Name: translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

O trabalho do Dr. Ren é apoiado pela associação americana do coração (13SDG14800019; BR), a Fundação Ann ' s Hope (FP00011709; BR), a sociedade americana do câncer (86-004-26; o MCW Cancer Center para BR), e o Instituto Nacional de saúde (HL136423; BR); Jordan Palmer é apoiado pelo 2018 MCW CTSI 500 Stars programa de estágio; P. Moran é apoiado por uma subvenção de formação de investigação institucional da NHLBI (5T35 HL072483-34).

Para experimentos com animais, todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina de Wisconsin.
1. Prepare os reagentes
<ol><li>Prepare o tampão de Lise para concentrações de 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mm dtt, 100 mg/ml cicloheximida, inibidores da protease e inibidores de RNase recombinantes para concentrações como descrito abaixo.<ol>
<li>Adicione os seguintes reagentes a 50...

<ol>
	<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF/PKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan.">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA/PKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming.">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis.">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond:+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis?.">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?.</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li><li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model.">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA/PKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling.">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish.">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li><li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes.">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li></ol>

A angiogênese é um processo complexo de múltiplas etapas, no qual a transcrição e expressão do gene angiogênico específico da CE desempenham um papel essencial na diferenciação da CE e na reprogramação angiogênica3,4. Para superar as barreiras da diversidade celular e da complexidade arquitetônica para melhor compreender a função do sistema vascular de mamíferos em nível molecular in vivo, criamos camundongos TRAP específicos da CE, acompanhado...

Em tecidos complexos, como o cérebro de mamíferos, coração e pulmão, os altos níveis de heterogeneidade celular complicam a análise dos dados de expressão gênica derivados de amostras de tecidos inteiros. Para observar os perfis de expressão gênica em um determinado tipo de célula in vivo, uma nova metodologia foi desenvolvida recentemente, o que permite a interrogação de todo o complemento traduzido de mRNA de qualquer tipo de célula geneticamente definida. Essa metodologia é conhecida como a técnica de conversão de afinidade Ribossome (Trap)1,2. É uma ferramenta útil para estudar a biologia e a angiogênese de células endoteliais quando combinada com a manipulação genética de outros genes associados à angiogênese em animais.
Nós mostramos que a sinalização angiogênica de PKD-1 e a transcrição do gene angiogénico CD36 são críticas para a diferenciação da pilha endothelial (EC) e a angiogênese funcional3,4,5,6. Para determinar os mecanismos moleculares da sinalização angiogênica e metabólica na transcrição genética e na transdiferenciação CE, criamos camundongos TRAP geneticamente modificados com genes angiogênicos especificamente excluídos com base na técnica TRAP1 , 2. Além disso, em nossos animais Trap, não só eles têm deficiência de gene PKD-1 ou CD36 no endothelia vascular ou apagamento global do gene CD36 , mas uma proteína de fluorescência verde reforçada (EGFP) também é geneticamente marcada para A EC está traduzindo ribossomas. A armadilha permite a purificação da afinidade do mRNA ribosome-ligado diretamente do endothelia vascular de tecidos alvejados, permitindo a análise da expressão de gene e da identificação de transcriptoma novos que são associados com a diferenciação e angiogênese diretamente condições in vivo. Nós isolamos com sucesso o RNA ribosome-ligado do endothelia nestes animais genetically projetados. O RNA purificado pode ser utilizado para a caracterização de genes angiogênicos ou arteriogênicos na regulação da diferenciação e funções da CE. Este protocolo fornece um guia passo a passo para implementar a abordagem TRAP para o isolamento de mRNA em ECs diretamente in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">G2939AA, 5067-1511 &#38; 5067-1513</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell scrapers</td>
			<td style="width:73px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:123px;">83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">K8855100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Magnet (Dynamag-2)</td>
			<td style="width:73px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">123-21D</td>
			<td>Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">NanoDrop 2000C spectrophotometer</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5430R</td>
			<td>with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Rnase-free 50-mL conical tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 1000-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 200-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 20-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotor for homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Yamato&#160;</td>
			<td style="width:123px;">LT-400D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tube rotator, Labquake brand</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-687-12Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo

Muitos estudos têm sido limitados ao uso de ensaios celulares in vitro e tecidos inteiros ou isolando tipos de células específicas de animais para análise in vitro de transcriptoma e expressão gênica por sequenciamento de qPCR e RNA. O transcriptoma detalhado e a análise da expressão de gene de tipos específicos da pilha em tecidos e em órgãos complexos serão críticos compreender os mecanismos celulares e moleculars por que os genes são regulados e sua associação com a homeostase e o órgão do tecido Funções. Neste artigo, nós Demonstramos a metodologia para a isolação do RNA ribosome-ligado diretamente in vivo no endothelia vascular de pulmões animais como um exemplo. Os materiais e os procedimentos específicos para o processamento do tecido e a purificação do RNA serão descritos, incluindo a avaliação da qualidade e do rendimento do RNA assim como qPCR do tempo real para ensaios arteriogênica do gene. Esta aproximação, conhecida como traduzindo a técnica Ribossoma da purificação da afinidade (armadilha), pode ser utilizada para a caracterização da expressão de gene e da análise do transcriptoma de determinados tipos da pilha diretamente in vivo em todo o tipo específico em tecidos complexos.

Nossos estudos precedentes4,7 sugerem que CD36 possa funcionar como um interruptor para a diferenciação arteriolar e a arterialização capilar através da via de sinalização de LPA/PKD-1. Para estudar se o eixo de sinalização LPA/PKD-1-CD36 é essencial para a arteriogênese in vivo, estabelecemos as novas linhas TRAP que não só têm deficiência global de CD36 ou deficiência endotelial-específica-CD36-ou PKD-1, mas também permitem o isolamento seleti...

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Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Nós apresentamos uma aproximação para purificar o mRNA ribosome-ligado das pilhas endothelial vasculares (ECS) diretamente no cérebro do rato, nos tecidos do pulmão e do coração através do Tag genético EC-specific da proteína verde aumentada da fluorescência (EGFP) nos ribossomas em combinação com a purificação do RNA .

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Oi, sou Bin Ren, professor associado de cirurgia e engenharia biomédica na Universidade do Alabama, a Escola de Medicina de Birmingham. Nosso laboratório está interessado em acuogênese da função de biologia celular endotelial no contexto dessas doenças cardiovasculares comuns e cânceres. Uma de nossas pesquisas se concentra na regulação epigenética e transcrição da transdiferenciação efernália celular e angiogênese.Para entender os mecanismos transcricionais da angiogênese, estabelecemos linhas de camundongos transgênicos, nas quais não só excluímos um gene específico associado à angiogênese nas células endoteliais, mas uma sonda GFP aprimorada será geneticamente marcada em um ribossomo de células endoteliais nativas. Desta forma, podemos isolar e purificar laços de RNA mensageiro associado de células endoteliais em diferentes órgãos teciduais diretamente em animais transgênicos. Podemos então usar o RNA mensageiro purificado para análise a jusante das transcrições e do transcriptome.Por sequenciamento de RNA e o tempo real chill PCR. Neste vídeo, meus alunos Patrick Moran e Jordan Palmer e os técnicos de pesquisa Nicholas Barnekow e Rong Yuan mostrarão uma abordagem genotipagem de ratos transgênicos e o RNA mensageiro aspirando diretamente da endotelial nos animais transgênicos. Genotipagem é uma preliminar importante neste protocolo para garantir que o gelo tenha a etiqueta GFP nos ribossomos das células endoteliais.Uma vez que todas as etapas de isolamento RNAi a jusante dependem da presença de ribossomos marcados por GFP, é essencial determinar o genótipo antes de iniciar o experimento. Antes de iniciar o isolamento do RNA, várias etapas preparatórias devem ser concluídas. Estes incluem a preparação do buffer e a vinculação do anticorpo anti-GFP às contas de proteína G dina.Os buffers podem durar até um mês a quatro graus Celsius e as contas ligadas a anticorpos podem durar até uma semana a quatro graus Celsius. Então leve essas limitações em conta ao planejar seu experimento. Usar um homogeneizador molar é uma excelente maneira de aumentar o rendimento do RNA.Certifique-se de usar configurações e durações de menor frequência, a fim de reduzir a degradação do RNA. Como mencionado anteriormente, genotipagem é um passo preliminar importante no protocolo de julgamento. Garantir que os camundongos cujo RNA deve ser isolado usando a técnica TRAP sejam positivos para o gene TRAP, pelo menos heterozygotes, mas idealmente homozigos para o gene TRAP é um passo importante, pois garantir que a tag GFP esteja no ribossomo é essencial para puxar para baixo usando a reação de anticorpos de antígeno e as contas anti-GFP que você terá preparado antes de começar o experimento.Isole os tecidos desejados do camundongo e coloque-o imediatamente em um PBS gelado com 100 microgramas por solução de ciclohexamida mililitro. Isso garante que a tradução será interrompida e que o transcriptome será uma representação precisa do mouse antes da eutanásia. Use um homogeneizador motorizado para homogeneizar o tecido em uma suspensão celular.As configurações ideais de tempo e frequência terão que ser determinadas pelo laboratório individual com base no homogeneizador acionado pelo motor específico que você estará usando. Usar uma configuração de frequência muito alta pode levar à degradação do RNA e interromper o resto do protocolo. Suspenda a pelota da célula dentro do tampão de lise que você deve ter preparado antes de iniciar o experimento.Certifique-se de homogeneizar ainda mais essa mistura, a fim de garantir a homogeneização adequada antes de prosseguir com o resto do protocolo. Centrifugar o homogeneizar por 10 minutos a 2.000 vezes G em uma centrífuga de quatro graus Celsius. Isso vai pellet os núcleos e grandes detritos celulares que podem interferir com a reação de imunoprecipitação a jusante.Adicione lipídios DHPC e CA-630 ao supernatante da etapa de centrifugação anterior. Esses lipídios ajudarão a separar as fases proteicas dos outros componentes intracelulares. Coloque a suspensão no gelo por cinco minutos e deixe-a sentar.Centrifugar o lysate por 10 minutos a 13.000 vezes G para pelotar qualquer material solúvel. Mantenha 15% do lysate claro para etapas futuras. Adicione as contas de anticorpos anti-GFP ligadas ao supernanato de lise celular e incubar a mistura a quatro graus Celsius com final sobre rotação final por 30 minutos.É aqui que os anticorpos anti-GFP ligarão os ribossomos marcados pelo GFP, permitindo-nos isolar ainda mais o RNA desses ribossomos. Colete as contas do seu rack magnético e lave as contas cinco vezes usando seu alto tampão de lavagem de sal polisso que você terá preparado antes de iniciar o isolamento. Prossiga imediatamente para a próxima etapa em que você colocará as contas no buffer RLT.Centrifugar o lise por três minutos a toda velocidade e remover cuidadosamente o supernascer e transferi-lo para um novo tubo de microfuça. Adicione um volume de 70% de etanol ao lise limpo e misture imediatamente por pipetação. Prossiga imediatamente para o próximo passo no qual você irá transferir até 700 microliters da amostra, incluindo qualquer precipitado que possa ter se formado, para uma coluna de spin colocada em um tubo de coleta de dois mililitros.Centrifugar o lise por 15 segundos a mais de 8.000 vezes G para lavar a membrana da coluna de giro. Descarte o fluxo através e prossiga para o próximo passo. Adicione 350 microliters de buffer RW1 à coluna de giro.Centrifugar por 15 segundos a mais de 8.000 vezes G para lavar a membrana da coluna de giro e descartar o fluxo através. Repita esta etapa usando outros 350 microliters de buffer RW1 antes de prosseguir para a próxima etapa. Adicione 500 microliters de RPE tampão à coluna de giro.Centrífuga por 15 segundos a mais de 8.000 vezes G para lavar a membrana da coluna de giro. Descarte o fluxo através e prossiga para repetir esta etapa adicionando mais 500 microliters de RPE tampão à coluna de giro. Desta vez, centrífuga por dois minutos a mais de 8.000 vezes G para lavar a membrana da coluna de giro.Descarte o fluxo através e coloque a coluna de giro em um novo tubo de coleta de dois mililitros e proceda à centrífuga a toda velocidade por um minuto para remover qualquer tampão residual que possa estar presente na coluna de giro. Descarte o fluxo através e coloque a coluna de giro em um novo tubo de coleta de 1,5 mililitro. Prossiga para adicionar 30 a 50 microliters de água livre RNase diretamente à membrana da coluna de spin.Centrífuga por um minuto a mais de 8.000 vezes G para elutar o RNA da membrana da coluna de spin. Neste ponto, seu RNA é dissolvido em água livre de RNase e pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius por até um ano. Proceda para quantificar e verificar a pureza do RNA que você isolou usando um espectrômetro.Você está procurando um pico de 260 nanômetros, que é o ácido nucleico, incluindo RNA, absorve ao máximo. A quantidade é retratada na parte inferior direita da imagem em nanogramas por microliter. A qualidade pode ser inferida pela razão 260 230, que é mostrada um item acima da quantidade na porção inferior direita da tela.Nossa abordagem mostrou baixos rendimentos de RNA, especialmente quando purificamos o mRNA dos tecidos cardíacos ou de tecidos previamente congelados. Precisamos, assim, optomizar as condições para aumentar os rendimentos. No entanto, observamos em EC camundongos deficientes cd-36 específicos, o nível de efrina B2 e DLL4 foram significativamente aumentados tanto na endothelia pulmonar quanto no coração, quando comparado com o controle.Esses resultados foram consistentes com nossos estudos in vitro anteriores, o que sugere que a qualidade do RNA é suficiente para análise a jusante. O rendimento foi baixo devido às condições rigorosas em nosso espaço de trabalho. Para superar essa limitação, é fundamental criar uma zona de trabalho livre RNase e descontaminar superfícies de trabalho e equipamentos que possam se contaminar com RNase e trocar luvas com frequência, a fim de extrair RNA de qualidade e aumentar os rendimentos.Também é fundamental encontrar concentrações adequadas de anticorpos GFP na matriz de afinidade e usar concentrações apropriadas do inibidor de RNase no tampão de tecido e usar utensílios plásticos e reagentes livres de RNase para extração de RNA de ribossomos endoteliais dos tecidos alvo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Bioquímica

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Um método eficiente para o isolamento de ARN altamente purificada a partir de sementes para Utilização em Análise Quantitativa do transcriptoma

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Uma Abordagem DNA afinidade G-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células intestinais epiteliais

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Purificação de Afinidade MS2 juntamente com sequenciamento de RNA em bactérias gram-positivas

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Purificação de proteínas p53 ubiquitinadas de células de mamíferos

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus (Video) | JoVE 

Purificação por Afinidade de uma Enzima Fibrinolítica de Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...