Name: translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

डॉ रेन काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (13SDG14800019) द्वारा समर्थित है; बीआर), एन की आशा फाउंडेशन (FP00011709; बीआर), अमेरिकन कैंसर सोसायटी (86-004-26; MCW कैंसर केंद्र बीआर के लिए), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (HL136423; बीआर; जॉर्डन Palmer द्वारा समर्थित है 2018 MCW CTSI 500 सितारे इंटर्नशिप कार्यक्रम; पी मोरन NHLBI (5T35 HL072483-34) से एक संस्थागत अनुसंधान प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित है.

पशु प्रयोगों के लिए, यहाँ वर्णित सभी तरीकों को विस्कॉन्सिन के मेडिकल कॉलेज के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. अभिकर्मकों को तैयार करें
<ol><li>10 एम एम हेप्स, पीए?...

<ol>
	<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF/PKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan.">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA/PKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming.">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis.">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond:+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis?.">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?.</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li><li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model.">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA/PKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling.">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish.">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li><li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes.">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li></ol>

एंजियोजेनेसिस एक जटिल बहुचरणी प्रक्रिया है, जिसमें ईसी-विशिष्ट एंजियोजेनिक जीन प्रतिलेखन और अभिव्यक्तिईसी विभेद न होने और एंजियोजेनिक रीप्रोग्रामिंग 3, 4 में एक अनिवार्य भूमिका निभाती<s...

स्तनधारी मस्तिष्क, हृदय और फेफड़े जैसे जटिल ऊतकों में, सेलुलर विषमता के उच्च स्तर पूरे ऊतक नमूनों से प्राप्त जीन अभिव्यक्ति डेटा के विश्लेषण को जटिल बनाते हैं। विवो में एक विशेष सेल प्रकार में जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का निरीक्षण करने के लिए, एक नई पद्धति हाल ही में विकसित किया गया है, जो किसी भी आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल प्रकार के पूरे अनुवादित MRNA पूरक की पूछताछ की अनुमति देता है. इस पद्धति को अनुवाद ी राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (ट्रैप) तकनीक1,2के रूप में जाना जाता है। यह जानवरों में आनुवंशिक रूप से अन्य एंजियोजेनेसिस-संबद्ध जीनों के साथ संयुक्त होने पर एंडोथेलियल सेल जीव विज्ञान और एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
हमने दिखाया है कि एंजियोजेनिक पीकेडी-1 सिगनल और एंजियोजेनिक जीन सीडी36 का प्रतिलेखन एंडोथेलियल सेल (ईसी) विभेद और कार्यात्मक एंजियोजेनेसिस3,4,5,6के लिए महत्वपूर्ण है। जीन प्रतिलेखन और ईसी transdifferentiation में angiogenic और चयापचय संकेतन के आणविक तंत्र निर्धारित करने के लिए, हम TRAP तकनीक के आधार पर विशेष रूप से नष्ट angiogenic जीन के साथ आनुवंशिक रूप से इंजीनियर TRAP चूहों बनाया है1 , 2. इसके अलावा, हमारे TRAP जानवरों में, न केवल वे संवहनी endothelia या cd36 जीन के वैश्विक विलोपन में pkd-1 या cd36 जीन की कमी है, लेकिन एक बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) भी आनुवंशिक रूप से टैग किया गया है पर चुनाव आयोग राइबोसोम का अनुवाद कर रहा है। TRAP लक्षित ऊतकों के संवहनी endothelia से सीधे ribosome-बाउंड MRNA के आत्मीयता शुद्धि की अनुमति देता है, जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण और नए transcriptomes कि चुनाव आयोग भेदभाव के साथ जुड़े रहे हैं की पहचान को सक्षम करने और विवो स्थितियों में सीधे एंजियोजेनेसिस। हम सफलतापूर्वक इन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जानवरों में endothelia से राइबोसोम बाध्य आरएनए अलग है. शुद्ध आरएनए का उपयोग ईसी विभेदऔर कार्यों के विनियमन में एंजियोजेनिक या धमनीजन जीनों के आगे की विशेषता के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल सीधे vivo में ECs में MRNA के अलगाव के लिए TRAP दृष्टिकोण को लागू करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड प्रदान करता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">G2939AA, 5067-1511 &#38; 5067-1513</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell scrapers</td>
			<td style="width:73px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:123px;">83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">K8855100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Magnet (Dynamag-2)</td>
			<td style="width:73px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">123-21D</td>
			<td>Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">NanoDrop 2000C spectrophotometer</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5430R</td>
			<td>with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Rnase-free 50-mL conical tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 1000-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 200-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 20-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotor for homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Yamato&#160;</td>
			<td style="width:123px;">LT-400D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tube rotator, Labquake brand</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-687-12Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo

कई अध्ययनों में इन विट्रो सेलुलर assays और पूरे ऊतकों का उपयोग करने के लिए सीमित किया गया है या में ट्रांसट्रो और जीन अभिव्यक्ति के in vitro विश्लेषण के लिए जानवरों से विशिष्ट सेल प्रकार के अलग-अलग QPCR और आरएनए अनुक्रमण द्वारा. जटिल ऊतकों और अंगों में विशिष्ट कोशिका प्रकार के व्यापक ट्रांसक्रिप्टोम और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण होंगे जिसके द्वारा जीन विनियमित होते हैं और ऊतक होमोस्टेसिस और अंग के साथ उनका संबंध होता है कार्यों. इस लेख में, हम एक उदाहरण के रूप में पशु फेफड़ों के संवहनी endothelia में सीधे vivo में ribosome बाध्य आरएनए के अलगाव के लिए पद्धति का प्रदर्शन. विशिष्ट सामग्री और ऊतक प्रसंस्करण और आरएनए शुद्धि के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया जाएगा, आरएनए गुणवत्ता और उपज के मूल्यांकन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से arteriogenic जीन assays के लिए वास्तविक समय QPCR सहित. इस दृष्टिकोण, राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (ट्रैप) तकनीक का अनुवाद के रूप में जाना जाता है, जीन अभिव्यक्ति और जटिल ऊतकों में किसी भी विशिष्ट प्रकार में सीधे विवो में कुछ सेल प्रकार के transcriptome विश्लेषण की विशेषता के लिए उपयोग किया जा सकता है.

हमारे पिछले अध्ययन4,7 सुझाव है कि CD36 LPA/PKD-1 संकेतन मार्ग के माध्यम से धमनी भेदभाव और केशिका धमनी के लिए एक स्विच के रूप में कार्य कर सकते हैं. यह अध्ययन करने के लिए कि क्या LPA/PKD-1-CD36 संकेतन अ?...

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Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

हम संवहनी endothelial कोशिकाओं से राइबोसोम बाध्य MRNA शुद्ध करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत (ईसी) सीधे माउस मस्तिष्क में, फेफड़ों और दिल के ऊतकों में बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विशिष्ट आनुवंशिक टैग के माध्यम से (EGFP) आरएनए शुद्धि के साथ संयोजन में ribosomes .

वीवो में एंडोथेलियल सेल से आरएनए अलगाव के लिए रिबोसोम एफ़िनिटी शुद्धि (टीआरईआरई) का अनुवाद

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Oligonucleotide निर्देशित क्षालन का उपयोग कोशिकाओं से आत्मीय आरएनए प्रोटीन परिसरों का अलगाव

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

मात्रात्मक Transcriptome विश्लेषण में उपयोग के लिए बीज से उच्च शुद्ध शाही सेना के अलगाव के लिए एक कारगर तरीका

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Enzymatically सक्रिय जी -4 Resolvase1 की शुद्धि के लिए एक जी quadruplex डीएनए आत्मीयता दृष्टिकोण

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

बायोटिनिलाटेड सेल सतह प्रोटीन की शुद्धि<em&gt; राइप्सीफलस माइक्रोप्रलस</em&gt; एपिथेलियल पेट कोशिकाओं

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

माउस से हेपैटोसाइट्स और Sinusoidal Endothelial कोशिकाओं का शुद्धि जिगर छिड़काव

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

एमएस 2-आत्मीयता शुद्धि ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया में आरएनए अनुक्रमण के साथ मिलकर

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं से यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन का शुद्धिकरण

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus (Video) | JoVE 

"सिपुन्कुलस न्यूडस से फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम का आत्मीयता शुद्धिकरण"।

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...