Name: translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

ويدعم عمل الدكتور رين من قبل جمعية القلب الأمريكية (13SDG14800019; BR)، مؤسسة أمل آن (FP00011709؛ BR)، والجمعية الأمريكية للسرطان (86-004-26؛ ومركز السرطان MCW إلى BR)، والمعهد الوطني للصحة (HL136423؛ BR)؛ ويدعم الأردن بالمر من قبل 2018 MCW CTSI 500 نجوم برنامج التدريب; P. موران مدعوم من منحة التدريب على البحوث المؤسسية من NHLBI (5T35 HL072483-34).

بالنسبة للتجارب الحيوانية، تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية الطب في ويسكونسن.
1. إعداد الكواشف
<ol><li>إعداد العازلة الليسيس لتركيزات 10 M HEPES، درجة الحموضة 7.4، 150 ملككل، 5 م مغكل 2، 0.5 م م DTT، 100 ملغ / مل سيكلوه?...

<ol>
	<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF/PKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan.">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA/PKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming.">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis.">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond:+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis?.">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?.</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li><li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model.">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA/PKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling.">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish.">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li><li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes.">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li></ol>

تكوين الأوعية الدموية هو عملية معقدة متعددة الخطوات، حيث النسخ الجيني الوعائي الخاص بالجماعة الأوروبية وتعبيره يلعب دورا أساسيا في تمايز الجماعة الأوروبية وإعادة برمجة الأوعية الدموية3،4. للتغلب على الحواجز الناجمة عن التنوع الخلوي والتعقيد المعماري لفه...

في الأنسجة المعقدة مثل الدماغ الثدييات والقلب والرئة، والمستويات العالية من التباين الخلوي تعقيد تحليل بيانات التعبير الجيني المستمدة من عينات الأنسجة بأكملها. لمراقبة ملامح التعبير الجيني في نوع معين من الخلايا في الجسم الحي، تم تطوير منهجية جديدة مؤخرا، والتي تسمح باستجواب كامل mRNA المترجمة تكملة من أي نوع الخلية المعرفة وراثيا. وتعرف هذه المنهجية باسم ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) تقنية1،2. وهو أداة مفيدة لدراسة بيولوجيا الخلايا البطانية وتكوين الأوعية الدموية عند الجمع بين التلاعب وراثيا الجينات الأخرى المرتبطة بتكوين الأوعية الدموية في الحيوانات.
لقد أظهرنا أن إشارات PKD-1 الوعائية ونسخ الجينات الوعائية CD36 أمران حاسمان للتمايز في الخلايا البطانية (EC) وتكوين الأوعية الدموية الوظيفي3و4و5 و6. لتحديد الآليات الجزيئية للإشارات الوعائية والأيضية في نسخ الجينات والتحويل عبر EC، أنشأنا فئران TRAP المهندسة وراثيا مع الجينات الوعائية المحذوفة على وجه التحديد على أساس تقنية TRAP1 , 2.وعلاوة على ذلك، في الحيوانات TRAP لدينا، ليس فقط لديهم pkd-1 أو cd36 نقص الجينات في بطانة الأوعية الدموية أو الحذف العالمي للجين cd36، ولكن يتم أيضا وضع علامة وراثيا على بروتين الفلورة الخضراء المعززة (EGFP) وراثيا على المفوضية الأوروبية تترجم الريبوسوسوم. يسمح TRAP بتنقية الرصانة الرائية الريبوسومية مباشرة من بطانة الأوعية الدموية للأنسجة المستهدفة، مما يتيح تحليل التعبير الجيني وتحديد النسخ الجديدة المرتبطة بالتمايز مع الجماعة الأوروبية و تكوين الأوعية الدموية مباشرة تحت في ظروف الجسم الحي. لقد نجحنا في عزل الحمض النووي الريبي من بطانة الرحم في هذه الحيوانات المهندسة وراثيا. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي النقي لمزيد من التوصيف للجينات الوعائية أو الشريانية في تنظيم تمايز الجماعة الأوروبية ووظائفها. يوفر هذا البروتوكول دليل خطوة بخطوة لتنفيذ نهج TRAP لعزل mRNA في ECs مباشرة في الجسم الحي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">G2939AA, 5067-1511 &#38; 5067-1513</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell scrapers</td>
			<td style="width:73px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:123px;">83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">K8855100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Magnet (Dynamag-2)</td>
			<td style="width:73px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">123-21D</td>
			<td>Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">NanoDrop 2000C spectrophotometer</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5430R</td>
			<td>with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Rnase-free 50-mL conical tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 1000-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 200-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 20-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotor for homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Yamato&#160;</td>
			<td style="width:123px;">LT-400D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tube rotator, Labquake brand</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-687-12Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo

وقد اقتصرت العديد من الدراسات على استخدام الاختبارات الخلوية في المختبر والأنسجة الكاملة أو عزل أنواع محددة من الخلايا عن الحيوانات لتحليل هامدة في المختبر للتعبير الجيني عن طريق تسلسل qPCR وRNA. تحليل شامل للنسخ والتعبير الجيني لأنواع محددة من الخلايا في الأنسجة والأعضاء المعقدة سيكون حاسما لفهم الآليات الخلوية والجزيئية التي يتم تنظيم الجينات وارتباطها مع التوازن الأنسجة والجهاز وظائف. في هذه المقالة، نقوم بتوضيح منهجية عزل الحمض النووي الريبي المرتبط مباشرة في الجسم الحي في بطانة الأوعية الدموية من الرئتين الحيوانية كمثال. وسيتم وصف المواد والإجراءات المحددة لمعالجة الأنسجة وتنقية الحمض النووي الريبي، بما في ذلك تقييم نوعية الحمض النووي الريبي والغلة، فضلا عن qPCR في الوقت الحقيقي لتجارب الجينات الشريانية. ويمكن استخدام هذا النهج، المعروف باسم ترجمة تقنية تنقية التقارب الريبوسوم (TRAP)، لتوصيف التعبير الجيني وتحليل النسخ لبعض أنواع الخلايا مباشرة في الجسم الحي في أي نوع محدد في الأنسجة المعقدة.

دراساتنا السابقة4,7 تشير إلى أن CD36 قد تعمل كمفتاح للتمايز الشرياني والشرايين الشعرية عبر مسار الإشارات LPA /PKD-1. لدراسة ما إذا كان محور الإشارات LPA/PKD-1-CD36 ضروريًا للتكوين الشراييني في الجسم الحي، فقد أنشأنا خطوط TRAP الجديدة التي لا تحتوي فقط على نقص CD36 عالميأو نق...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

نقدم نهجا ً لتنقية الرَّناة الرَّاقيزة المنوّجة الوعائية من الخلايا البطانية الوعائية (ECs) مباشرة في أنسجة الدماغ والرئة والقلب باستخدام الأنسجة الوراثية الخاصة بالجماعة الأوروبية للبروتين الفلوري الأخضر المعزز (EGFP) في ريبوسوسوم بالاشتراك مع تنقية الحمض النووي الريبي .

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

مرحبا، أنا بن رين، أنا أستاذ مشارك في الجراحة والهندسة الطبية الحيوية في جامعة ألاباما كلية برمنغهام للطب. مختبرنا المهتمة على بيولوجيا الخلايا البطانية وظيفة الأوعية الدموية اكوجينيسيس في سياق هذه الأمراض القلبية الوعائية الشائعة والسرطانات. أحد أبحاثنا يركز على تنظيم اللاجينية والنسخ من التغاير بين الخلايا البطانية والتخلق الوعائي.لفهم آليات النسخ من تولد الأوعية، أنشأنا خطوط الماوس المعدلة وراثيا هندسة، والتي قمنا ليس فقط حذف جينات محددة المرتبطة تولد الأوعية الدموية في الخلايا البطانية، ولكن سيتم وضع علامات وراثية على مسبار GFP تعزيز الريبوس من الخلايا البطانية الأصلية. وبهذه الطريقة، يمكننا عزل وتنقية حلقات من الحمض النووي الرسول المرتبطة من الخلايا البطانية في مختلف أعضاء الأنسجة مباشرة في الحيوانات المعدلة وراثيا. يمكننا بعد ذلك استخدام الحمض النووي رسول تنقية لتحليل المصب من النصوص ونسخ.بواسطة تسلسل الجيش الملكي النيبالي والبرد في الوقت الحقيقي PCR. في هذا الفيديو ، وطلابي باتريك موران والأردن بالمر وفنيي البحث نيكولاس بارنيكو ورونغ يوان سوف تظهر لك نهج genotyping الفئران المعدلة وراثيا ورسول التعرق RNA مباشرة من endothelial في الحيوانات المعدلة وراثيا. Genotyping هو أولية هامة في هذا البروتوكول لضمان أن الجليد لديه علامة GFP على الريبوسومات من الخلايا البطانية.وبما أن جميع الخطوات المعزولة RNAi المصبية تعتمد على وجود الريبوسومات الموسومة GFP، فمن الضروري تحديد النمط الجيني قبل بدء التجربة. قبل البدء في عزل الجيش الملكي النيبالي، يجب إكمال عدة خطوات تحضيرية. وتشمل هذه إعداد العازلة وربط الأجسام المضادة لGFP إلى الخرز G دينا البروتين.ويمكن أن تستمر المخازن المؤقتة لمدة تصل إلى شهر واحد عند أربع درجات مئوية، ويمكن أن تستمر الخرزات المقيدة بالأجسام المضادة لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند أربع درجات مئوية. لذا خذ هذه القيود في الاعتبار عند تخطيط تجربتك. استخدام التجانس الولي يحركها هو وسيلة ممتازة لزيادة العائد RNA.تأكد من استخدام إعدادات الترددات المنخفضة والمددّات من أجل تقليل تدهور الحمض النووي الريبي. وكما ذكر آنفا، فإن الإبادة الجماعية هي خطوة أولية هامة في بروتوكول المحاكمة. ضمان أن الفئران التي يتم عزلها RNA باستخدام تقنية TRAP إيجابية لجين TRAP ، على الأقل غير المتغايرة ، ولكن المثلية المثالية لجين TRAP هي خطوة مهمة لأن ضمان أن تكون علامة GFP على الريبوسوم أمر ضروري من أجل سحبها باستخدام رد فعل الأجسام المضادة والخرز المضاد لـ GFP الذي ستكون قد أعدته قبل بدء التجربة.عزل الأنسجة المطلوبة من الفأر ووضعها على الفور في برنامج تلفزيوني بارد الجليد مع 100 ميكروغرام لكل ميلليلتر حل زلكلهيكساميد. وهذا يضمن وقف الترجمة وأن يكون النص تصويراً دقيقاً للماوس قبل القتل الرحيم. استخدام التجانس محرك يحركها لتجانس الأنسجة في تعليق الخلية.توقيت مثالي وضبط التردد يجب أن يتم تحديدها من قبل مختبر الفردية على أساس التجانس محرك معين يحركها سوف تستخدم. يمكن أن يؤدي استخدام إعداد التردد العالي جدًا إلى تدهور الحمض النووي الريبي وتعطيل بقية البروتوكول. تعليق بيليه الخلية داخل العازلة تحلل يجب أن يكون قد أعد قبل بدء التجربة.تأكد من تجانس هذا الخليط من أجل ضمان التجانس الكافي قبل الشروع في بقية البروتوكول. الطرد المركزي المتجانس لمدة 10 دقائق في 2،000 مرات G في جهاز طرد مركزي أربع درجات مئوية. وهذا سوف بيليه النوى والحطام الخلوي الكبير التي قد تتداخل مع تفاعل المناعة المصب.إضافة DHPC و CA-630 الدهون إلى فائقة من خطوة الطرد المركزي السابقة. هذه الدهون سوف تساعد على فصل مراحل البروتين من المكونات الأخرى داخل الخلايا. ضع التعليق على الجليد لمدة خمس دقائق واسمح له بالجلوس.الطرد المركزي لlysate لمدة 10 دقيقة في 13، 000 مرات G إلى بيليه أي مادة قابلة للذوبان. احتفظ بـ 15٪ من الـ 15 من الخطوات المستقبلية. إضافة المضادة للجسم المضاد GFP الخرز ملزمة إلى الخلية lysate supernatant واحتضان الخليط في أربع درجات مئوية مع نهاية على نهاية دوران لمدة 30 دقيقة.هذا هو المكان الذي المضادة للأجسام المضادة لFP سوف تربط الريبوسومات الموسومة GFP، مما يسمح لنا لمزيد من عزل الجيش الملكي النيبالي من هذه الريبوسومات. جمع الخرز على الرف المغناطيسي الخاص بك وغسل الخرز خمس مرات باستخدام الخاص بك عالية الملح غسل بوليسوم العازلة التي سيكون لديك أعدت قبل بدء العزلة. مباشرةً انتقل إلى الخطوة التالية التي سوف تضع الخرز في المخزن المؤقت RLT.الطرد المركزي لlysate لمدة ثلاث دقائق بأقصى سرعة وإزالة بعناية فائقة ونقلها إلى أنبوب جديد microfuge. إضافة حجم واحد من 70٪ الإيثانول إلى lysate مسح ومزيج على الفور عن طريق الأنابيب. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية التي ستنقل فيها ما يصل إلى 700 ميكرولترات من العينة ، بما في ذلك أي عجل قد تكون قد تشكلت ، إلى عمود الدوران الموضوع في أنبوب جمع ميليلتر اثنين.الطرد المركزي لlysate لمدة 15 ثانية في أكبر من 8، 000 مرات G لغسل غشاء العمود تدور. تجاهل التدفق من خلال ثم انتقل إلى الخطوة التالية. إضافة 350 ميكرولتررس من المخزن المؤقت RW1 إلى العمود تدور.جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية في أكبر من 8،000 مرات G لغسل غشاء العمود تدور وتجاهل تدفق من خلال. كرر هذه الخطوة باستخدام آخر 350 ميكرولترات من المخزن المؤقت RW1 قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. إضافة 500 microliters من RPE العازلة إلى العمود تدور.جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية في أكبر من 8،000 مرات G لغسل غشاء العمود تدور. تجاهل تدفق خلال ثم متابعة لتكرار هذه الخطوة عن طريق إضافة 500 ميكرولترات آخر من RPE العازلة إلى العمود تدور. هذه المرة، الطرد المركزي لمدة دقيقتين في أكبر من 8.000 مرات G لغسل غشاء العمود تدور.تجاهل التدفق من خلال ووضع العمود تدور في أنبوب جمع ملليلتر جديدة والمضي قدما إلى جهاز الطرد المركزي في سرعة كاملة لمدة دقيقة واحدة لإزالة أي العازلة المتبقية التي قد تكون موجودة على العمود تدور. تجاهل التدفق من خلال وضع العمود تدور في أنبوب جمع 1.5 ملليلتر جديدة. المضي قدما لإضافة 30 إلى 50 ميكرولترات من المياه الحرة RNase مباشرة إلى غشاء العمود تدور.أجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في أكثر من 8،000 مرات G ل elute الجيش الملكي النيبالي من غشاء العمود تدور. عند هذه النقطة، يتم حل الحمض النووي الريبي الخاص بك في المياه الحرة RNase ويمكن تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة. المضي قدما في تحديد النقاء والتحقق من نقاء الجيش الملكي النيبالي كنت قد عزلت باستخدام مقياس الطيف.كنت تبحث عن ذروة في 260 نانومتر، وهو الحمض النووي، بما في ذلك الجيش الملكي النيبالي، يمتص أقصى حد. يتم تصوير الكمية في الجزء الأيمن السفلي من الصورة في نانوجرام لكل ميكرولتر. يمكن استنتاج الجودة بنسبة 260 230 التي تظهر عنصر واحد فوق الكمية في الجزء الأيمن السفلي من الشاشة.أظهر نهجنا انخفاض عوائد الحمض النووي الريبي، خاصة عندما نطهر مرنا من أنسجة القلب أو من الأنسجة المجمدة سابقا. وبالتالي، نحن بحاجة إلى تهيئة الظروف لزيادة الغلة. ومع ذلك، لاحظنا في EC محددة CD-36 الفئران ناقص، تم زيادة مستوى افيران B2 وDLY 4 بشكل كبير في كل من الرئة والقلب endothelia، بالمقارنة مع السيطرة.وكانت هذه النتائج متسقة مع الدراسات السابقة في المختبر، مما يشير إلى أن نوعية الحمض النووي الريبي كافية لتحليل المصب. كان العائد منخفضًا بسبب الشروط الصارمة في مساحة العمل الخاصة بنا. للتغلب على هذا القيد، من المهم إنشاء منطقة عمل حرة RNase وإزالة التلوث أسطح ومعدات العمل التي قد تحصل على الملوثة مع RNase وتغيير القفازات في كثير من الأحيان من أجل استخراج RNA الجودة وزيادة الغلة.ومن الأهمية بمكان أيضا العثور على تركيزات مناسبة من الأجسام المضادة GFP في مصفوفة تقارب واستخدام تركيزات مناسبة من مثبط RNase في العازلة تحلل الأنسجة واستخدام RNase الحرة بلاستيكية وير والكواشف لاستخراج الحمض النووي الريبي من الريبوسومات البطانية من الأنسجة المستهدفة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

عزل مجمعات RNA والبروتينات وما شابه ذلك من الخلايا عن طريق شطف موجهة قليل النوكليوتيد-

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

تنقية البروتينات السطحية للبروتينات الخلية من<em&gt; ريبيسفالوس ميكروبلوس</em&gt; الخلايا الظهارية الظهارية

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

تنقية خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد الماوس التروية

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-تقارب تنقية مقرونة تسلسل الحمض النووي الريبي في البكتيريا إيجابية الغرام

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

تنقية بروتينات p53 في كل مكان من خلايا الثدييات

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus (Video) | JoVE 

تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...