Name: translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00
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任博士的工作得到了美国心脏协会(13SDG14800019)的支持;BR),安的希望基金会(FP00011709;BR)、美国癌症协会(86-004-26;MCW癌症中心至BR)和国家卫生研究院(HL136423;BR);乔丹·帕尔默得到2018年MCW CTSI 500明星实习计划的支持;P. Moran 得到 NHLBI (5T35 HL072483-34) 的机构研究培训资助。

对于动物实验,这里描述的所有方法都已获得威斯康星医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 制备试剂
<ol><li>制备解液缓冲液,浓度为10 mM HEPES,pH 7.4,150 mM KCl,5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 100 mg/mL 环己酰胺, 蛋白酶抑制剂, 和重组RNase抑制剂的浓度如下所述.<ol>
<li>将以下试剂添加到 500 mL 的无 RNase 脱离子水:1.19 克 HEPES, 5.59 g KCl,0.24g MgCl 2,35毫克DTT,0.5 mL环氧西米,和NaOH根...

<ol>
	<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF/PKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan.">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA/PKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming.">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis.">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond:+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis?.">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?.</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li><li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model.">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA/PKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling.">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish.">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li><li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes.">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li></ol>

血管生成是一个复杂的多步骤过程,其中EC特异性血管原基因转录和表达在EC分化和血管生成重编程3,4中起着至关重要的作用。为了克服细胞多样性和结构复杂性的障碍,以更好地了解哺乳动物血管系统在体内分子水平上的功能,我们创建了EC特异性TRAP小鼠,并配以EC特异性cd36,EC特异性pkd-1缺乏或全球cd36缺乏,使用在Pu实验室2中生成的多功?...

在哺乳动物大脑、心脏和肺等复杂组织中,细胞异质性水平高使从整个组织样本中提取的基因表达数据分析复杂化。为了观察体内特定细胞类型的基因表达图谱,最近开发了一种新方法,允许对任何基因定义的细胞类型的整个翻译的mRNA补充进行查询。这种方法被称为翻译核糖体亲和纯化(TRAP)技术1,2。当与基因操纵动物中其他血管生成相关基因时,它是研究内皮细胞生物学和血管生成的有用工具。
我们已经表明,血管生成PKD-1信号和血管生成基因CD36的转录对内皮细胞(EC)分化和功能血管生成3,4,5,6至关重要。为了确定基因转录和EC转导中血管生成和代谢信号的分子机制,我们根据TRAP技术1创建了具有特定删除血管生成基因的转基因TRAP小鼠。,2.此外,在我们的TRAP动物中,它们不仅在血管内皮瘤或CD36基因的全局缺失中缺乏pkd-1或cd36基因,而且增强的绿色荧光蛋白(EGFP)也基因标记到EC正在翻译核糖体。TRAP允许直接从靶向组织的血管内皮内,对核糖体结合的mRNA进行亲亲化纯化,从而能够分析基因表达和识别与EC分化相关的新转录体,血管生成直接在体内条件。我们已经成功地从这些基因工程动物的内皮内皮体中分离出核糖体结合的RNA。纯化RNA可用于在调节EC分化和功能方面进一步描述血管生成或动脉生成基因。该协议提供了一个分步指南,用于实现TRAP方法,用于直接在体内的EC中分离mRNA。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">G2939AA, 5067-1511 &#38; 5067-1513</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell scrapers</td>
			<td style="width:73px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:123px;">83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">K8855100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Magnet (Dynamag-2)</td>
			<td style="width:73px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">123-21D</td>
			<td>Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">NanoDrop 2000C spectrophotometer</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5430R</td>
			<td>with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Rnase-free 50-mL conical tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 1000-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 200-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 20-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotor for homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Yamato&#160;</td>
			<td style="width:123px;">LT-400D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tube rotator, Labquake brand</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-687-12Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo

许多研究仅限于使用体外细胞测定和整组织,或从动物中分离特定细胞类型,通过qPCR和RNA测序对转录组和基因表达进行体外分析。对复杂组织和器官中特定细胞类型的全面转录和基因表达分析对于了解基因调控的细胞和分子机制及其与组织平衡和器官的关系至关重要功能。本文以动物肺血管内皮内皮直接在体内分离核糖体结合RNA的方法为例。将描述组织处理和RNA纯化的具体材料和程序,包括RNA质量和产量的评估以及动脉生成基因测定的实时qPCR。这种方法,称为翻译核糖体亲和纯化(TRAP)技术,可用于基因表达的表征和转录组分析某些细胞类型直接在体内任何特定类型的复杂组织。

我们先前的研究4,7表明CD36可能作为动脉分化和毛细管动脉化的开关通过LPA/PKD-1信号通路。为了研究LPA/PKD-1-CD36信号轴对体内动脉生成是否至关重要,我们建立了新的TRAP线,不仅具有全球cd36缺乏或内皮特异性cd36或pkd-1缺陷,而且还允许选择性隔离GFP从有克雷标记的细胞谱系中核糖体结合的RNA,作为活化荧光报告器2有用。
<p class="jove_content"...

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Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

我们通过结合RNA纯化结合的增强绿色荧光蛋白(EGFP)的EC特异性遗传标记,直接在小鼠脑、肺和心脏组织中直接从小鼠脑、肺和心脏组织中从血管内皮细胞(EC)中纯化核糖体结合体mRNA的mRNA。.

翻译核糖体亲性纯化(TRAP),用于从体内内皮细胞中分离RNA

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

嗨，我是任斌，我是阿拉巴马大学伯明翰医学院外科和生物医学工程学副教授。我们的实验室对内皮细胞生物学在这些常见的心血管疾病和癌症背景下的血管生成功能感兴趣。我们的研究重点是内皮细胞转位和血管生成表观遗传和转录调控。为了理解血管生成学的转录机制，我们建立了转基因工程小鼠线，其中我们不仅删除了内皮细胞中与血管生成相关的特定基因，而且增强的GP探针将被基因标记在原生内皮细胞的核糖体上。这样，我们可以直接从转基因动物的不同组织器官内皮细胞中分离和纯化相关信使RNA的循环。然后，我们可以使用纯化信使RNA对转录本和转录组进行下游分析。通过RNA测序和实时冷PCR。在这段视频中，我的学生帕特里克·莫兰和乔丹·帕尔默以及研究技术人员尼古拉斯·巴内考和荣元将向您展示一种从转基因动物内皮直接进行基因分型和吸气信使RNA的方法。基因分型是本协议中一个重要的初步结果，以确保冰在内皮细胞的核糖体上具有GP标签。由于所有下游RNAi分离步骤都依赖于GP标记核糖体的存在，因此在开始实验之前确定基因型至关重要。在开始RNA分离之前，必须完成几个准备步骤。这些包括缓冲制剂和结合抗GP抗体的蛋白质G迪纳珠。缓冲液在4摄氏度下可以持续一个月，抗体结合的珠子在4摄氏度下可以持续一周。因此，在计划实验时，要考虑到这些限制。使用摩尔驱动的均质剂是提高RNA产量的极好方法。请务必使用较低的频率设置和持续时间，以减少RNA降解。如前所述，基因分型是试验协议中重要的初步步骤。确保使用 TRAP 技术分离 RNA 的小鼠对 TRAP 基因（至少是异质酶）呈阳性，但 TRAP 基因的理想同源是一个重要的步骤，因为确保 GFP 标签位于核糖体上对于使用抗原抗体反应和在开始实验前准备的抗 GFP 珠子进行向下拉是必不可少的。将所需的组织从小鼠中分离，并立即放入冰冷 PBS 中，每毫升环氧酰胺溶液为 100 微克。这可确保停止翻译，并且转录组在安乐死之前对鼠标进行准确的描述。使用电机驱动的均质器将组织均匀化到细胞悬浮液中。理想的定时和频率设置将由各个实验室根据您将使用的特定电机驱动均质器确定。使用过高的频率设置会导致RNA降解，并破坏协议的其余部分。将细胞颗粒悬浮在实验前应准备好的解液缓冲液中。在继续执行协议的其余部分之前，确保进一步使这种混合物均质，以确保足够的均质化。在4摄氏度的离心机中，以2000倍G离心10分钟。这将颗粒核和大细胞碎片，可能会干扰下游免疫沉淀反应。从先前的离心步骤将DHPC和CA-630脂质添加到上心。这些脂质将有助于将蛋白质相位与其他细胞内成分分离出来。将悬架放在冰上五分钟，让其坐下。将溶糖在13，000倍G下离心10分钟，以对任何可溶性材料进行颗粒化。为将来的步骤保留 15% 的透明 lysate。将抗G进给的抗体结合珠子加入细胞中，解血中上流剂，在4摄氏度下孵育混合物，结束结束旋转30分钟。这是抗G进位抗体结合GP标记的核糖体，使我们能够进一步分离RNA从这些核糖体。收集磁架上的珠子，使用高盐多体洗涤缓冲液洗珠五次，在开始隔离之前，您将准备好这些缓冲液。立即继续执行下一步，您将将珠子放在 RLT 缓冲区中。全速离离液三分钟，小心地取出上一代，并将其转移到新的微模糊管中。将一卷70%乙醇加入清除的利盐中，并立即通过移液混合。立即进入下一步，您将将样品的700微升（包括可能形成的任何沉淀物）转移到放置在两毫升收集管中的旋转柱中。在大于8，000倍G下将裂酸离心15秒，以清洗旋转柱膜。放弃流，然后继续执行下一步。向旋转列添加 350 微升缓冲 RW1。在大于 8，000 倍 G 时离心 15 秒，清洗旋转柱膜并丢弃流经。在继续下一步之前，使用另外 350 微升的缓冲器 RW1 重复此步骤。向旋转列添加 500 微升缓冲 RPE。在大于8000倍G时离心15秒，清洗旋转柱膜。放弃流，然后继续重复此步骤，向旋转列添加另外 500 微升的缓冲区 RPE。这一次，离心机两分钟在大于8.000G时清洗旋转柱膜。丢弃流，将旋转柱放在新的两毫升收集管中，然后以全速进入离心机一分钟，以清除旋转柱上可能存在的任何残余缓冲液。丢弃流，将旋转柱放在新的 1.5 毫升收集管中。继续将30至50微升的RNase无水直接添加到旋转柱膜中。在大于8，000倍G下离心1分钟，从旋转柱膜中分离出RNA。此时，您的RNA溶解在无RNase水中，并可能在零下80摄氏度下储存长达一年。继续使用分光光度计量化和检查您分离的RNA的纯度。你正在寻找一个峰值在260纳米，这是核酸，包括RNA，吸收最大。数量以微升的南图在图像的右下半部分显示。质量可以推断为 260 230 比率，该比率显示的是屏幕右下部数量上方的一项。我们的方法显示RNA产量低，特别是当我们从心脏组织或以前冷冻的组织纯化mRNA时。因此，我们需要对提高产量的条件进行雾化。然而，我们确实在EC特定的CD-36缺陷小鼠中观察到，与对照组相比，Ephrin B2和DLL4水平在肺和心脏内膜都显著增加。这些结果与我们之前的体外研究一致，这表明RNA质量足以进行下游分析。由于我们工作空间的严格条件，产量很低。为了克服这一限制，必须建立一个无 RNase 工作区，并净化可能受到 RNase 污染的工作表面和设备，并经常更换手套，以提取高质量的 RNA 并提高产量。在亲和力基质中找到合适的GGFP抗体浓度，并在组织解解缓冲液中使用适当浓度的RNase抑制剂，并使用无RNase塑料软件和试剂从目标组织的内皮核糖体中提取RNA也至关重要。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

从细胞使用寡核苷酸定向洗脱同源RNA-蛋白质复合物的隔离

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

科研

生物化学

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

从Cryomilled哺乳动物细胞中的蛋白质复合物亲和捕获

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

对于高度纯化RNA的种子定量转录组分析的隔离中使用的有效方法

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

从真核细胞蛋白质复合体串联亲和纯化

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

对酶活性G4 Resolvase1净化用G-四DNA亲和方法

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

生物素化细胞表面蛋白的纯化<emRigicephalus microplus</em&gt;上皮细胞

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

小鼠肝灌注肝细胞和正弦内皮细胞的纯化

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2亲和力纯化与革兰阳性细菌中的RNA测序相结合

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus (Video) | JoVE 

从海蛾中亲和纯化纤维蛋白溶解酶

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...