Name: translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

Het werk van Dr ren wordt ondersteund door de American Heart Association (13SDG14800019; BR), de Stichting van de Ann's Hope (FP00011709; BR), de American Cancer Society (86-004-26; het MCW Cancer Center to BR) en het National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer wordt ondersteund door het 2018 MCW CTSI 500 Stars Internship Program; P. Moran wordt ondersteund door een institutionele onderzoeksopleiding subsidie van NHLBI (5T35 HL072483-34).

Voor dierproeven zijn alle hier beschreven methoden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van het medisch college van Wisconsin.
1. reagentia voorbereiden
<ol><li>Bereid de lysisbuffer voor op concentraties van 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mm dtt, 100 mg/ml Cycloheximide, proteaseremmers en recombinant RNase remmers op concentraties zoals hieronder beschreven.<ol>
<li>Voeg de volgende reagentia toe aan 500 mL RNase vrij gedeïonisee...

<ol>
	<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF/PKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan.">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA/PKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming.">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis.">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond:+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis?.">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?.</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li><li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model.">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA/PKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling.">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish.">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li><li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes.">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li></ol>

Angiogenese is een complex meerstaps proces, waarin EC-specifieke angiogene gentranscriptie en expressie een essentiële rol spelen in EG-differentiatie en angiogene herprogrammering3,4. Om de barrières van de cellulaire diversiteit en architecturale complexiteit te overwinnen voor een beter begrip van de functie van het zoogdier vasculaire systeem op moleculair niveau in vivo, hebben we EC-specifieke VALMUIZEN gecreëerd, vergezeld van EC-specifieke cd36 </...

In complexe weefsels zoals het brein van zoogdieren, hart en longen, compliceren de hoge niveaus van cellulaire heterogeniteit de analyse van genexpressie gegevens afkomstig van hele weefselmonsters. Om genexpressie profielen in een bepaald celtype in vivo te observeren, is recentelijk een nieuwe methodologie ontwikkeld, die het mogelijk maakt de gehele vertaalde mRNA-aanvulling van elk genetisch gedefinieerd celtype te ondervragen. Deze methodologie staat bekend als de vertaling ribosoom affiniteit zuivering (trap) techniek1,2. Het is een nuttig hulpmiddel om endotheel celbiologie en angiogenese te bestuderen in combinatie met het genetisch manipuleren van andere angiogenese-geassocieerde genen bij dieren.
We hebben aangetoond dat angiogene PKD-1-signalering en de transcriptie van angiogene Gene CD36 essentieel zijn voor de differentiatie van endotheliale cellen (EC) en functionele angiogenese3,4,5,6. Om moleculaire mechanismen van angiogene en metabole signalering in gentranscriptie en EG-trans differentiatie te bepalen, hebben we genetisch gemanipuleerde VALMUIZEN gemaakt met specifiek verwijderde angiogene genen op basis van TRAP techniek1 , 2. Bovendien hebben ze in onze valdieren niet alleen PKD-1 of cd36 gen- deficiëntie in de vasculaire endothelia of globale deletie van cd36 gen, maar een versterkt groen fluorescentie proteïne (EGFP) is ook genetisch gelabeld op De door de EG te vertalen ribosomes. TRAP maakt affiniteits zuivering van ribosome-gebonden mRNA rechtstreeks uit de vasculaire endothelia van gerichte weefsels, waardoor de analyse van genexpressie en identificatie van nieuwe transcriptomes die geassocieerd zijn met EG-differentiatie en angiogenese direct onder in vivo condities. We hebben met succes geïsoleerd ribosome-gebonden RNA van de endothelia in deze genetisch gemanipuleerde dieren. Het gezuiverde RNA kan worden gebruikt voor verdere karakterisering van angiogene of arteriogene genen in de regulatie van EG-differentiatie en-functies. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het implementeren van de TRAP-aanpak voor de isolatie van mRNA in ECs rechtstreeks in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">G2939AA, 5067-1511 &#38; 5067-1513</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell scrapers</td>
			<td style="width:73px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:123px;">83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">K8855100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Magnet (Dynamag-2)</td>
			<td style="width:73px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">123-21D</td>
			<td>Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">NanoDrop 2000C spectrophotometer</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5430R</td>
			<td>with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Rnase-free 50-mL conical tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 1000-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 200-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 20-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotor for homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Yamato&#160;</td>
			<td style="width:123px;">LT-400D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tube rotator, Labquake brand</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-687-12Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo

Veel studies zijn beperkt tot het gebruik van in vitro cellulaire testen en hele weefsels of isoleren van specifieke celtypen van dieren voor in vitro analyse van transcriptome en genexpressie door qPCR en RNA-sequencing. Uitgebreide transcriptome en genexpressie analyse van specifieke celtypen in complexe weefsels en organen zal van cruciaal belang zijn voor het begrijpen van cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee genen gereguleerd worden en hun associatie met weefselhomeostase en orgaan Functies. In dit artikel, we demonstreren de methodologie voor isolatie van ribosome-gebonden RNA direct in vivo in de vasculaire endothelia van dierlijke longen als voorbeeld. De specifieke materialen en procedures voor weefsel verwerking en RNA-zuivering zullen worden beschreven, met inbegrip van de beoordeling van RNA-kwaliteit en opbrengst, evenals real-time qPCR voor arteriogenic gen-assays. Deze aanpak, bekend als het vertalen van ribosoom affiniteit zuivering (trap) techniek, kan worden gebruikt voor de karakterisering van genexpressie en transcriptome analyse van bepaalde celtypen rechtstreeks in vivo in een specifiek type in complexe weefsels.

Onze eerdere studies4,7 suggereren dat CD36 kan fungeren als een switch voor arteriolaire differentiatie en capillaire arterialisatie via de LPA/PKD-1 signalering traject. Om te bestuderen of de LPA/PKD-1-CD36-signalerings as essentieel is voor arteriogenese in vivo, hebben we de nieuwe TRAP lijnen vastgesteld die niet alleen een globale CD36-deficiëntie of endotheelspecifieke-CD36-of PKD-1-deficiëntie hebben, maar ook selectieve isolatie mogelijk maken van rib...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We presenteren een aanpak om ribosome-gebonden mRNA van vasculaire endotheliale cellen (ECs) direct in muizenhersenen, Long-en hart weefsels te zuiveren via EC-specifieke genetische code van Enhanced Green fluorescentie proteïne (EGFP) in ribosomen in combinatie met RNA-zuivering .

Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Hallo, ik ben Bin Ren, ik ben universitair hoofddocent chirurgie en biomedische techniek aan de Universiteit van Alabama de Birmingham School of Medicine. Ons laboratorium is geïnteresseerd in endotheelcelbiologie functie angiogenese acuogenese in de context van deze veel voorkomende hart-en vaatziekten en kankers. Een van onze onderzoeken richt zich op epigenetische en transcriptieregulatie van endotheelceltransdifferentiatie en angiogenese.Om de transcriptiemechanismen van angiogenese te begrijpen, hebben we transgene gemanipuleerde muislijnen vastgesteld, waarin we niet alleen een specifieke genen hebben verwijderd die geassocieerd zijn met angiogenese in de endotheelcellen, maar een verbeterde GFP-sonde zal genetisch worden getagd op een ribosoom van inheemse endotheelcellen. Op deze manier kunnen we lussen van geassocieerd boodschapperRNA isoleren en zuiveren uit endotheelcellen in verschillende weefselorganen direct bij transgene dieren. We kunnen dan gebruik maken van de gezuiverde messenger RNA voor downstream-analyse van transcripties en de transcriptome.Door RNA sequencing en de real-time chill PCR. In deze video, mijn studenten Patrick Moran en Jordan Palmer en de onderzoekers Nicholas Barnekow en Rong Yuan zal u een aanpak genotyping transgene muizen en de aspirating messenger RNA rechtstreeks van de endotheel in de transgene dieren. Genotypering is een belangrijke voorlopige in dit protocol om ervoor te zorgen dat het ijs de GFP-tag op de ribosomen van endotheelcellen heeft.Aangezien alle downstream RNAi isolatiestappen afhankelijk zijn van de aanwezigheid van GFP-gelabelde ribosomen, is het essentieel om het genotype te bepalen voordat het experiment begint. Voordat met de RNA-isolatie wordt begonnen, moeten verschillende voorbereidende stappen worden voltooid. Deze omvatten bufferpreparaatatie en het binden van het anti-GFP-antilichaam aan het eiwit G dina kralen.De buffers kunnen duren tot een maand bij vier graden Celsius en de antilichaam-gebonden kralen kunnen duren tot een week op vier graden Celsius. Houd dus rekening met deze beperkingen bij het schaven van uw experiment. Het gebruik van een molaire gedreven homogenisator is een uitstekende manier om de RNA-opbrengst te verhogen.Zorg ervoor dat u lagere frequentie-instellingen en -duur gebruikt om de afbraak van RNA te verminderen. Zoals eerder vermeld, is genotyping een belangrijke eerste stap in het proefprotocol. Ervoor te zorgen dat muizen waarvan het RNA moet worden geïsoleerd met behulp van de TRAP-techniek positief zijn voor het TRAP-gen, althans heterozygooten, maar idealiter homozygoot voor het TRAP-gen is een belangrijke stap, omdat ervoor te zorgen dat de GFP-tag op het ribosoom is, essentieel is om naar beneden te trekken met behulp van de antigeenantilichaamreactie en de anti-GFP-kralen die u vóór het begin van het experiment hebt voorbereid.Isoleer de gewenste weefsels van de muis en plaats deze onmiddellijk in een ijskoude PBS met 100 microgram per milliliter cyclohexamideoplossing. Dit zorgt ervoor dat de vertaling wordt gestopt en dat het transcriptoom een nauwkeurige weergave van de muis zal zijn voorafgaand aan de euthanasie. Gebruik een motoraangedreven homogenisator om het weefsel te homogeniseren in een celsuspensie.Ideale timing en frequentie-instellingen zullen moeten worden bepaald door het individuele lab op basis van de specifieke motor aangedreven homogenizer die u zult gebruiken. Het gebruik van een te hoge frequentie-instelling kan leiden tot RNA-afbraak en de rest van het protocol verstoren. Hang de celpellet op in de lysebuffer die u voor het begin van het experiment had moeten voorbereiden.Zorg ervoor dat u dit mengsel verder homogeniseert om een adequate homogenisatie te garanderen voordat u verder gaat met de rest van het protocol. Centrifugeer het homogenaat gedurende 10 minuten bij 2.000 keer G in een centrifuge van vier graden Celsius. Dit zal pellet de kernen en grote cellulaire puin die kunnen interfereren met de downstream immunoprecipitatie reactie.Voeg DHPC en CA-630 lipiden toe aan de supernatant van de voorafgaande centrifugalisatiestap. Deze lipiden zullen helpen scheiden van de eiwitfasen uit de andere intracellulaire componenten. Plaats de suspensie vijf minuten op ijs en laat hem zitten.Centrifugeer het lysaat gedurende 10 minuten bij 13.000 keer G om oplosbaar materiaal te pelleteren. Houd 15% van de duidelijke lysate voor toekomstige stappen. Voeg de anti-GFP-antilichaamgebonden kralen toe aan het cellysaat supernatant en broed het mengsel op vier graden Celsius met end over end rotatie gedurende 30 minuten.Dit is waar de anti-GFP antilichamen de GFP gelabelde ribosomen zullen binden, waardoor we het RNA verder kunnen isoleren van deze ribosomen. Verzamel de kralen op je magnetische rek en was de kralen vijf keer met behulp van uw hoge zout polysome wassen buffer die u zal hebben voorbereid voorafgaand aan het begin van de isolatie. Ga onmiddellijk naar de volgende stap waarin u de kralen in de RLT-buffer plaatst.Centrifugeer het lysaat gedurende drie minuten op volle snelheid en verwijder voorzichtig de supernatant en breng het naar een nieuwe microfugebuis. Voeg een volume van 70% ethanol toe aan het gerooide lysaat en meng onmiddellijk door pipetting. Ga onmiddellijk naar de volgende stap waarin u tot 700 microliter van het monster, inclusief eventuele neerslag die zich heeft gevormd, overzet naar een spinkolom die in een twee milliliter opvangbuis is geplaatst.Centrifugeer het lysaat gedurende 15 seconden bij meer dan 8.000 keer G om het spinkolommembraan te wassen. Gooi de stroom door en ga naar de volgende stap. Voeg 350 microliters buffer RW1 toe aan de draaikolom.Centrifuge gedurende 15 seconden bij meer dan 8.000 keer G om het spinkolommembraan te wassen en de stroom erdoor weg te gooien. Herhaal deze stap met behulp van nog eens 350 microliters van buffer RW1 voordat u doorgaat naar de volgende stap. Voeg 500 microliters buffer RPE toe aan de spinkolom.Centrifuge gedurende 15 seconden bij meer dan 8.000 keer G om het spinkolommembraan te wassen. Gooi de stroom door en ga verder om deze stap te herhalen door nog eens 500 microliters buffer RPE toe te voegen aan de spinkolom. Deze keer, centrifuge gedurende twee minuten op meer dan 8.000 keer G om de spin kolom membraan te wassen.Gooi de stroom door en plaats de spin kolom in een nieuwe twee milliliter collectie buis en ga naar centrifuge op volle snelheid voor een minuut om eventuele resterende buffer die aanwezig kan zijn op de spin kolom te verwijderen. Gooi de stroom door en plaats de spinkolom in een nieuwe 1,5 milliliter opvangbuis. Ga verder met het toevoegen van 30 tot 50 microliter RNase vrij water rechtstreeks aan de spin kolom membraan.Centrifugeren gedurende een minuut op meer dan 8.000 keer G om het RNA uit het spinkolommembraan te halen. Op dit punt wordt uw RNA opgelost in RNase vrij water en kan worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius voor maximaal een jaar. Ga verder met het kwantificeren en controleren van de zuiverheid van het RNA dat u hebt geïsoleerd met behulp van een spectrofotometer.U bent op zoek naar een piek op 260 nanometer, dat is nucleïnezuur, inclusief RNA, absorbeert maximaal. De hoeveelheid wordt in het rechterondergedeelte van het beeld weergegeven in nanogrammen per microliter. Kwaliteit kan worden afgeleid door de 260 230 verhouding die wordt weergegeven een item boven de hoeveelheid in de rechterbenedenpost gedeelte van het scherm.Onze aanpak toonde lage RNA-opbrengsten, vooral wanneer we mRNA gezuiverd uit de hartweefsels of uit eerder bevroren weefsels. We moeten dus de voorwaarden om de opbrengsten te verhogen, aanstoomen. We hebben echter in EG-specifieke CD-36-tekorten muizen waargenomen, het niveau van ephrin B2 en DLL4 werden aanzienlijk verhoogd in zowel long- als hart-endothelia, in vergelijking met de controle.Deze resultaten kwamen overeen met onze vorige in vitro studies, wat suggereert dat de RNA-kwaliteit voldoende is voor downstream-analyse. De opbrengst was laag door de strenge voorwaarden in onze werkruimte. Om deze beperking te overwinnen, is het van cruciaal belang om een RNase-vrije werkzone op te zetten en werkoppervlakken en apparatuur te ontsmetten die besmet kunnen raken met RNase en regelmatig van handschoen kunnen wisselen om RNA van hoge kwaliteit te extraheren en de opbrengsten te verhogen.Het is ook van cruciaal belang om geschikte concentraties GFP-antilichamen in de affiniteitsmatrix te vinden en geschikte concentraties RNase-remmer in de weefsellysebuffer te gebruiken en RNase-vrije plastic waren en reagentia te gebruiken voor RNA-extractie uit endotheelribbelosomen van de beoogde weefsels.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Zuivering van Biotinylated Cell Surface Proteins uit<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitheliale darmcellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus (Video) | JoVE 

Affiniteitszuivering van een fibrinolytisch enzym van Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...