerek antijen çözeltisini hazırlayın. Sonra, antijen çözeltisine 50 mikrolitre aktif boncuk ekleyin ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Unutmayın, aynı zamanda negatif kontrol olarak ilgisiz bir ligand kullanın.Kuluçkadan sonra boncukları PBS ile yıkayın. Supernatant aspire ve PBS ile değiştirin. Üç kez tekrarlayın.Daha sonra, BSA bir çözeltisi 500 mikrolitre resuspended boncuklar tarafından üç amino grupları bloke. Son olarak, PBS 70 mikrolitre boncuk resuspend. Son konsantrasyonu hesaplamak için, boncukları saymak için hemositometre kullanabilirsiniz.B hücre aktivasyonu için, 50 mL tüp kullanın ve CLICK%5 fetal sığır serumu ile desteklenen mL başına 1,5 milyon konsantrasyona hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra, hücre boncuk karışımının 100 mikrolitresine karşılık gelen 150,000 B hücreyi, farklı zaman noktaları için 37 derecede poli-L-lizin kaplı kapaklı bir reklam kuluçkaya yatırın. B hücrelerini aktive etmek için ikinci bir yaklaşım antijen kaplı kapakları üzerine tohumlama olduğunu.Bu amaçla, anti-BCR ve B220 ile kat slaytlar hücre yapışmasını artırır. Antijen çözeltisini, pbs'a mL başına 10 mikrogram ve mL başına 0,5 mikrogram lık son konsantrasyona ekleyerek hazırlayın. Daha sonra, parafilm film kaplı 24 kuyu plaka bir kapak üzerinde coverslip ayarlayın ve antijen çözeltisi 40 mikrolitre ekleyin.Plakayı kapatın ve bir gecede 4 derecede kuluçkaya yatın. Coverslip aktivasyon başlatmak için, ilk PBS ile yıkayın ve birkaç dakika kurumasını bekleyin. Sonra, 150, 000 B hücreleri ekleyin ve farklı zaman noktaları için 37 derece kuluçka.Her iki durumda da, boncuk veya antijen kaplı slaytlar ile etkinleştirirken, en uzun zaman noktası ile başlayan ve daha sonra kısa olanlara devam öneririz. Kuru kapak kaymasını mikroskop slaytına monte ettikten sonra, çözünürlük gereksinimlerine bağlı olarak numunelerinizi görüntülemek için bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanabilirsiniz. Aktarılan ışığı kullanarak numuneye odaklanın.Hücrelerin ve boncukların tek bir oranda etkileşimiçinde olduğu alanları aramalısınız. Antijen kaplı kapaklarda aktive edilen B hücreleri için daha iyi çözünürlük için 100x hedefini kullanın. Parametreler için, tüm hücreyi kapsayan bir z yığını almayı düşünün.Hücrenin alt ve üst sınırlarını sınırlamak için actin etiketleyebilirsiniz. Antijen kaplı boncuklarla aktive edilen ve bir noktaya hapsedilmiş organeller için etiketlenen B hücreleri için, ilk olarak iki alanın sınırlandırılması: hücre alanı ve boncuk alanı. Daha sonra, pozisyonu veya organeli bir nokta ile belirleyin ve yerelleştirme koordinatlarını elde edin.İki vektör çizin: biri hücre merkezi ile organel arasında, diğeri de hücre merkezi ile boncuk merkezi arasında. Her ikisinin de uzunluğunu ölçün ve şimdi alfa olarak adlandırılan iki vektör arasındaki açıyı ölçün. Alfa Guassian kullanarak centrozsome ve hücre merkezi arasında vektör ile bir projeksiyon yapmak ve sonra yansıtılan vektör, a, b bölerek organel polarite indeksi hesaplamak.Böylece sıfır ve bir arasında bir polarite indeksi polarize bir fenotip gösterir. Sıfır ve eksi arasındaki değerler polarize olmayan bir fenotipgösterir. Daha fazla dağılım organı için polarite indeksi belirlemek için, örneğin izozomlar gibi, daha önce bahsedilen algoritmayı kullanabilirsiniz, bu durumda, kitle merkezinin etiketlerin koordinatları için organel lokalizasyon koordinatlarını değiştirerek, lizozomlar.Daha önce açıklanan analize benzer şekilde, sıfır ile bir arasındaki polarite indeksi polarize bir fenotip gösterirken, sıfır ile eksi arasındaki değerler polarize olmayan bir fenotipi gösterir. Yeni sinapsa yakın olarak alınan her organelin miktarını ölçmek için boncuktaki organel floresan yüzdesini hesaplayabilirsiniz. Bunun için, boncuk ve hücre alanı sınırlamak gerekir, ilgili floresan yoğunluğuölçmek ve daha sonra boncuk floresan toplamı ve hücre floresan bölün.Yeni sinaps ile temas eden her organelin miktarını elde eyleyeceksiniz. Alternatif olarak, boncuk karşısında bir dikdörtgen çizin. Hücre uzunluğunun çeyreğine karşılık gelen bir ağırlık kullanın, ardından dikdörtgenin içindeki floresan yoğunluğunu ölçün ve toplam floresan ile bölün.Bu algoritma her zaman yeni sinaps yakın organel yüzdesini elde etmek için, ancak mutlaka arayüzü ile doğrudan temas. Dinlenme ve aktive B hücrelerinde centrozom ilişkili bileşenleri ölçmek için. Kısaca, üç parametre belirleriz.Hücre ve boncuk alanı ve merkezomal lokalizasyon koordinatları. Daha sonra, centrozom çevreleyen bir daire tanımlamak ve centrozom merkezinden radyal profil analizi çalıştırın, daha önce tanımlanmış. Çizimi aldıktan sonra, maksimum floresanların %70'inin korunabilen yarıçapı belirleyin.Centrozom çevreleyen bir daire çizmek için bu yarıçapı kullanın. Son olarak, centrozsome alan ve hücre alanında ilgi bileşeni floresan yoğunluğu elde ve floresan yoğunluk oranı elde etmek için her iki değerleri bölmek. Bağışıklık sinaps arabiriminde organellerin dağılımını ölçmek için, öncelikle antijen kaplı kapak lı ile temas eden B hücrelerinin alanını belirleyin.Bu alanı tanımlamanıza yardımcı olacak şekilde actin etiketleyebilirsiniz. Ardından, slaytla temas eden alanı, hücrenin yüksekliğini ve genişliğini ölçün. Antijen kaplı kapak kayma bakan alan B hücre aktivasyonu üzerine yayılan B hücre nin bir ölçüsüdür.Hücredeki merkezi bir alanı sınırlamak için yükseklik ve genişlik değerlerini kullanın, bu alan sınırlardan yüksekliğin dörtte biri ve genişlik değerleriyle ayrılmıştır. Genellikle bunlar toplam hücre alanının yaklaşık üçte biri karşılık gelir. Son olarak, yeni sinaps merkezinde organel işe hesaplamak, tüm hücrenin floresan yoğunluğu ile merkezi alanda floresan yoğunluğu bölen.Bu indeksin pozitif değerleri yeni sinaps merkezinde bir organel zenginleştirme gösterir. Aksine, negatif değerler çevresel dağılımı gösterir. Antijen kaplı kapaklarda aktive edilen B hücrelerinin z düzlemleri boyunca organellerin dağılımını ölçmek için önce sinaptik arabirimi ve hücrenin üst limitini sınırlandırın.Ardından, hücre merkezine bir çizgi çizin ve xz görüntüsü elde etmek için görüntüyü yeniden dilimleyin. Hücrenin başını ölçün ve görüntüyü bağışıklık sinapsından hücrenin üst sınırına kadar aynı alanın 10 fraksiyonuna bölün. Her z-fraksiyonundaki floresan'ı ölçün ve her z-fraksiyonundaki floresan'ı hücrenin toplam floresanına bölerek floresan yüzdesini hesaplayın.Son olarak, z-fraksiyonu başına floresan yoğunluğu yüzdesini çizin. Kesir bir ve iki sinaptik arabirimi temsil. İşte iş akışı veya centrosome izolasyon prosedürü.Durum başına 20 milyon B hücresi kullanın. Sitokasin D ve Nocodazol içeren hücreleri centrozom kopmasını kolaylaştırmak için gerekli protokole göre ön tedavi edin. Daha sonra, hücreleri 5 mL TBS arabelleği içinde yeniden suyararak izleyin.%8 sakaroz ile desteklenen 0.1x TBS tamponunun 1 mL'sini kullanarak tekrarlayın. 150 mikrolitre likis tamponu ile hücre peletini yeniden askıya alın. Sitosol ve organelleri çekirdekten ayırmak için 10, 000 g'de 4 santigrat derecede 10 dakika bekleyin.Hücre supernatant'ı dikkatlice kurtarın ve 1,5 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin. %60 sakaroz ile desteklenen 300 mikrolitre degrade tampon ile doldurun. Santrifüj örnekleri 10, 000 g'da 30 dakika 4 santigrat derecede.Bu santrifüj adımı santrizomları yoğunlaştırmak için önemlidir. Santrifüjden sonra arayüze ulaşana kadar supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Tüpte kalan numuneyi girdap.0,45 mL 70%sakaroz, 0,27 mL %50 sakaroz ve daha sonra 0,27 mL%40 sakaroz degrade tamponunu boylayarak ultracentrifuge tüpte kesintisiz sakaroz gradyanı hazırlayın. Centrozomla zenginleştirilmiş numuneleri kesintili degradenin üzerine yerleştirin ve her numunenin ağırlığını ilgili adaptörlerde kalibre edin. Tüpleri 40, 000 g'da 4 santigrat derecede 1 saat, minimum hızlanma ile ve degradeyi tedirgin önlemek için mola vermeden santrifüj edin.Santrifüjden sonra, eşit hacimde 12 kesir dikkatlice toplayın. Yükleme arabelleğiyle örneği yeniden askıya alın ve bir SDS-PAGE çalıştırın. Bağışıklık sinaps oluşumu sırasında B hücrelerinde organel dağılımını incelemek için farklı zaman noktaları için antijen kaplı boncuklarla aktive edilen 2A1.6 B hücreleri kullanıldı.Kontrol olarak, B hücreleri alakasız BCR-ligand içeren boncuklarla aktive edildi. Daha sonra, immünoresans boyama kullanarak, immobilize antijenler ile aktivasyon üzerine lokalizasyonunu değiştirmek farklı organeller, tespit yok. Burada rab6a ile etiketlenmiş alfa-tubulin ve golgi aparatı ile etiketlenmiş centrozomları gösteriyoruz.Grafikte, her noktanın bir hücreyi temsil ettiği her aktivasyon noktasında sentrozom ve golgi aparatı polarite verus için polarite indeksi gösteriyoruz. Aktivasyon sırasında, bu organellerin polarite indekslerinin 1'e yakın değerlere ulaştığını gözlemleyebiliriz, bu da lizozomlar gibi daha dağınık bir dağılım gösteren IS.Organeller'e işe alımlarında bir artış olduğunu düşündürmektedir, ayrıca polarite indeksi kullanılarak ölçülebilir. Liozomitpolarite indeksinin aktivasyon la daha olumlu değerlere ulaşacağını gözlemleyebiliriz, bu da İd'e işe alımdan kaynaklanan sonuçlar. Bağışıklık sinapsına doğru bir izozom alımını ölçmek için tamamlayıcı bir yaklaşım gösteriyoruz.Antijen kaplı boncuklarla aynı aktivasyon protokolü kullanılarak İd'e lizom alımı, boncuk çevresinde veya sinaptik alan içinde tanımlanan bölgeye alınan lyozomların floresan etiketinin ölçülmesi yle hesaplanmıştır. Açık aktivasyonu gözlemleyebiliriz. Sinaps bölgesine birleşen lyzomlarda artış vardır.Burada spesifik ve spesifik antijen kaplı boncuklarla aktive edilen B hücrelerinde sentrozomda aktin miktarını sunuyoruz. Aktin havuzu bir okla gösterilir. Bu durumda aktin gibi centrosome ilişkili bileşenlerin nicelleştirilmesi, her noktanın bir hücreyi temsil ettiği nokta çizimi ile temsil edilebilir.Aktivasyondan sonra, B hücresi centrozom çevresindeki aktin miktarında azalır. Bu adım, sentrozonun perinükleer bölgeden ayrılması ve kutuplaşmasının yeni sinapsa ayrılması için önemlidir. Antijen kaplı yüzeyde aktive edilen B hücresi için, aktin remodeling yanı sıra sinaptik membran organellerin işe çalışabilirsiniz.Burada sırasıyla merkezi ve periferik dağılım gösteren golgi aparatı ve endoplazmik retikulum gibi organellerin analizini gösteriyoruz. Ayrıca, farklı aktivasyon noktalarından sonra B hücrelerinin yayılma alanını hesaplayabiliriz. Bu amaçla, XY düzlemindeki hücre limitini tanımlayabilmek için actin etiketliyiz.Grafikte, etkinleştirme 30 ve 60 dakika sonra hücre alanında artış gözlemleyebilirsiniz. Bir organelin dağılımı XZ düzleminde sinaptik arayüze göre de hesaplanabilir. Grafik, ilk iki düzlemin sinaptik arabirime karşılık geldiği z düzleminde aktin dağılımını temsil eder.Aktivasyon üzerine aktivasyonun bu alanda zenginleştiğini gözlemleyebiliriz. Görüntüleme analizine ek olarak, biyokimyasal yaklaşım da B hücre aktivasyonu üzerine centrozom bileşimindeki değişimi incelemek için kullanılabilir. Burada bej dikdörtgen tarafından vurgulanan centrosome içeren fraksiyonu temsili bir Batı leke göstermektedir.Centrozsome fraksiyonları bir kesintili sakaroz gradyan izole edildi ve gama-tubulin tesviye tarafından tespit edildi. Aşağıdaki Western blot aktivasyon üzerine tükenmiş hale b hücrelerinin dinlenme gelen centrozsome fraksiyonları actin ve Arp2 gösterir. B lenfositler fonksiyonel bir immün sinaps oluşturmak için membran arabiriminde dinamik değişikliklere uğrarlar.Bu süreç, bu videoda açıklanan görüntüleme ve biyokimyasal teknikler ile incelenebilir. Bu analizin, B hücrelerinin nasıl etkin bir şekilde aktive edilebileceğine dair moleküler mekanizmalar hakkında değer bilgisi sağlayabileceğine inanıyoruz.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Sınıf Anahtarı Rekombinasyon murin B Hücreleri Saf İndüksiyon ve Değerlendirme

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Aktin ve Mikrotubul Cytoskeletons uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi kullanarak B-hücre bağışıklık sinaps, görselleştirme

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...