Name: translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

Dr Ren 'in çalışmaları Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenmektedir (13, 14800019; BR), Ann 'in umut Vakfı (FP00011709; BR), Amerikan Kanser Derneği (86-004-26; MCW Kanser Merkezi BR) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (HL136423; BR); Jordan Palmer 2018 MCW CTSı 500 yıldız staj programı tarafından desteklenmektedir; P. Moran, NHLBı 'dan (5T35 HL072483-34) kurumsal araştırma eğitim hibe tarafından desteklenmektedir.

Hayvan deneyleri için burada açıklanan tüm yöntemler Wisconsin tıp Koleji kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. reaktifler hazırlayın
<ol><li>Lizis arabelleği 10 mm HEPES, pH 7,4, 150 mm KCL, 5 mm MgCl2, 0,5 mm DTT, 100 mg/ml cycloheximide, proteaz inhibitörleri ve rekombinant RNase inhibitörleri konsantrasyonları aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.<ol>
<li>500 mL RNase içermeyen deiyonize su için aşağıdaki reak...

<ol>
	<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF/PKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan.">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA/PKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming.">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis.">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).</li><li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond:+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis?.">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?.</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li><li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model.">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA/PKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling.">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish.">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li><li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes.">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li></ol>

Anjiyojenez, EC 'e özgü anjiyojenik Gen transkripsiyonu ve ifadesinin ak farklılaşma ve anjiyojenik reprogramlama3,4' te önemli bir rol oynadığı karmaşık bir çok adımlı süreçtir. Bir moleküler düzeyde memelili vasküler sistemin fonksiyonunu daha iyi anlamak için hücresel çeşitlilik ve mimari karmaşıklığı engelleri aşmak için, biz EC özgü TRAP fareler oluşturduk, EC özgü cd36 ile birlikte , EC özgü PKD-1 eksik...

Meme beyni, kalp ve akciğer gibi kompleks dokularda, yüksek seviyede hücresel heterojenlik, tüm doku örneklerinden elde edilen gen ifade verilerinin analizini zorlaştırmaya çalışmaktadır. Belirli bir hücre türü içinde vivo gen ifade profillerini gözlemlemek için, yeni bir metodoloji son zamanlarda, hangi tüm tercüme mRNA herhangi bir genetik olarak tanımlanan hücre türünün tamamlayıcı sorgulama sağlar geliştirilmiştir. Bu metodoloji tercüme ribozom benzeşimi arıtma (Trap) tekniği1,2olarak bilinir. Genetiği değiştirilmiş diğer anjiyogenesis ile birlikte zaman endotel hücre biyoloji ve anjiyojenezi incelemek için yararlı bir araçtır hayvanlar.
Anjiyojenik PKD-1 sinyalizasyon ve anjiyojenik gen CD36 transkripsiyonu endotel hücre (EC) farklılaşma ve fonksiyonel anjiyogenez3,4,5,6için kritik olduğunu göstermiştir. Gen transkripsiyonu ve EC transfarklılaşmasında anjiyojenik ve metabolik sinyalizasyon moleküler mekanizmalarını belirlemek için, TRAP tekniği temelinde özellikle silinmiş anjiyojenik genler ile genetik olarak tasarlanan TRAP fareler oluşturduk1 , 2. dahası, bizim Trap hayvanlar, sadece onlar PKD-1 veya cd36 gen eksikliği vasküler endotelinde veya cd36 geni küresel silme, ancak gelişmiş bir yeşil floresan protein (EGFP) aynı zamanda genetik üzerine Etiketlenmiş AK 's tercüme ribosomes. TRAP, doğrudan ribosome bağlı mRNA 'nın, hedeflenen dokuların vasküler endothelinden, Gen ifadesinin analizine ve EC farklılaşması ile ilişkili yeni transcriptomlerin tanımlanmasına imkan tanır. doğrudan in vivo koşullarda anjiyogenez. Genetik olarak tasarlanan bu hayvanlarda endotelinde 'dan ribosome bağlı RNA 'yı başarıyla izole ettik. Arıtılmış RNA, ak farklılaşma ve fonksiyonların düzenlenmesinde anjiyojenik veya arteriojen genlerin daha fazla karakterize edilmesi için kullanılabilir. Bu protokol, doğrudan in vivo ECs içinde mRNA yalıtımı için TRAP yaklaşımı uygulamak için adım adım bir kılavuz sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:591px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">G2939AA, 5067-1511 &#38; 5067-1513</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell scrapers</td>
			<td style="width:73px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:123px;">83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">K8855100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Magnet (Dynamag-2)</td>
			<td style="width:73px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">123-21D</td>
			<td>Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">NanoDrop 2000C spectrophotometer</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:73px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5430R</td>
			<td>with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Rnase-free 50-mL conical tubes</td>
			<td style="width:73px;">Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 1000-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 200-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RNase-free 20-&#956;l filter tips</td>
			<td style="width:73px;">Rainin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">RT-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rotor for homogenizers</td>
			<td style="width:73px;">Yamato&#160;</td>
			<td style="width:123px;">LT-400D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tube rotator, Labquake brand</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-687-12Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) for rna isolation from endothelial cells in vivo

Birçok çalışma, in vitro hücresel kullanım ve tüm dokularda veya qPCR ve RNA sıralamaları ile transkriptom ve Gen ifadesinin in vitro analizi için hayvanlardan belirli hücre türlerinin yalıtılması ile sınırlıdır. Kompleks dokularda ve organlardaki spesifik hücre türlerinin kapsamlı transkriptom ve gen ifadesi analizi, genlerin düzenlendiği ve doku homeostaz ve organ ile ilişkisini gösteren hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için önemli olacaktır. Işlev. Bu yazıda, bir örnek olarak hayvan akciğerleri vasküler endotelinde doğrudan içinde vivo ribosome bağlı RNA yalıtım metodolojisi göstermektedir. Doku işleme ve RNA arıtma için özel malzeme ve yordamlar, RNA kalite ve verim yanı sıra gerçek zamanlı qPCR arteriogenic geni için değerlendirilmesi de dahil olmak üzere tarif edilecektir. Ribozom yakınlık arıtma (Trap) tekniği tercüme olarak bilinen bu yaklaşım, karmaşık dokularda herhangi bir belirli tip doğrudan in vivo gen ifade ve transkriptom analiz belirli hücre türlerinin karakterizasyonu için kullanılabilir.

Önceki çalışmalarımız4,7 , CD36, LPA/PKD-1 sinyalizasyon yolu ile arterioler farklılaşma ve kapiller arterializasyonu için bir anahtar olarak işlev gösterebilir. LPA/PKD-1-CD36 sinyalizasyon ekseninin aksı in vivo için gerekli olup olmadığını incelemek için, sadece küresel CD36 eksikliği veya endotel-spesifik-CD36-veya PKD-1 eksikliği olan roman tuzak hatları kurduk, aynı zamanda seçici izolasyon izin CRE işaretli hücre dizinden GFP tara...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Eğer RNA arıtma ile birlikte ribozomlarda içinde gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) EC özgü genetik etiketi ile doğrudan fare beyin, akciğer ve kalp dokularda vasküler endotel hücrelerden (ECS) ribosome bağlı mRNA arındırmak için bir yaklaşım sunuyoruz .

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Merhaba, ben Bin Ren, Alabama Üniversitesi'nde birmingham Tıp Fakültesi'nde cerrahi ve biyomedikal mühendisliği doçentiyim. Laboratuvarımız endotel hücre biyolojisi fonksiyonu anjiyogenez acuogenez bu ortak kardiyovasküler hastalıklar ve kanserler bağlamında ilgi. Araştırma odaklarımızdan biri endotel hücre transdifferentiasyonu ve anjiyogenezin epigenetik ve transkripsiyon düzenlemesidir.Anjiyogenezin transkripsiyonel mekanizmalarını anlamak için, sadece endotel hücrelerinde anjiyogenezle ilişkili belirli genleri siletmekle kalmadık, aynı zamanda geliştirilmiş bir GFP sondasının genetik olarak yerli endotel hücrelerinin ribozomlarına etiketlendiği transgenik mühendislik fare çizgileri oluşturduk. Bu şekilde, ilişkili haberci RNA'nın döngülerini doğrudan transgenik hayvanlarda farklı doku organlarındaki endotel hücrelerinden izole edebilir ve arındırabiliriz. Daha sonra transkript ve transkriptom downstream analizi için saflaştırılmış haberci RNA kullanabilirsiniz.RNA sıralama ve gerçek zamanlı chill PCR ile. Bu videoda, öğrencilerim Patrick Moran ve Jordan Palmer ve araştırma teknisyenleri Nicholas Barnekow ve Rong Yuan size transgenik farelerve doğrudan transgenik hayvanlarda endotel gelen aspire RNA genotipleme bir yaklaşım gösterecektir. Genotipleme, bu protokolün önemli bir ön aşamasında, buzun endotel hücrelerinin ribozomlarında GFP etiketine sahip olmasını sağlamaktır.Tüm downstream RNAi izolasyon adımları GFP etiketli ribozomların varlığına dayandığından, deneye başlamadan önce genotipi belirlemek önemlidir. RNA yalıtımına başlamadan önce birkaç hazırlık adımının tamamlanması gerekir. Bunlar tampon hazırlama ve protein G dina boncuk anti-GFP antikor bağlama içerir.Tamponlar dört santigrat derecede bir aya kadar sürebilir ve antikora bağlı boncuklar dört santigrat derecede bir haftaya kadar sürebilir. Bu nedenle, denemenizi planlarken bu sınırlamaları göz önünde bulundurun. Azı lı homojenleştirici kullanmak RNA verimini artırmak için mükemmel bir yoldur.RNA bozulmasını azaltmak için daha düşük frekans ayarlarını ve süreleri kullandığınızdan emin olun. Daha önce de belirtildiği gibi, genotipleme deneme protokolünde önemli bir ön adımdır. TRAP tekniği kullanılarak RNA'sı izole edilecek farelerin TRAP geni, en azından heterozigotlar için olumlu olmasını sağlamak, ancak TRAP geni için ideal olarak homozigot olması önemli bir adımdır, çünkü GFP etiketinin ribozomüzerinde olmasını sağlamak, deneye başlamadan önce hazırlamış olduğunuz antijen antikor reaksiyonu ve anti-GFP boncuklarını kullanarak aşağı çekmek için gereklidir.Fareden istenilen dokuları izole edin ve mililitre siklohexamide çözeltisi başına 100 mikrogram ile hemen buz gibi bir PBS içine yerleştirin. Bu, çevirinin durdurulmasını ve transkripsinatın ötenaziden önce farenin doğru bir tasviri olmasını sağlar. Bir hücre süspansiyon içine doku homojenize etmek için bir motor tahrikli homogenizer kullanın.İdeal zamanlama ve frekans ayarları, kullanmak ta izinli özel motorlu homogenizer göre tek tek laboratuvar tarafından belirlenmelidir. Çok yüksek bir frekans ayarı kullanmak RNA bozulmasına ve protokolün geri kalanını bozabilir. Deneye başlamadan önce hazırlamanız gereken lisis tamponu içindeki hücre peletini askıya alın.Protokolün geri kalanına geçmeden önce yeterli homojenizasyonu sağlamak için bu karışımı daha da homojenleştirin. Homojeni 10 dakika boyunca 2,000 kez G'de dört derece santifuge'de santrifüj edin. Bu çekirdekleri ve downstream immünenazasyon reaksiyonu ile müdahale edebilir büyük hücresel enkaz pelet olacaktır.Önceki santrifüj adımından supernatant dhpc ve CA-630 lipidler ekleyin. Bu lipidler protein fazlarını diğer hücre içi bileşenlerden ayırmaya yardımcı olur. Süspansiyonu beş dakika buza yerleştirin ve oturmasını bekleyin.13,000 kez G'de 10 dakika boyunca lysate santrifüj herhangi bir çözünür malzeme pelet. Gelecekteki adımlar için net lysate% 15 tutun. Anti-GFP antikor bağlı boncukları hücre lisate supernatant'a ekleyin ve karışımı 4 derece santigrat derecede inkübünle ve son dönüşte 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.Burası anti-GFP antikorlarının GFP etiketli ribozomları bağlayacakları yer. Manyetik raf üzerinde boncuk toplamak ve izolasyon başlamadan önce hazırlamış olacak yüksek tuz polizom yıkama tampon kullanarak beş kez boncuk yıkayın. Boncukları HEMEN RLT arabelleğine yerleştireceğiniz bir sonraki adıma geçin.Lysat'ı tam hızda üç dakika santrifüj edin ve supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve yeni bir mikrofuge tüpüne aktarın. Temizlenen lysate için% 70 etanol bir hacim ekleyin ve pipetleme ile hemen karıştırın. Oluşan herhangi bir çökelti de dahil olmak üzere numunenin 700 mikrolitreye kadarını iki mililitrelik toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa aktaracağınız bir sonraki adıma hemen devam edin.Spin kolon zarını yıkamak için 8.000 kez G'den daha fazla 15 saniye boyunca lysate santrifüj edin. Akışı atın ve bir sonraki adıma geçin. Dönüş sütununa 350 mikrolitre arabellek RW1 ekleyin.Spin sütun membranını yıkamak ve akışı atmak için 8.000 kat Daha fazla 15 saniye santrifüj yapın. Bir sonraki adıma geçmeden önce 350 mikrolitre arabellek RW1 kullanarak bu adımı tekrarlayın. Dönüş sütununa 500 mikrolitre arabellek RPE ekleyin.Spin kolon membranını yıkamak için 8.000 kat G'den daha büyük 15 saniye santrifüj yapın. Akışı atın ve spin sütununa 500 mikrolitre daha arabellek RPE ekleyerek bu adımı tekrarlayın. Bu kez, spin sütun membran yıkamak için 8.000 kez G daha fazla iki dakika santrifüj.Akışı atın ve spin sütununa yeni bir iki mililitrelik toplama tüpüyerleştirin ve dönüş sütununda bulunabilecek artık arabelleği kaldırmak için bir dakika boyunca tam hızda santrifüjedmeye devam edin. Akışı atın ve dönüş sütununu yeni bir 1,5 mililitrelik toplama tüpüne yerleştirin. Spin sütun membranına 30 ila 50 mikrolitre RNase serbest su eklemeye devam edin.Spin kolon membranından RNA'yı elemek için 8.000 kez G'den daha büyük bir dakika için santrifüj. Bu noktada, RNA'nız RNase içermeyen suda çözünür ve bir yıla kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Spektrofotometre kullanarak izole ettiğiniz RNA'nın saflığını ölçmek ve kontrol etmek için devam edin.260 nanometrede bir tepe arıyorsanız, rna da dahil olmak üzere nükleik asit maksimum emer. Miktar mikrolitre başına nanogram görüntünün sağ alt kısmında gösterilmiştir. Kalite, ekranın sağ alt kısmındaki miktarın üzerinde bir madde gösterilen 260 230 oranı ile çıkarılabilir.Yaklaşımımız düşük RNA verimleri gösterdi, özellikle biz kalp dokularından veya daha önce dondurulmuş dokulardan mRNA saflaştırılmış. Bu nedenle verimi artırmak için koşulları optomize gerekir. Ancak, EC spesifik CD-36 eksik farelerde, kontrol ile karşılaştırıldığında hem akciğer hem de kalp endotellerinde efrin B2 ve DLL4 düzeyinin önemli ölçüde arttığını gözlemledik.Bu sonuçlar, RNA kalitesinin akış aşağı analizi için yeterli olduğunu düşündüren önceki in vitro çalışmalarımızla uyumludur. Verim, çalışma alanımızdaki katı koşullar nedeniyle düşüktü. Bu sınırlamayı aşmak için, kaliteli RNA'yı ayıklamak ve verimi artırmak için bir RNa serbest çalışma bölgesi kurmak ve rna ile kirlenebilecek çalışma yüzeylerini ve ekipmanlarını sık sık değiştirmek için çalışmak önemlidir.Ayrıca yakınlık matrisinde uygun GFP antikor konsantrasyonları bulmak ve doku lysis tamponunda uygun RNase inhibitörü konsantrasyonlarının kullanılması ve hedeflenen dokuların endotel ribozomlarından RNA ekstraksiyonu için RNa serbest plastik gereç ler ve reaktifler kullanılması da önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması<emRhipicephalus microplus</em&gt; Epitelyal Gut Hücreleri

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus (Video) | JoVE 

Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...