Name: translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00
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El trabajo del Dr. Ren es apoyado por la Asociación Americana del Corazón (13SDG14800019; BR), la Ann's Hope Foundation (FP00011709; BR), la Sociedad Americana contra el Cáncer (86-004-26; el McW Cancer Center to BR), y el Instituto Nacional de Salud (HL136423; BR); Jordan Palmer cuenta con el apoyo del Programa de Pasantías MCW CTSI 500 Stars 2018; P. Moran cuenta con el apoyo de una Beca de Formación en Investigación Institucional de NHLBI (5T35 HL072483-34).

Para experimentos con animales, todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Colegio Médico de Wisconsin.
1. Preparar reactivos
<ol><li>Preparar el tampón de lisis a concentraciones de 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 100 mg/mL cicloheximida, inhibidores de la proteasa e inhibidores de rNase recombinante a las concentraciones como se describe a continuación.<ol>
<li>Añadir los siguie...

<ol>
	<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF/PKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan.">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA/PKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming.">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis.">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond:+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis?.">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?.</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li><li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model.">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA/PKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling.">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish.">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li><li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes.">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li></ol>

La angiogénesis es un complejo proceso de varios pasos, en el que la transcripción y expresión de genes angiogénicos específicos de la CE desempeñan un papel esencial en la diferenciación EC y la reprogramación angiogénica3,4. Para superar las barreras de la diversidad celular y la complejidad arquitectónica para comprender mejor la función del sistema vascular de mamíferos a nivel molecular in vivo, hemos creado ratones TRAP específicos de la CE, ac...

En tejidos complejos como el cerebro, el corazón y el pulmón de los mamíferos, los altos niveles de heterogeneidad celular complican el análisis de los datos de expresión génica derivados de muestras de tejidos enteros. Para observar perfiles de expresión génica en un tipo de célula en particular in vivo, recientemente se ha desarrollado una nueva metodología, que permite el interrogatorio de todo el complemento de ARNm traducido de cualquier tipo de célula definida genéticamente. Esta metodología se conoce como la técnica de purificación de afinidad ribosoma de traducción (TRAP)1,2. Es una herramienta útil para estudiar la biología de las células endoteliales y la angiogénesis cuando se combina con la manipulación genética de otros genes asociados a la angiogénesis en animales.
Hemos demostrado que la señalización angiogénica PKD-1 y la transcripción del gen angiogénico CD36 son fundamentales para la diferenciación de células endoteliales (EC) y la angiogénesis funcional3,4,5,6. Para determinar los mecanismos moleculares de señalización angiogénica y metabólica en transcripción de genes y transdiferenciación EC, hemos creado ratones TRAP genéticamente diseñados con genes angiogénicos específicamente eliminados sobre la base de la técnica TRAP1 , 2. Además, en nuestros animales TRAP, no sólo tienen deficiencia de genes pkd-1 o cd36 en la endotelia vascular o deleción global del gen cd36, sino que una proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) también está genéticamente etiquetada en La EC está traduciendo ribosomas. TRAP permite la purificación de afinidad de ARNm ligada a ribosomas directamente de la endotelia vascular de los tejidos específicos, lo que permite el análisis de la expresión génica y la identificación de nuevos transcriptomes asociados con la diferenciación de la CE y angiogénesis directamente en condiciones in vivo. Hemos aislado con éxito el ARN ligado al ribosoma de la endotelia en estos animales genéticamente diseñados. El ARN purificado se puede utilizar para una mayor caracterización de genes angiogénicos o arteriogénicos en la regulación de la diferenciación y las funciones de la CE. Este protocolo proporciona una guía paso a paso para implementar el enfoque TRAP para el aislamiento de arNM en los CE directamente in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">G2939AA, 5067-1511 &#38; 5067-1513</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell scrapers</td>
			<td style="width:73px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:123px;">83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">K8855100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Magnet (Dynamag-2)</td>
			<td style="width:73px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">123-21D</td>
			<td>Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">NanoDrop 2000C spectrophotometer</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5430R</td>
			<td>with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Rnase-free 50-mL conical tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 1000-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 200-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 20-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotor for homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Yamato&#160;</td>
			<td style="width:123px;">LT-400D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tube rotator, Labquake brand</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-687-12Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo

Muchos estudios se han limitado al uso de ensayos celulares in vitro y tejidos enteros o el aislamiento de tipos celulares específicos de animales para el análisis in vitro del transcriptoma y la expresión génica mediante la secuenciación de qPCR y ARN. El análisis exhaustivo del transcriptoma y la expresión génica de tipos específicos de células en tejidos y órganos complejos será fundamental para comprender los mecanismos celulares y moleculares mediante los cuales se regulan los genes y su asociación con la homeostasis tisular y el órgano Funciones. En este artículo, demostramos la metodología para el aislamiento del ARN ligado a ribosoma directamente in vivo en la endotelia vascular de los pulmones de animales como ejemplo. Se describirán los materiales y procedimientos específicos para el procesamiento de tejidos y la purificación del ARN, incluida la evaluación de la calidad y el rendimiento del ARN, así como el qPCR en tiempo real para ensayos genéticos arteriogénicos. Este enfoque, conocido como la técnica de traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP), se puede utilizar para la caracterización de la expresión génica y el análisis del transcriptoma de ciertos tipos de células directamente in vivo en cualquier tipo específico en tejidos complejos.

Nuestros estudios anteriores4,7 sugieren que CD36 puede funcionar como un interruptor para la diferenciación arteriolar y la arterial capilar a través de la vía de señalización LPA/PKD-1. Para estudiar si el eje de señalización LPA/PKD-1-CD36 es esencial para la arteriogénesis in vivo, hemos establecido las nuevas líneas TRAP que no sólo tienen deficiencia global cd36 o deficiencia endotelial-específica-cd36- o pkd-1-deficiencia, sino que también perm...

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Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Presentamos un enfoque para purificar el ARNm ligado al ribosoma a partir de células endoteliales vasculares (OC) directamente en el cerebro del ratón, los pulmones y los tejidos cardíacos a través de la etiqueta genética específica de la CE de la proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) en ribosomas en combinación con la purificación del ARN .

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Hola, soy Bin Ren, soy profesor asociado de cirugía e ingeniería biomédica en la Universidad de Alabama en la Escuela de Medicina de Birmingham. Nuestro laboratorio está interesado en la biobequia celular endotelial angiogénesis acuogénesis en el contexto de estas enfermedades cardiovasculares comunes y cánceres. Una de nuestras investigaciones se centra en la regulación epigenética y de transcripción de la transdiferenciación y la angiogénesis de células endoteliales.Para entender los mecanismos transcripcionales de la angiogénesis, hemos establecido líneas de ratón de ingeniería transgénicas, en las que no sólo hemos eliminado un genógeno específico asociado con la angiogénesis en las células endoteliales, sino que una sonda GFP mejorada será etiquetada genéticamente en un ribosoma de células endoteliales nativas. De esta manera, podemos aislar y purificar bucles de ARN mensajero asociado de células endoteliales en diferentes órganos tisulares directamente en animales transgénicos. A continuación, podemos utilizar el ARN mensajero purificado para el análisis posterior de las transcripciones y el transcriptoma.Mediante la secuenciación de ARN y la PCR en frío en tiempo real. En este video, mis estudiantes Patrick Moran y Jordan Palmer y los técnicos de investigación Nicholas Barnekow y Rong Yuan le mostrarán un enfoque genotipado de ratones transgénicos y el ARN mensajero aspirador directamente desde el endotelial en los animales transgénicos. El genotipado es un preliminar importante en este protocolo para asegurar que el hielo tenga la etiqueta GFP en los ribosomas de las células endoteliales.Dado que todos los pasos de aislamiento de ARNi aguas abajo dependen de la presencia de ribosomas etiquetados con GFP, es esencial determinar el genotipo antes de comenzar el experimento. Antes de comenzar el aislamiento de ARN, se deben completar varios pasos preparatorios. Estos incluyen la preparación del tampón y la unión del anticuerpo anti-GFP a las perlas de la proteína G dina.Los buffers pueden durar hasta un mes a cuatro grados Celsius y las perlas unidas a anticuerpos pueden durar hasta una semana a cuatro grados centígrados. Así que tenga en cuenta estas limitaciones al planificar su experimento. El uso de un homogeneizador accionado molar es una excelente manera de aumentar el rendimiento del ARN.Asegúrese de utilizar ajustes y duraciones de frecuencia más bajos para reducir la degradación del ARN. Como se mencionó anteriormente, el genotipado es un paso preliminar importante en el protocolo de prueba. Asegurar que los ratones cuyo ARN debe aislarse utilizando la técnica TRAP sean positivos para el gen TRAP, al menos heterocigotos, pero lo ideal es homocigoto para el gen TRAP es un paso importante porque asegurarse de que la etiqueta GFP está en el ribosoma es esencial para tirar hacia abajo utilizando la reacción de anticuerpos antigenios y las perlas anti-GFP que habrá preparado antes de comenzar el experimento.Aísle los tejidos deseados del ratón y colóquelos inmediatamente en un PBS helado con una solución de ciclohexamida de 100 microgramos por mililitro. Esto garantiza que la traducción se detenga y que el transcriptoma será una representación precisa del ratón antes de la eutanasia. Utilice un homogeneizador accionado por motor para homogeneizar el tejido en una suspensión celular.Los ajustes de temporización y frecuencia ideales tendrán que ser determinados por el laboratorio individual en función del homogeneizador accionado por motor en particular que va a utilizar. El uso de una configuración de frecuencia demasiado alta puede provocar la degradación del ARN e interrumpir el resto del protocolo. Suspenda el pellet celular dentro del búfer de lelisis que debería haber preparado antes de comenzar el experimento.Asegúrese de homogeneizar aún más esta mezcla para garantizar una homogeneización adecuada antes de proceder con el resto del protocolo. Centrifugar el homogeneizar durante 10 minutos a 2.000 veces G en una centrífuga de cuatro grados Celsius. Esto va a peletizar los núcleos y grandes desechos celulares que pueden interferir con la reacción de inmunoprecipitación aguas abajo.Añadir lípidos DHPC y CA-630 al sobrenadante desde el paso de centrifugación anterior. Estos lípidos ayudarán a separar las fases de la proteína de los otros componentes intracelulares. Coloque la suspensión sobre hielo durante cinco minutos y dé la vuelta.Centrifugar el izado durante 10 minutos a 13.000 veces G para peletizar cualquier material soluble. Mantenga el 15% del aclarado claro para pasos futuros. Agregue las perlas unidas al anticuerpo anti-GFP al sobrenadante de anesado celular e incubar la mezcla a cuatro grados Celsius con rotación de extremo sobre extremo durante 30 minutos.Aquí es donde los anticuerpos anti-GFP unirán los ribosomas etiquetados por GFP, lo que nos permite aislar aún más el ARN de estos ribosomas. Recoge las perlas en tu rack magnético y lava las cuentas cinco veces usando tu tampón de lavado de polisoma de alta sal que habrás preparado antes de comenzar el aislamiento. Continúe inmediatamente con el siguiente paso en el que colocará las perlas en el búfer RLT.Centrifugar el izado durante tres minutos a toda velocidad y retirar cuidadosamente el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo de microfugo. Añadir un volumen de 70%etanol al izado despejado y mezclar inmediatamente por pipeteo. Proceda inmediatamente al siguiente paso en el que transferirá hasta 700 microlitros de la muestra, incluyendo cualquier precipitado que pueda haberse formado, a una columna de centrifugado colocada en un tubo de recogida de dos mililitros.Centrifugar el izado durante 15 segundos a más de 8.000 veces G para lavar la membrana de la columna de centrifugado. Deseche el flujo a través y proceda al siguiente paso. Agregue 350 microlitros de búfer RW1 a la columna de giro.Centrifugar durante 15 segundos a más de 8.000 veces G para lavar la membrana de la columna de centrifugado y descartar el flujo a través. Repita este paso utilizando otros 350 microlitros de búfer RW1 antes de continuar con el paso siguiente. Agregue 500 microlitros de TAMPón de búfer RPE a la columna de giro.Centrifugar durante 15 segundos a más de 8.000 veces G para lavar la membrana de la columna de centrifugado. Deseche el flujo a través y proceda a repetir este paso agregando otros 500 microlitros de buffer RPE a la columna de giro. Esta vez, centrifugar durante dos minutos a más de 8.000 veces G para lavar la membrana de la columna de centrifugado.Deseche el flujo y coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros y proceda a centrifugar a toda velocidad durante un minuto para eliminar cualquier búfer residual que pueda estar presente en la columna de centrifugado. Deseche el flujo y coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recogida de 1,5 mililitros. Proceda a añadir de 30 a 50 microlitros de agua libre RNase directamente a la membrana de la columna de centrifugado.Centrifugar durante un minuto a más de 8.000 veces G para eluir el ARN de la membrana de la columna de centrifugado. En este punto, el ARN se disuelve en agua libre de RNase y puede almacenarse a menos 80 grados centígrados durante un año. Proceda a cuantificar y comprobar la pureza del ARN que ha aislado utilizando un espectrofotómetro.Usted está buscando un pico en 260 nanómetros, que es ácido nucleico, incluyendo ARN, absorbe al máximo. La cantidad se representa en la parte inferior derecha de la imagen en nanogramos por microlitro. La calidad se puede inferir por la relación 260 230 que se muestra un artículo por encima de la cantidad en la parte inferior derecha de la pantalla.Nuestro enfoque mostró bajos rendimientos de ARN, especialmente cuando purificamos el ARNm de los tejidos cardíacos o de tejidos previamente congelados. Por lo tanto, tenemos que optar por las condiciones para aumentar los rendimientos. Sin embargo, observamos en ratones con deficiencia de CD-36 específicos de la CE, el nivel de ephrina B2 y DLL4 aumentó significativamente tanto en endotelia pulmonar como cardíaca, en comparación con el control.Estos resultados fueron consistentes con nuestros estudios in vitro anteriores, lo que sugiere que la calidad del ARN es suficiente para el análisis posterior. El rendimiento era bajo debido a las estrictas condiciones en nuestro espacio de trabajo. Para superar esta limitación, es fundamental establecer una zona de trabajo libre de RNase y descontaminar superficies de trabajo y equipos que pueden contaminarse con RNase y cambiar los guantes con frecuencia con el fin de extraer ARN de calidad y aumentar los rendimientos.También es fundamental encontrar concentraciones adecuadas de anticuerpos GFP en la matriz de afinidad y utilizar concentraciones adecuadas de inhibidor de la RNase en el tampón de la lesis tisular y utilizar material plástico libre de RNase y reactivos para la extracción de ARN de ribosomas endoteliales de los tejidos dirigidos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Investigación

Bioquímica

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Un método eficiente para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas para uso en el Análisis Cuantitativo de transcriptoma

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células epiteliales intestinales

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón de perfusión

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus (Video) | JoVE 

Purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...