Name: translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00
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렌 박사의 작품은 미국 심장 협회 (13SDG14800019)에 의해 지원됩니다. BR), 앤스 호프 재단 (FP00011709; BR), 미국 암 학회 (86-004-26; MCW 암 센터 BR), 그리고 건강의 국립 연구소 (HL136423; BR); 조던 파머는 2018 MCW CTSI 500 스타 인턴십 프로그램에 의해 지원됩니다. P. 모란은 NHLBI (5T35 HL072483-34)의 기관 연구 교육 보조금에 의해 지원됩니다.

동물 실험을 위해, 여기에 기술된 모든 방법은 위스콘신 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 시약 준비
<ol><li>용해 완충액을 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2,0.5 mM DTT, 100 mg/mL 사이클로헤오히미드, 프로테아제 억제제 및 재조합 RNase 억제제의 농도로 준비한다.<ol>
<li>다음 시약을 RNase 없는 탈이온수 500 mL에 추가: HEPES 1.19 g, 5.59 g의 KC...

<ol>
	<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF/PKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan.">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA/PKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming.">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis.">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond:+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis?.">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?.</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li><li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model.">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA/PKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling.">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish.">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li><li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes.">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li></ol>

혈관신생은 복잡한 다단계 과정으로, EC 특이적 혈관신생 유전자 전사 및 발현이 EC 분화 및 혈관신생 재프로그래밍에 필수적인 역할을 하는3,4. 생체 내 분자 수준에서 포유류 혈관 시스템의 기능을 더 잘 이해하기 위한 세포 다양성 및 건축 적 복잡성의 장벽을 극복하기 위해 EC 특이적 CD36과 함께 EC 특이적 TRAP 마우스를 만들었습니다. , EC 특이적...

포유류 뇌, 심장 및 폐와 같은 복잡한 조직에서는 높은 수준의 세포 이질성이 전체 조직 샘플에서 파생된 유전자 발현 데이터의 분석을 복잡하게 만듭니다. 생체 내에서 특정 세포 유형에서 유전자 발현 프로파일을 관찰하기 위해, 새로운 방법론이 최근에 개발되었으며, 이는 임의의 유전자 정의 세포 유형의 전체 번역 된 mRNA 보체의 심문을 허용한다. 이 방법론은 리보솜 친화도 정제(TRAP) 기술1,2. 그것은 동물에 있는 그밖 혈관신생 관련 유전자를 유전으로 조작과 결합될 때 내피 세포 생물학 및 혈관 신생을 공부하는 유용한 공구입니다.
혈관신생 PKD-1 신호및 혈관신생 유전자 CD36의 전사가 내피세포(EC) 분화 및 기능성 혈관신생3,4,5,6에중요하다는 것을 보여주었다. 유전자 전사 및 EC 분화에서 혈관 신생 및 대사 신호의 분자 메커니즘을 결정하기 위해 TRAP 기술 1을 기반으로 특별히 삭제 된 혈관 신생 유전자를 사용하여 유전자 조작 TRAP 마우스를 만들었습니다1 , 2. 또한, 우리의 TRAP 동물에서, 뿐만 아니라 그들은 혈관 내피 또는 cd36 유전자의 글로벌 삭제에 pkd-1 또는 cd36 유전자 결핍을 가지고 있지만, 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)도 유전적으로 태그 EC의 번역 리보솜. TRAP은 표적 조직의 혈관 내피에서 직접 리보솜 결합 mRNA의 친화도 정제를 허용하여 유전자 발현 및 EC 분화와 관련된 새로운 전사체의 식별을 가능하게 하며, 생체 내 조건 하에서 직접 혈관 신생. 우리는 성공적으로 이 유전으로 조작된 동물에 있는 내피에서 리보솜 바인딩된 RNA를 격리했습니다. 정제된 RNA는 EC 분화 및 기능의 조절에서 혈관신생 또는 동맥신생 유전자의 추가 특성화에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 생체 내에서 직접 ECs에서 mRNA의 격리를 위한 TRAP 접근법을 구현하는 단계별 가이드를 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">G2939AA, 5067-1511 &#38; 5067-1513</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell scrapers</td>
			<td style="width:73px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:123px;">83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">K8855100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Magnet (Dynamag-2)</td>
			<td style="width:73px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">123-21D</td>
			<td>Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">NanoDrop 2000C spectrophotometer</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5430R</td>
			<td>with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Rnase-free 50-mL conical tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 1000-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 200-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 20-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotor for homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Yamato&#160;</td>
			<td style="width:123px;">LT-400D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tube rotator, Labquake brand</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-687-12Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo

많은 연구는 qPCR 및 RNA 염기서열 분석에 의한 전사체 및 유전자 발현의 시험관 내 분석을 위해 동물로부터 시험관 내 세포 분석 및 전체 조직 또는 특정 세포 유형을 분리하는 것으로 제한되었습니다. 복잡한 조직 및 기관에 있는 특정 세포 모형의 포괄적인 전사체 그리고 유전자 발현 분석은 유전자가 통제되는 세포와 분자 기계장치를 이해하고 조직 항상성 및 기관과의 그들의 협회를 이해하는 것이 중요합니다 함수. 이 기사에서는, 우리는 예를 들어 동물 폐의 혈관 내피에서 생체 내에서 직접 리보솜 결합 RNA의 격리를위한 방법론을 보여줍니다. 조직 처리 및 RNA 정제를 위한 특정 물질 및 절차는 동맥 생성 유전자 검정을 위한 RNA 질 및 수율의 평가 뿐만 아니라 실시간 qPCR를 포함하여 기술될 것이다. 리보솜 친화도 정제(TRAP) 기술로 알려진 이 접근법은 복잡한 조직에서 임의의 특정 유형에서 생체 내에서 직접 특정 세포 유형의 유전자 발현 및 전사체 분석의 특성화에 활용될 수 있다.

우리의 이전연구 4,7은 CD36이 LPA/PKD-1 신호 통로를 통해 동맥 분화 및 모세관 동맥화를 위한 스위치로 작동할 수 있다는 것을 건의합니다. LPA/PKD-1-CD36 신호 축이 생체 내 동맥 발생에 필수적인지 여부를 연구하기 위해, 우리는 글로벌 cd36 결핍 또는 내피 특이적 cd36- 또는 pkd-1 결핍뿐만 아니라 선택적 격리를 허용하는 새로운 TRAP 라인을 설립했습니다. GFP에...

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Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

우리는 RNA 정화와 결합된 리보솜에 있는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 EC 특정 유전 꼬리표를 통해 마우스 두뇌, 폐 및 심혼 조직에서 직접 혈관 내피 세포 (Ec)에서 리보솜 결합mRNA를 정화하는 접근을 제시합니다 .

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

안녕하세요, 저는 빈 렌입니다, 나는 알라바마 대학 버밍엄 의과 대학에서 수술 및 생물 의학 공학의 부교수입니다. 우리의 실험실은 이러한 일반적인 심장 혈관 질환과 암의 맥락에서 내피 세포 생물학 기능 혈관 신생 아큐오발생에 관심이 있습니다. 우리의 연구 중 하나는 내피 세포 전분 및 혈관 신생의 후성 유전학 및 전사 조절에 있습니다.혈관 신생의 전사 메커니즘을 이해하기 위해, 우리는 자궁 내피 세포에서 혈관 신생과 관련된 특정 유전자를 삭제했을뿐만 아니라 향상된 GFP 프로브가 토착 내피 세포의 리보솜에 유전적으로 태그될 트랜스젠트 엔지니어링 마우스 라인을 확립했습니다. 이러한 방식으로, 우리는 형질전환 동물에서 직접 다른 조직 기관에서 내피 세포에서 관련 메신저 RNA의 루프를 분리하고 정화 할 수 있습니다. 그런 다음 정제 된 메신저 RNA를 사용하여 성적 증명서 및 전사의 다운스트림 분석을 사용할 수 있습니다.RNA 시퀀싱 및 실시간 냉각 PCR에 의해. 이 비디오에서, 내 학생 패트릭 모란과 조던 파머와 연구 기술자 니콜라스 바네코프와 롱 위안당신에게 트랜스 제닉 동물의 내피에서 직접 지각 형생 마우스와 멸망 메신저 RNA를 유전자화 하는 방법을 보여줍니다. Genotyping은 얼음이 내피 세포의 리보솜에 GFP 태그를 가지고 있는지 확인하기 위해이 프로토콜에서 중요한 예비입니다.모든 다운스트림 RNAi 절연 단계는 GFP 태그 리보솜의 존재에 의존하기 때문에 실험을 시작하기 전에 유전자형을 결정하는 것이 필수적입니다. RNA 격리를 시작하기 전에 몇 가지 준비 단계를 완료해야 합니다. 이들은 단백질 G dina 구슬에 항 GFP 항체를 완충 제제 및 결합을 포함한다.완충제는 섭씨 4도에서 최대 1개월까지 지속될 수 있으며 항체 바인딩구슬은 섭씨 4도에서 최대 1주일까지 지속될 수 있습니다. 따라서 실험을 계획할 때 이러한 제한 사항을 고려하십시오. 어금니 구동 균질화제를 사용하는 것은 RNA 수율을 높이는 훌륭한 방법입니다.RNA 분해를 줄이기 위해 낮은 주파수 설정 및 지속 시간을 사용해야 합니다. 앞서 언급했듯이, genotyping은 임상 시험 프로토콜에서 중요한 예비 단계입니다. TRAP 기술을 사용하여 RNA를 분리하는 마우스가 TRAP 유전자에 대해 양성이지만, 적어도 TRAP 유전자에 대한 이상적으로 동질화구는 GFP 태그가 리보솜에 있는지 확인하는 것이 항원 항체 반응 및 항 GFP 비드를 사용하여 아래로 당겨야 하기 때문에 중요한 단계입니다.마우스에서 원하는 조직을 분리하고 밀리리터 사이클로헥사미드 용액당 100 마이크로그램으로 얼음 차가운 PBS에 즉시 넣습니다. 이렇게 하면 번역이 중지되고 전사체가 안락사 이전에 마우스를 정확하게 묘사할 수 있습니다. 모터 구동 균질화제를 사용하여 조직을 세포 현탁액으로 균질화하십시오.이상적인 타이밍 과 주파수 설정은 당신이 사용할 것입니다 특정 모터 구동 균질화제에 따라 개별 실험실에 의해 결정되어야한다. 주파수 설정이 너무 높게 사용하면 RNA 가 분해되고 나머지 프로토콜이 중단될 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 준비해야 하는 리시스 버퍼 내에서 셀 펠릿을 일시 중단합니다.프로토콜의 나머지 부분을 진행하기 전에 적절한 균질화를 보장하기 위해이 혼합물을 더 균질화해야합니다. 원심 분리는 섭씨 4도 원심분리기에서 2, 000배 G에서 10분 동안 동형포를 발사합니다. 이것은 다운스트림 면역 침전 반응을 방해할 수 있는 핵 및 큰 세포 파편을 펠렛할 것입니다.이전 원심화 단계에서 상퍼에 DHPC 및 CA-630 지질을 추가합니다. 이 지질은 그밖 세포내 분대에서 단백질 위상을 분리하는 것을 도울 것입니다. 서스펜션을 얼음 위에 5분간 놓고 앉습니다.13, 000배 G에서 10분 동안 용해성 물질을 원심분리합니다. 향후 단계를 위해 명확한 lysate의 15%를 보관하십시오. 세포용액에 항-GFP 항체 바운드 구슬을 추가하고 30분 동안 엔드 오버 엔드 회전으로 4°C에서 혼합물을 배양한다.이것은 항 GFP 항체가 GFP 태그리보솜을 결합하여 이러한 리보솜으로부터 RNA를 더 격리할 수 있는 곳입니다. 마그네틱 랙에 구슬을 모으고 격리를 시작하기 전에 준비한 높은 소금 폴리섬 워시 버퍼를 사용하여 구슬을 5회 세척합니다. 즉시 RLT 버퍼에 구슬을 배치하는 다음 단계로 진행합니다.최대 속도로 3 분 동안 lysate원심을 원심 분리하고 상체를 조심스럽게 제거하고 새로운 미세 분리 튜브로 옮킵니다. 클리어된 용액에 70%에탄올 1부부로 넣고 파이펫팅으로 즉시 섞습니다. 형성되었을 수 있는 침전수를 포함하여 시료의 최대 700마이크로리터를 2밀리리터 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 즉시 전송하는 다음 단계로 진행합니다.스핀 컬럼 멤브레인을 세척하기 위해 8, 000배 G보다 15초 동안 리세스를 원심분리합니다. 흐름을 버리고 다음 단계로 진행합니다. 스핀 컬럼에 버퍼 RW1 350 마이크로리터를 추가합니다.원심분리기는 8, 000배 G이상으로 15초 동안 스핀 컬럼 멤브레인을 세척하고 흐름을 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 버퍼 RW1의 또 다른 350 마이크로리터를 사용하여 이 단계를 반복합니다. 스핀 컬럼에 500마이크로리터의 버퍼 RPE를 추가합니다.스핀 컬럼 멤브레인을 세척하기 위해 8, 000 배 G보다 15 초 동안 원심 분리기. 흐름을 버리고 스핀 컬럼에 버퍼 RPE의 500 마이크로리터를 추가하여 이 단계를 반복합니다. 이번에는 스핀 컬럼 멤브레인을 세척하기 위해 8.000 배 G보다 큰 2 분 동안 원심 분리기를 합니다.흐름을 버리고 스핀 컬럼을 새로운 2 밀리리터 수집 튜브에 놓고 1분 동안 최대 속도로 원심분리기로 진행하여 스핀 컬럼에 존재할 수 있는 잔류 버퍼를 제거합니다. 흐름을 버리고 스핀 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 수집 튜브에 배치합니다. 스핀 컬럼 멤브레인에 직접 RNase 프리 워터30~50마이크로리터를 추가합니다.스핀 컬럼 멤브레인에서 RNA를 엘로우기 위해 8, 000배 G보다 1분 동안 원심분리기. 이 시점에서 RNA는 RNase 무료 물에 용해되며 최대 1 년 동안 영하 80도에서 보관 할 수 있습니다. 분광광계를 사용하여 격리한 RNA의 순도를 정량화하고 확인하십시오.RNA를 포함한 핵산인 260 나노미터에서 최대 흡수를 찾고 있습니다. 양은 마이크로리터 당 나노그램으로 이미지의 오른쪽 아래 부분에 묘사된다. 품질은 260 230 비율로 추론될 수 있으며, 이는 화면의 오른쪽 아래 부분의 수량 보다 높은 한 항목을 나타내고 있다.우리의 접근은 우리가 심장 조직에서 또는 이전에 동결된 조직에서 mRNA를 정제할 때 특히 낮은 RNA 수율을 보여주었습니다. 따라서 우리는 수율을 높이기 위해 조건을 최적화해야합니다. 그러나, 우리는 EC 특이CD-36 결핍 마우스에서 관찰했었으며, 에프린 B2 와 DLL4의 수준은 대조군과 비교했을 때 폐와 심내도 모두에서 현저히 증가하였다.이러한 결과는 RNA 품질이 다운스트림 분석을 위해 충분하다는 것을 건의하는 우리의 이전 체외 연구 결과와 일치했습니다. 작업 영역의 엄격한 조건으로 인해 수율이 낮았습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해서는 RNase 무료 작업 영역을 설정하고 RNase로 오염되고 장갑을 자주 교체하여 품질 RNA를 추출하고 수율을 높일 수 있는 작업 표면 및 장비를 오염 제거하는 것이 중요합니다.또한 친화성 매트릭스에서 GFP 항체의 적절한 농도를 찾고 조직 용해 완충제에서 RNase 억제제의 적절한 농도를 사용하고 표적 조직의 내피성 리보솜에서 RNA 추출을 위한 RNase 무료 플라스틱 도자기 및 시약을 사용하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

연구

생화학

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

양 사체 (Transcriptome) 분석에있는 사용을위한 씨앗에서 매우 정제 된 RNA의 분리를위한 효율적인 방법

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; 상피 직감 세포

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus (Video) | JoVE 

Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소의 친화성 정제

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...