Name: translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

Dr. Rens Arbeit wird von der American Heart Association (13SDG14800019; BR), der Ann es Hope Foundation (FP00011709; BR), die American Cancer Society (86-004-26; das MCW Cancer Center to BR) und das National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer wird vom MCW CTSI 500 Stars Internship Program 2018 unterstützt; P. Moran wird von einem Institutional Research Training Grant von NHLBI (5T35 HL072483-34) unterstützt.

Für Tierversuche wurden alle hier beschriebenen Methoden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Medical College of Wisconsin genehmigt.
1. Reagenzien vorbereiten
<ol><li>Bereiten Sie Lysepuffer auf Konzentrationen von 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mg/ml Cycloheximid, Proteaseinhibitoren und rekombinanten RNase-Inhibitoren auf Konzentrationen wie unten beschrieben vor.<ol>
<li>Folgende Reagenzien zu 500 ml RNase-freiem deionisiertem Wass...

<ol>
	<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF/PKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan.">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA/PKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming.">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis.">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond:+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis?.">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?.</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li><li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model.">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA/PKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling.">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish.">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li><li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes.">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li></ol>

Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, bei dem DIE EC-spezifische angiogene Gentranskription und -expression eine wesentliche Rolle bei der EG-Differenzierung und angiogenen Reprogrammierung3,4spielen. Um die Barrieren aus der zellulären Vielfalt und architektonischen Komplexität zu überwinden, um die Funktion des Säugetiergefäßsystems auf molekularer Ebene in vivo besser zu verstehen, haben wir EC-spezifische TRAP-Mäuse geschaffen, beglei...

In komplexen Geweben wie Gehirn, Herz und Lunge erschweren die hohen Zellheterogenitätdien die Analyse von Genexpressionsdaten aus ganzen Gewebeproben. Um Genexpressionsprofile in einem bestimmten Zelltyp in vivo zu beobachten, wurde kürzlich eine neue Methodik entwickelt, die die Abfrage der gesamten übersetzten mRNA-Ergänzung eines genetisch definierten Zelltyps ermöglicht. Diese Methode wird als die übersetzende Ribosome Affinitätsreinigung (TRAP) Technik1,2bekannt. Es ist ein nützliches Werkzeug, um Endothelzellbiologie und Angiogenese in Kombination mit genetisch manipulierender anderer Angiogenese-assoziierter Gene bei Tieren zu untersuchen.
Wir haben gezeigt, dass angiogene PKD-1-Signalisierung und die Transkription des angiogenen Gens CD36 für die Endothelzelldifferenzierung (EC) und funktionelle Angiogenese3,4,5,6entscheidend sind. Um molekulare Mechanismen der angiogenen und metabolischen Signalisierung in der Gentranskription und der EG-Transdifferenzierung zu bestimmen, haben wir gentechnisch veränderte TRAP-Mäuse mit speziell gelöschten angiogenen Genen auf der Grundlage der TRAP-Technik1 erstellt. , 2. Darüber hinaus haben sie bei unseren TRAP-Tieren nicht nur pkd-1- oder cd36-Genmangel in der vaskulären Endothelie oder die globale Deletion des cd36-Gens, sondern ein verbessertes grünes Fluoreszenzprotein (EGFP) ist auch genetisch auf Die übersetzenden Ribosomen der EG. TRAP ermöglicht die Affinitätsreinigung von ribosomgebundener mRNA direkt aus der vaskulären Endothelie von Zielgeweben, was die Analyse der Genexpression und die Identifizierung neuer Transkriptome ermöglicht, die mit der EG-Differenzierung und Angiogenese direkt unter in vivo-Bedingungen. Wir haben bei diesen gentechnisch veränderten Tieren erfolgreich ribosomgebundene RNA aus der Endothelie isoliert. Die gereinigte RNA kann zur weiteren Charakterisierung angiogener oder arteriogener Gene bei der Regulation von EG-Differenzierung und -Funktionen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Implementierung des TRAP-Ansatzes zur Isolierung von mRNA in ECs direkt in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">G2939AA, 5067-1511 &#38; 5067-1513</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell scrapers</td>
			<td style="width:73px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:123px;">83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">K8855100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Magnet (Dynamag-2)</td>
			<td style="width:73px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">123-21D</td>
			<td>Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">NanoDrop 2000C spectrophotometer</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5430R</td>
			<td>with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Rnase-free 50-mL conical tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 1000-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 200-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 20-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotor for homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Yamato&#160;</td>
			<td style="width:123px;">LT-400D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tube rotator, Labquake brand</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-687-12Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo

Viele Studien beschränkten sich auf die Verwendung von in vitro zellulären Assays und ganzen Geweben oder die Isolierung bestimmter Zelltypen von Tieren zur In-vitro-Analyse von Transkriptom und Genexpression durch qPCR- und RNA-Sequenzierung. Umfassende Transkriptom- und Genexpressionsanalyse spezifischer Zelltypen in komplexen Geweben und Organen wird entscheidend sein, um zelluläre und molekulare Mechanismen zu verstehen, durch die Gene reguliert werden, und ihre Assoziation mit Gewebehomöostase und Organ Funktionen. In diesem Artikel zeigen wir als Beispiel die Methodik zur Isolierung ribosomgebundener RNA direkt in vivo in der vaskulären Endothelie der Tierlunge. Die spezifischen Materialien und Verfahren für die Gewebeverarbeitung und RNA-Reinigung werden beschrieben, einschließlich der Bewertung der RNA-Qualität und -Ausbeute sowie der Echtzeit-qPCR für arteriogene Gen-Assays. Dieser Ansatz, der als Übersetzung der Ribosomen-Affinitätsreinigung (TRAP)-Technik bekannt ist, kann zur Charakterisierung der Genexpression und Transkriptomanalyse bestimmter Zelltypen direkt in vivo in jedem spezifischen Typ in komplexen Geweben verwendet werden.

Unsere früheren Studien4,7 deuten darauf hin, dass CD36 als Schalter für arteriolar Differenzierung und Kapillararterienarterienbildung über den LPA/PKD-1 Signalweg fungieren kann. Um zu untersuchen, ob die Signalachse LPA/PKD-1-CD36 für die Arteriogenese in vivo wesentlich ist, haben wir die neuartigen TRAP-Linien etabliert, die nicht nur einen globalen cd36-Mangel oder einen endothelialen-spezifischen-cd36- oder pkd-1-Mangel haben, sondern auch eine selekti...

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Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Wir präsentieren einen Ansatz zur Reinigung ribossomengebundener mRNA aus vaskulären Endothelzellen (ECs) direkt im Gehirn, der Lunge und im Herzgewebe der Maus über das EC-spezifische genetische Tag des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (EGFP) in Ribosomen in Kombination mit RNA-Reinigung .

Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Hallo, ich bin Bin Ren, ich bin ein außerordentlicher Professor für Chirurgie und biomedizinische Technik an der University of Alabama der Birmingham School of Medicine. Unser Labor interessiert sich für Endothelzellbiologie Funktion Angiogenese Akuogenese im Zusammenhang mit diesen häufigen Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebserkrankungen. Einer unserer Forschungsschwerpunkte ist die epigenetische und Transkriptionsregulation der Endothelzelltransdifferenzierung und Angiogenese.Um die Transkriptionsmechanismen der Angiogenese zu verstehen, haben wir transgene, konstruierte Mauslinien etabliert, in denen wir nicht nur ein bestimmtes Gen gelöscht haben, das mit der Angiogenese in den Endothelzellen assoziiert ist, sondern eine verbesserte GFP-Sonde genetisch auf ein Ribosom einheimischer Endothelzellen markiert wird. Auf diese Weise können wir Schleifen der zugehörigen Boten-RNA aus Endothelzellen in verschiedenen Gewebeorganen direkt bei transgenen Tieren isolieren und reinigen. Wir können dann die gereinigte Boten-RNA für die nachgelagerte Analyse von Transkripten und dem Transkriptom verwenden.Durch RNA-Sequenzierung und die Echtzeit-Chill PCR. In diesem Video zeigen Ihnen meine Studenten Patrick Moran und Jordan Palmer sowie die Forschungstechniker Nicholas Barnekow und Rong Yuan einen Ansatz, der transgene Mäuse und die ansaugende Boten-RNA direkt aus dem Endothel bei den transgenen Tieren genotypisiert. Genotypisierung ist eine wichtige Vorstufe in diesem Protokoll, um sicherzustellen, dass das Eis das GFP-Tag auf den Ribosomen von Endothelzellen hat.Da alle nachgeschalteten RNAi-Isolationsschritte auf dem Vorhandensein von GFP-markierten Ribosomen beruhen, ist es wichtig, den Genotyp vor Beginn des Experiments zu bestimmen. Vor Beginn der RNA-Isolierung müssen mehrere vorbereitende Schritte abgeschlossen werden. Dazu gehören die Puffervorbereitung und die Bindung des Anti-GFP-Antikörpers an das Protein G dina Perlen.Die Puffer können bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius und die antikörpergebundenen Perlen bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius halten. Berücksichtigen Sie also diese Einschränkungen bei der Planung Ihres Experiments. Die Verwendung eines molaren getriebenen Homogenisators ist eine hervorragende Möglichkeit, die RNA-Ausbeute zu erhöhen.Achten Sie darauf, niedrigere Frequenzeinstellungen und -dauern zu verwenden, um den RNA-Abbau zu reduzieren. Wie bereits erwähnt, ist die Genotypisierung ein wichtiger Vorschritt im Versuchsprotokoll. Die Sicherstellung, dass Mäuse, deren RNA mit der TRAP-Technik isoliert werden soll, positiv für das TRAP-Gen sind, zumindest Heterozygoten, aber idealerweise homozygot für das TRAP-Gen ist ein wichtiger Schritt, denn sicherzustellen, dass das GFP-Tag auf dem Ribosom ist, ist wichtig, um mit der Antigen-Antikörper-Reaktion und den Anti-GFP-Perlen, die Sie vor Beginn des Experiments vorbereitet haben, nach unten zu ziehen.Isolieren Sie das gewünschte Gewebe von der Maus und legen Sie es sofort in eine eiskalte PBS mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Cyclohexamid-Lösung. Dadurch wird sichergestellt, dass die Übersetzung gestoppt wird und dass das Transkriptom eine genaue Darstellung der Maus vor der Euthanasie ist. Verwenden Sie einen motorgetriebenen Homogenisator, um das Gewebe in eine Zellsuspension zu homogenisieren.Ideale Timing- und Frequenzeinstellungen müssen vom einzelnen Labor anhand des jeweiligen motorgetriebenen Homogenisators bestimmt werden, den Sie verwenden werden. Die Verwendung einer zu hohen Frequenzeinstellung kann zu einem RNA-Abbau führen und den Rest des Protokolls stören. Setzen Sie das Zellpellet innerhalb des Lysepuffers aus, den Sie vor Beginn des Experiments vorbereitet haben sollten.Achten Sie darauf, diese Mischung weiter zu homogenisieren, um eine angemessene Homogenisierung zu gewährleisten, bevor Sie mit dem Rest des Protokolls fortfahren. Zentrifugieren Sie das Homogenat für 10 Minuten bei 2 000 mal G in einer Vier-Grad-Celsius-Zentrifuge. Dadurch werden die Kerne und die großen zellulären Trümmer, die die nachgeschaltete Immunpräzipitationsreaktion stören können, pellet.Fügen Sie dem Überstand aus dem vorherigen Zentrifugalisierungsschritt DHPC- und CA-630-Lipide hinzu. Diese Lipide werden helfen, die Proteinphasen von den anderen intrazellulären Komponenten zu trennen. Legen Sie die Suspension für fünf Minuten auf Eis und lassen Sie sie sitzen.Zentrifugieren Sie das Lysat 10 Minuten lang bei 13.000 mal G, um lösliches Material zu pelleten. Halten Sie 15% des klaren Lysats für zukünftige Schritte. Fügen Sie die Anti-GFP-Antikörper gebundenen Perlen zum Zelllysat-Überstand hinzu und inkubieren Sie die Mischung bei vier Grad Celsius mit End-over-End-Rotation für 30 Minuten.Hier binden die Anti-GFP-Antikörper die GFP-markierten Ribosomen, so dass wir die RNA weiter von diesen Ribosomen isolieren können. Sammeln Sie die Perlen auf Ihrem magnetischen Rack und waschen Sie die Perlen fünfmal mit Ihrem hochsalzigen Polysomen-Waschpuffer, den Sie vor Beginn der Isolierung vorbereitet haben. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, in dem Sie die Perlen im RLT-Puffer platzieren.Zentrifugieren Sie das Lysat drei Minuten lang mit voller Geschwindigkeit und entfernen Sie den Überstand vorsichtig und übertragen Sie ihn in ein neues Mikrofugenrohr. Fügen Sie dem geclearten Lysat ein Volumen von 70% Ethanol hinzu und mischen Sie es sofort durch Pipettieren. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, in dem Sie bis zu 700 Mikroliter der Probe, einschließlich aller möglicherweise gebildeten Fällungen, in eine Spin-Säule übertragen, die in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr platziert ist.Zentrifugieren Sie das Lysat 15 Sekunden lang bei mehr als 8 000 mal G, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Verwerfen Sie den Durchfluss, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Fügen Sie der Spinspalte 350 Mikroliter Puffer RW1 hinzu.Zentrifuge für 15 Sekunden bei mehr als 8.000 mal G, um die Spinsäulenmembran zu waschen und den Durchfluss durchzuwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit weiteren 350 MikroliterPuffer RW1, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fügen Sie der Spinspalte 500 Mikroliter Puffer-RPE hinzu.Zentrifuge für 15 Sekunden bei mehr als 8.000 mal G, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Verwerfen Sie den Durchfluss, und wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie der Spinspalte weitere 500 Mikroliter Puffer-RPE hinzufügen. Diesmal zentrifugieren Sie zwei Minuten bei mehr als 8.000 mal G, um die Spinsäulenmembran zu waschen.Entsorgen Sie den Durchfluss und legen Sie die Spin-Säule in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelrohr, und fahren Sie mit voller Geschwindigkeit eine Minute lang zur Zentrifuge, um den Restpuffer zu entfernen, der möglicherweise auf der Spinspalte vorhanden ist. Entsorgen Sie den Durchfluss und platzieren Sie die Spin-Säule in einem neuen 1,5-Milliliter-Sammelrohr. Fahren Sie fort, 30 bis 50 Mikroliter RNase freies Wasser direkt in die Spinsäulenmembran zu geben.Zentrifugieren Sie für eine Minute bei mehr als 8 000 mal G, um die RNA aus der Spin-Säulenmembran zu löschen. An diesem Punkt wird Ihre RNA in RNase-freiem Wasser aufgelöst und kann bis zu einem Jahr bei minus 80 Grad Celsius gespeichert werden. Fahren Sie fort, die Reinheit der RNA, die Sie isoliert haben, mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren und zu überprüfen.Sie suchen einen Peak bei 260 Nanometern, der Nukleinsäure, einschließlich RNA, maximal absorbiert. Die Menge wird im unteren rechten Teil des Bildes in Nanogramm pro Mikroliter dargestellt. Die Qualität lässt sich durch das Verhältnis 260 230 ableiten, das einen Artikel über der Menge im unteren rechten Teil des Bildschirms zeigt.Unser Ansatz zeigte niedrige RNA-Ausbeute, besonders wenn wir mRNA aus dem Herzgewebe oder aus zuvor gefrorenen Geweben gereinigt haben. Wir müssen also die Bedingungen nutzen, um die Erträge zu steigern. Bei EG-spezifischen CD-36-Mäusen beobachteten wir jedoch, dass der Ephrin-B2- und DLL4-Spiegel sowohl bei der Lungen- als auch bei der Herzendothelie im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht war.Diese Ergebnisse stimmten mit unseren früheren In-vitro-Studien überein, was darauf hindeutet, dass die RNA-Qualität für nachgelagerte Analysen ausreicht. Die Ausbeute war aufgrund der strengen Bedingungen in unserem Arbeitsbereich gering. Um diese Einschränkung zu überwinden, ist es wichtig, eine RNase freie Arbeitszone einzurichten und Arbeitsflächen und Geräte zu dekontaminieren, die mit RNase kontaminiert werden können, und Handschuhe häufig zu wechseln, um hochwertige RNA zu extrahieren und die Erträge zu erhöhen.Es ist auch wichtig, geeignete Konzentrationen von GFP-Antikörpern in der Affinitätsmatrix zu finden und geeignete Konzentrationen von RNase-Inhibitoren im Gewebelysepuffer zu verwenden und RNase-freie Kunststoffware und Reagenzien für die RNA-Extraktion aus endotheliaalen Ribosomen des Zielgewebes zu verwenden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epithel-Darmzellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus (Video) | JoVE 

Affinitätsreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...