Name: translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

עבודתו של ד ר רן נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקני (13SDG14800019; BR), קרן התקווה של אן (FP00011709; BR), האגודה האמריקנית לסרטן (86-004-26; מרכז הסרטן MCW ל BR), ואת המכון הלאומי לבריאות (HL136423; BR); ירדן פאלמר נתמך על ידי 2018 MCW CTSI 500 תוכנית ההתמחות כוכבים; פ. מורן נתמך על ידי מענק להכשרת מחקר מוסדיים מ-NHLBI (5T35 HL072483-34).

עבור ניסויים בבעלי חיים, כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש במכללה הרפואית של ויסקונסין.
1. הכן ריאגנטים
<ol><li>הכנת מאגר לפירוק לריכוזים של 10 מ"מ HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 מ"מ MgCl2, 0.5 מ"מ dtt, 100 Mg/mL cycloheximide מעכבי פרוטאז, ו רקומביננטי RNase מעכבי ל...

<ol>
	<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF/PKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan.">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA/PKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming.">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis.">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond:+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis?.">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?.</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li><li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model.">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA/PKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling.">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish.">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li><li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes.">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li></ol>

אנגיוגנזה הוא תהליך רב-שלבים מורכב, בו תמלול וביטוי של גנים בעלי מפרט EC-אנגיוגנטי ממלאים תפקיד חיוני ב-EC בידול ו-אנגיוגנטי מתכנות3,4. כדי להתגבר על המחסומים מן הגיוון הסלולר והמורכבות האדריכלית להבנת טוב יותר את התפקוד של מערכת כלי הדם של היונקים ברמה המולקו?...

ברקמות מורכבות כגון מוח היונקים, הלב והריאות, הרמות הגבוהות של טרוגניות הסלולר מסבכים את הניתוח של נתוני ביטוי הגנים הנגזרים מדגימות שלמות של רקמות. כדי להתבונן בפרופילי גנים ביטוי סוג תא מסוים ב vivo, מתודולוגיה חדשה פותחה לאחרונה, אשר מאפשר את החקירה של משלים mRNA המתורגם כולו של כל סוג תא מוגדר גנטית. מתודולוגיה זו ידועה בתור הריבוקכמה הזיקה לטיהור (מלכודת) בטכניקה1,2. זהו כלי שימושי לחקור ביולוגיה של תא אנדותל ואנגיוגנזה כאשר משולבים עם גנטית מניפולציה של גנים אחרים הקשורים לאנגיוגנזה בבעלי חיים.
הצגנו את העובדה ש-אנגיוגנטי pkd-1 מאותת ותמלול הCD36 של גנים מבוססי-אנגיוגנטית הם קריטיים עבור תא אנדותל (EC) בידול ואנגיוגנזה פונקציונלי3,4,5,6. כדי לקבוע מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנטי ו איתות מטבולית בתמלול הגנים ובידול EC, יצרנו מהונדסים גנטית עכברים מלכודת עם גנים שנמחקו במיוחד אנגיוגנטי על בסיס של טכניקה מלכודת1 , 2. יתר על כן, בחיות המלכודת שלנו, לא רק שיש להם pkd-1 או cd36 gene חוסר בכלי הדם אנדותאליה או מחיקה גלובלית של cd36 gene, אבל חלבון משופר ירוק פלואורסצנטית (egfp) הוא גם מתויג גנטית על . EC מתרגם ריבוזומים המלכודת מאפשרת טיהור של אהדה של הריבוכמה מאוגד-mRNA ישירות מתוך כלי הדם של רקמות ממוקדות, המאפשר ניתוח של ביטוי גנים זיהוי של הטרנססקריפט החדש הקשורים בידול EC ו אנגיוגנזה ישירות תחת התנאים vivo. בנינו בהצלחה RNA ריבוכמה מאוגד מתוך אנדותליה בבעלי חיים אלה מהונדסים גנטית. ה-RNA הטהור יכול לשמש לאפיון נוסף של גנים של אנגיוגנטי או הריוגניים בוויסות הבידול והפונקציות של EC. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי ליישם את גישת המלכודת לבידוד של mRNA ב-ECs ישירות ב-vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">G2939AA, 5067-1511 &#38; 5067-1513</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell scrapers</td>
			<td style="width:73px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:123px;">83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">K8855100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Magnet (Dynamag-2)</td>
			<td style="width:73px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">123-21D</td>
			<td>Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">NanoDrop 2000C spectrophotometer</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5430R</td>
			<td>with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Rnase-free 50-mL conical tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 1000-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 200-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 20-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotor for homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Yamato&#160;</td>
			<td style="width:123px;">LT-400D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tube rotator, Labquake brand</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-687-12Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo

מחקרים רבים הוגבלה להשתמש באספלי הסלולר מבחנה ורקמות שלמות או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מבעלי חיים עבור ניתוח מבחנה של טרנס וביטוי גנטי על ידי qPCR ו-RNA רצפי. ביטוי מקיף לניתוח והבעה גנים של סוגי תאים ספציפיים ברקמות מורכבות ואיברים יהיה קריטי להבין מנגנונים סלולריים ומולקולריים שבהם גנים מוסדרים והקשר שלהם עם הומאוסטזיס רקמות ואיבר פונקציות. במאמר זה, אנו מדגימים את המתודולוגיה עבור בידוד של הריבוכמה-RNA מאוגד ישירות בvivo ב אנדותאליה כלי הדם של הריאות בעלי חיים כדוגמה. החומרים וההליכים הספציפיים לעיבוד רקמות ו-RNA טיהור יהיה מתואר, כולל הערכה של איכות RNA ותשואה כמו גם qPCR בזמן אמת עבור גן העורקים העורקי. גישה זו, המכונה תרגום ריבוכמה אהדה (מלכודת) הטכניקה, יכול להיות מנוצל לאפיון של ביטוי גנים וניתוח הטרנססקריפט של סוגי תאים מסוימים ישירות בvivo בכל סוג ספציפי ברקמות מורכבות.

המחקרים הקודמים שלנו4,7 מראים כי CD36 עשוי לתפקד כבורר עבור arteriolar הבדלה והעורקי נימי באמצעות lpa/pkd-1 מסלול איתות. כדי ללמוד אם הציר LPA/PKD-1-CD36 איתות חיוני עבור הריוגנזה ב vivo, הקמנו את הספר שורות המלכודת כי לא רק מחסור בCD36 הכללית או אנדותל ספציפי, CD36 או pkd-1-מחסור, אלא ג...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

אנו מציגים גישה כדי לטהר את הריבוכמה מאוגד-mRNA מתאי כלי הדם (ECs) ישירות במוח העכבר, הריאות ורקמות הלב באמצעות התגית הגנטית ספציפית EC של חלבון פלואורסצנטית ירוק משופר (EGFP) ב ריבוזומים בשילוב עם טיהור RNA .

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

היי, אני בן רן, אני פרופסור חבר לכירורגיה והנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת אלבמה, בית הספר לרפואה של ברמינגהאם. המעבדה שלנו מתעניינת בתפקוד ביולוגיה של תאי אנדותל אנגיוגנזה אקוגנזה בהקשר של מחלות לב וכלי דם נפוצות אלה וסרטן. אחד המחקרים שלנו מתמקד בוויסות אפיגנטי ותעתיק של טרנסדיפרנטיזציה של תאי אנדותל ואנגיוגנזה.כדי להבין את המנגנונים שעתוק של אנגיוגנזה, הקמנו קווי עכבר מהונדסים מהונדסים, שבו יש לנו לא רק נמחק גנים ספציפיים הקשורים אנגיוגנזה בתאי אנדותל, אבל בדיקה GFP משופרת יהיה מתויג גנטית על ריבוזום של תאים אנדותל ילידים. בדרך זו, אנו יכולים לבודד ולטהר לולאות של RNA שליח הקשורים מתאים אנדותל באברי רקמות שונים ישירות בבעלי חיים מהו מהודרים. לאחר מכן נוכל להשתמש ברנ"א השליח המטוהר לניתוח במורד הזרם של תעתיקים ותמלול.על ידי רצף RNA ו- PCR צונן בזמן אמת. בסרטון זה, התלמידים שלי פטריק מורן וג'ורדן פאלמר וטכנאי המחקר ניקולס ברנקוב ורונג יואן יראה לכם גישה של עכברים מהודקים ושוכם RNA שליח ישירות מן ההיתוך בבעלי החיים מהוססים. Genotyping הוא ראשוני חשוב בפרוטוקול זה כדי להבטיח כי הקרח יש את תג GFP על ריבוזום של תאים אנדותל.מאז כל צעדי בידוד RNAi במורד הזרם להסתמך על נוכחות של ריבוזום מתויג GFP, זה חיוני כדי לקבוע את הגנוטיפ לפני תחילת הניסוי. לפני תחילת בידוד ה-RNA, יש להשלים מספר צעדי הכנה. אלה כוללים הכנת חיץ וקשירת הנוגדן נגד GFP לחרוזי החלבון G dina.המאגרים יכולים להימשך עד חודש בארבע מעלות צלזיוס וחרוזי הנוגדן יכולים להימשך עד שבוע בארבע מעלות צלזיוס. אז קח את המגבלות האלה בחשבון בעת תכנון הניסוי שלך. באמצעות homogenizer מונחה תבונה היא דרך מצוינת להגדיל את תפוקת RNA.הקפד להשתמש בהגדרות ומשך תדר נמוכים יותר כדי להפחית את השפלת ה- RNA. כפי שהוזכר קודם לכן, genotyping הוא צעד ראשוני חשוב בפרוטוקול המשפט. הבטחת כי עכברים אשר RNA הוא להיות מבודד באמצעות טכניקת TRAP הם חיוביים עבור הגן TRAP, לפחות heterozygotes, אבל הומוזיגי באופן אידיאלי עבור הגן TRAP הוא צעד חשוב כי הבטחת תג GFP הוא על ריבוזום הוא חיוני על מנת למשוך למטה באמצעות תגובת נוגדן אנטיגן ואת חמוזי אנטי GFP תוכלו להכין לפני תחילת הניסוי.לבודד את הרקמות הרצויות מהעכבר ולמקם אותו מיד לתוך PBS קר כקרח עם 100 מיקרוגרם לכל פתרון cyclohexamide מיליליטר. זה מבטיח כי התרגום יופסק כי התמלול יהיה תיאור מדויק של העכבר לפני המתת חסד. השתמש homogenizer מונע מנוע כדי הומוגניזציה הרקמה לתוך השעיית תא.הגדרות תזמון ותדירות אידיאליות יצטרכו להיקבע על ידי המעבדה הבודדת בהתבסס על homogenizer מונחה מנוע מסוים אתה תהיה משתמש. שימוש בהגדרת תדירות גבוהה מדי עלול להוביל להשפלת RNA ולשבש את שאר הפרוטוקול. להשעות את גלולת התא בתוך מאגר תזה היית צריך להכין לפני תחילת הניסוי.הקפד הומוגניזציה תערובת זו עוד יותר על מנת להבטיח הומוגניזציה נאותה לפני שתמשיך עם שאר הפרוטוקול. צנטריפוגה הומוגנית במשך 10 דקות ב 2, 000 פעמים G בצנטריפוגה ארבע מעלות צלזיוס. זה יהיה גלולה הגרעינים ופסולת הסלולר גדול אשר עלול להפריע לתגובת immunoprecipitation במורד הזרם.הוסף שומנים DHPC ו CA-630 אל העל-טבעי מן הצעד הקודם צנטריפוגליזציה. שומנים אלה יסייעו להפריד את שלבי החלבון מהרכיבים תאיים האחרים. מניחים את ההשעיה על קרח במשך חמש דקות ומאפשרים לו לשבת.צנטריפוגה lysate במשך 10 דקות ב 13, 000 פעמים G כדי גלולה כל חומר מסיס. שמור 15% מהליסייט הברור עבור שלבים עתידיים. מוסיפים את חרוזי הנוגדן נגד GFP לתא lysate supernatant ו דגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס עם סוף מעל סיבוב סוף במשך 30 דקות.כאן הנוגדנים נגד GFP יקשרו את הריבוזום המתויג של GFP, ויאפשרו לנו לבודד עוד יותר את ה-RNA מהריבוזום הזה. לאסוף את חרוזים על המדף המגנטי שלך לשטוף את חרוזים חמש פעמים באמצעות מאגר שטיפת פוליקום מלח גבוה שלך כי אתה מוכן לפני תחילת הבידוד. המשך מיד לשלב הבא שבו ת למקם את חרוזים במאגר RLT.צנטריפוגה lysate במשך שלוש דקות במלוא המהירות בזהירות להסיר את supernatant ולהעביר אותו צינור microfuge חדש. מוסיפים נפח אחד של 70%אתנול ללייט המטוהר ומערבבים מיד על ידי צינורות. המשך מיד לשלב הבא שבו תעביר עד 700 מיקרוליטרים של המדגם, כולל כל משקעים שאולי נוצרו, לעמודת ספין הממוקמת בצינור איסוף של שני מיליליטר.צנטריפוגה lysate במשך 15 שניות יותר מ 8, 000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין. בטל את הזרימה ולהמשיך לשלב הבא. הוסף 350 מיקרוליטרים של מאגר RW1 לעמודת הסיבוב.צנטריפוגה במשך 15 שניות יותר מ 8, 000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין להשליך את הזרימה דרך. חזור על שלב זה באמצעות 350 מיקרוליטרים אחרים של מאגר RW1 לפני שתמשיך לשלב הבא. הוסף 500 מיקרוליטרים של RPE של מאגר לעמודת הסיבוב.צנטריפוגה במשך 15 שניות יותר מ 8, 000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין. השלך את הזרימה והמשך לחזור על שלב זה על-ידי הוספת 500 מיקרוליטרים נוספים של RPE של מאגר לעמודת הסיבוב. הפעם, צנטריפוגה במשך שתי דקות יותר מ 8.000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין.השלך את הזרימה דרך והצב את עמודת הספין בצינור איסוף חדש של שני מיליליטר והמשך לצנטריפוגה במהירות מלאה למשך דקה אחת כדי להסיר כל מאגר שיורית שעשוי להיות נוכח בעמודת הספין. השלך את הזרימה דרך והצב את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש של 1.5 מיליליטר. המשך להוסיף 30 עד 50 microliters של מים חינם RNase ישירות קרום עמוד ספין.צנטריפוגה במשך דקה אחת יותר מ 8, 000 פעמים G כדי לחמק RNA מן קרום עמוד ספין. בשלב זה, ה-RNA שלך מומס במים חופשיים RNase וייתכן שיהיה מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שנה. המשך לכמת ולבדוק את טוהר הרנ"א שבודדת באמצעות ספקטרופוטומטר.אתם מחפשים שיא ב 260 ננומטר, שהוא חומצת גרעין, כולל RNA, סופג באופן מקסימלי. הכמות מתוארת בחלק הימני התחתון של התמונה בננוגרם למיקרוליטר. ניתן להסיק איכות על ידי יחס 260 230 המוצג פריט אחד מעל הכמות בחלק הימני התחתון של המסך.הגישה שלנו הראתה תשואות RNA נמוכות, במיוחד כאשר טיהרנו mRNA מרקמות הלב או מרקמות שהוקפאו בעבר. לכן אנחנו צריכים לבחור את התנאים כדי להגדיל את התשואות. עם זאת, התבוננו בעכברים לקויים ספציפיים ל-CD-36 EC, רמת האפרין B2 ו- DLL4 הוגדלה באופן משמעותי הן באנדוטליה של הריאות והן בלב, בהשוואה לבקרה.תוצאות אלה היו עולות בקנה אחד עם מחקרי במבחנה הקודמים שלנו, אשר עולה כי איכות RNA מספיק לניתוח במורד הזרם. התשואה הייתה נמוכה בשל התנאים המחמירים בסביבת העבודה שלנו. כדי להתגבר על מגבלה זו, זה קריטי להקים אזור עבודה חינם RNase לטהר משטחי עבודה וציוד שעלולים לקבל מזוהמים עם RNase ולהחליף כפפות לעתים קרובות על מנת לחלץ RNA איכות ולהגדיל את התשואות.זה גם קריטי למצוא ריכוזים מתאימים של נוגדני GFP במטריצת הזיקה ולהשתמש בריכוזים מתאימים של מעכבי RNase במאגר תריס הרקמה ולהשתמש RNase כלי פלסטיק חינם ריאגנטים עבור מיצוי RNA מן ריבוזום אנדותל של הרקמות הממוקדות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus (Video) | JoVE 

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...