Name: human blastocyst biopsy and vitrification
Uploaded: 2019-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Blastocyst Biopsy and Vitrification at JoVE.com

وقامت شركة AG وRM بجمع البيانات وصياغة المخطوطة. وقامت العاصمة بتحليل البيانات، وصياغة النتائج التمثيلية، وإجراء الإحصاءات، وتنقيح المخطوطة. وقدمت جامعة فمو وLR مناقشة نقدية للنتائج وللمخطوطة بأكملها.

بروتوكول خزعة الكيسة الكيسية البشرية، هنا وصفها، يتبع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية G.EN.E.R.A.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى جدول المواد للاطلاع على المواد المطلوبة. وتنطوي المواد الأخرى المطلوبة على الأحذية المختبرية والزي، وقناع الوجه الجراح...

<ol>
	<li>Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+stage+versus+blastocyst+stage+embryo+transfer+in+assisted+reproductive+technology.">Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).</li><li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection:+a+meta-analysis.">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Biopsy+on+Human+Embryo+Developmental+Potential+during+Preimplantation+Genetic+Diagnosis.">The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis.</a> Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+standard+blastocyst+morphology,+euploidy+and+implantation:+an+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts.">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+PGD/PGD-A+in+IVF+clinics:+considerations+for+the+best+laboratory+approach+and+management.">Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).</li><li>McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancies+and+live+births+after+trophectoderm+biopsy+and+preimplantation+genetic+testing+of+human+blastocysts.">Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).</li><li>Kokkali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+healthy+infant+following+trophectoderm+biopsy+from+blastocysts+for+PGD+of+beta-thalassaemia+major.">Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major.</a> Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).</li><li>Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preincubation+of+human+oocytes+may+improve+fertilization+and+embryo+quality+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection.</a> Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).</li><li>Wale, P. L., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+chemical+and+physical+factors+on+mammalian+embryo+culture+and+their+importance+for+the+practice+of+assisted+human+reproduction.">The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).</li><li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte,+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART:+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance.">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+blastocyst+features,+trophectoderm+biopsy+and+other+laboratory+practice+with+post-warming+behavior+and+implantation.">Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>Evans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fresh+versus+frozen+embryo+transfer:+backing+clinical+decisions+with+scientific+and+clinical+evidence.">Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence.</a> Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+reproducible+outcomes+of+blastocyst+biopsy+and+aneuploidy+screening+across+different+biopsy+practitioners:+a+multicentre+study+involving+2586+embryo+biopsies.">Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies.</a> Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+mode+and+effects+analysis+of+witnessing+protocols+for+ensuring+traceability+during+PGD/PGS+cycles.">Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles.</a> Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).</li><li>Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inconclusive+chromosomal+assessment+after+blastocyst+biopsy:+prevalence,+causative+factors+and+outcomes+after+re-biopsy+and+re-vitrification.+A+multicenter+experience.">Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+to+blastocyst+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis+and+single+embryo+transfer+at+Sydney+IVF.">Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF.</a> Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).</li><li>Capalbo, A., Rienzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+between+trophectoderm+and+inner+cell+mass.">Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass.</a> Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).</li><li>McCoy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+Selection+against+Complex+Mitotic-Origin+Aneuploidy+during+Preimplantation+Development.">Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).</li><li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not:+a+randomized+and+paired+clinical+trial.">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+births+after+transfer+of+rebiopsy+and+revitrification+of+blastocyst+that+had+&#8220;no+diagnosis&#8221;+following+trophectoderm+biopsy.">Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had &#8220;no diagnosis&#8221; following trophectoderm biopsy.</a> Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions.">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li><li>Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+mitochondrial+DNA+in+blastocoele+fluid+and+embryo+culture+medium:+evidence+and+potential+clinical+use.">Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use.</a> Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).</li><li>Vera-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+composition+of+cell-free+DNA+in+spent+medium+from+human+embryo+culture+during+preimplantation+development.">Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development.</a> Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).</li></ol>

فقط علماء الأجنة المهرة ذوي الخبرة الذين أكملوا فترة تدريبهم يجب أن يقوموا بكل من خزعة TE واستئصال الكيسة الكيسية. وعلاوة على ذلك، يطلب من الشاهد رصد الإجراءات وضمان تتبع فعال خلال i) حركات الكيسة الكيسية الخزعية من طبق الخزعة (الشكلالتكميلي1) إلى طبق ما بعد الخزعة (الشكلالتكمي...

والهدف الرئيسي لعلم الأجنة البشرية الحديثة هو زيادة عدد المواليد الأحياء في كل دورة محفزة إلى أقصى حد وخفض التكاليف والوقت والجهود المبذولة لتحقيق الحمل. ولتحقيق هذا الهدف، ينبغي استخدام نُهُج معتمدة لاختيار الأجنة لتحديد الأجنة المختصة بالإنجاب ضمن مجموعة تم الحصول عليها خلال دورة التلقيح الاصطناعي. وفقا لأحدث الأدلة، ثقافة الكيسة الكيسية1 جنبا إلى جنب مع اختبار الكروموسومات الشاملة ونقل الأجنة euploid المزجج (ET) هو الإطار الأكثر كفاءة لزيادة كفاءة التلقيح الاصطناعي2. ومن الواضح أن اختبار الأنوبلويدي يتطلب عينة جنينية، والتي تمثل في الوقت الحاضر في الغالب من عدد قليل من الخلايا المستردة من التروبسيتوديرم (TE)، أي الجزء من الكيسة الكيسية التي تعطي الأصل لمرفقات الجنين (على سبيل المثال، المشيمة) أثناء الحمل . وإلى جانب تحليل النمط الكاريوبي، يمكن أيضاً تقييم طفرات جينية واحدة من خزعة TE كجزء من استراتيجية سريرية تعرف باسم الاختبارات الجينية قبل الزرع (PGT; -A لداء الأويوبلويدات، -SR لإعادة ترتيب الكروموسومات الهيكلية، -M للأمراض المونوجينية). وقد تم التصورة عن طرق خزعة البويضة/الأجنة الأخرى واعتمدت سريرياً على مدى العقود الماضية، وهي خزعة الأجسام القطبية وخزعة البلابومير. ومع ذلك، فإن استخدامها ينخفض في الوقت الحاضر لأن عيوبها الإجرائية (مثل زيادة عبء العمل وخطر التأثير الإنجابي) والقيود التشخيصية (مثل قضايا تحليل الخلايا الواحدة) تعوق ضمناً تحقيق توازن كاف بين التكاليف والمخاطر و الفوائد (للاطلاع على مراجعة انظر3).
في هذه الورقة، يتم وصف أحد البروتوكولات الرئيسية لخزعة TE بدقة جنبا إلى جنب مع إجراءات التزجيج والاحترار والنقل اللاحقة المطلوبة. سير العمل هنا الموضح مثالي لوحدة PGT مشغول.
كما سبق وصفه من قبل مجموعتنا4،5، ينطوي الإجراء على فتح تسلسلي للبيلوسيدا زونا من الكيسات الكيسية الموسعة بالكامل وإزالة عدد قليل من خلايا TE (في المتوسط 7-8). بالمقارنة مع اليوم 3 بمساعدة الليزر الفقس القائم على الكيسة الكيسية خزعة الأسلوب6، وهذا الإجراء قد يخفف الجدول اليومي لوحدة التلقيح الاصطناعي حيث يجب تنفيذ الإجراءات الدقيقة ، مثل خزعة الكيسة الكيسية والتزجيج ، في الوقت المناسب. بمجرد أن تصل الكيسة الكيسية إلى توسعها الكامل، يمكن إجراء الخزعة عن طريق اختيار خلايا TE لإزالتها، وبالتالي منع خطر فتق كتلة الخلية الداخلية (ICM)، مما يجعل الإجراء صعباً. في الأدب ، تم وصف بروتوكول ثالث من خزعة الكيسة الكيسية أيضا ، والذي ينطوي على إجراء الفقس بمساعدة الليزر بمجرد أن يصل الجنين بالفعل إلى مرحلة الكيسة الكيسية ، قبل ساعات قليلة من الإجراء5،7. ومع ذلك، فإن هذا النهج هو أكثر استهلاكا للوقت ويناسب أساسا وحدات التلقيح الاصطناعي التي تقوم بتنفيذ خزعة TE في أيدي المشغلين ذوي الخبرة المحدودة ونظرا لعبء العمل اليومي المتوسط والمنخفض.
ينبغي أن يكون حقن الحيوانات المنوية داخل التسرّسي (ICSI)8 تقنية موحدة إذا كان الهدف من إجراء التحاليل الوراثية في التلقيح الاصطناعي. وبالمثل، فإن وجود نظام ثقافي مناسب لحصاد الأجنة بأمان إلى مرحلة الكيسة الكيسية الكيسية أمر بالغ الأهمية لتنفيذ استراتيجية خزعة TE. وهناك عدد كاف من الحاضنات، فضلا عن استخدام التوتر الأكسجين المنخفض هي الشروط الأساسية لهذه الغاية، وليس للتنازل عن معدل الكيسة الكيسية9. وفي الوقت نفسه، هناك حاجة إلى برنامج فعال للحفظ بالتبريد لإدارة دورة PGT بأمان. في العقد الماضي، أدى تنفيذ التزجيج إلى زيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بالتبريد في الأجنة حتى تصل إلى > 99%10،11. وقد وفر ذلك وقتاً كافياً لإجراء الاختبارات الجينية وتأجيل نقل الأجنة إلى الدورة الشهرية التالية، على بطانة الرحم غير المحفزة وربما الأكثر تقبلاً12.
كل من خزعة TE والتزجيج تتطلب مهام تتطلب مهارات صارمة وفعاليتها قد تختلف عبر المشغلين عديمي الخبرة. ولذلك، يُدعى إلى فترة تدريب محددة قبل السماح لكل مشغل بإجراء هذه الإجراءات سريرياً؛ وعلاوة على ذلك، ينبغي تقييم الحفاظ على مهارات المشغلين بصورة دورية عن طريق رصد مؤشرات الأداء الرئيسية لإجراءات الحفظ بالتبريد والخزعة. وينبغي لكل عيادة من عيادات التلقيح الاصطناعي أن تضع مؤشرات الأداء الرئيسية الداخلية لهذه الغاية، التي يجب أن تُقارب تلك التي تنشرها الاتحادات الدولية و/أو النتائج التي تنشرها المختبرات المرجعية.
يتم التحقق من صحة الخزعة TE، وتسخين التزجيج، وإجراءات المشاهدة في وحدتنا، التي تم توحيدها عبر جميع المشغلين المعنيين كما ورد في ثلاثة منشورات سابقة11،13،14 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold tube rack</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>XTPCR96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipette controller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>710931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet adjustable handle set</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G18674</td>
			<td>Stripper holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>66003</td>
			<td>p20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Electronic Witness System</td>
			<td>CooperSurgical Fertility &#38; Genomic Solutions</td>
			<td></td>
			<td>RI Witness ART Management System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>IVF TECH</td>
			<td></td>
			<td>Grade A air flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser objective</td>
			<td>RI</td>
			<td>Saturn 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjectors</td>
			<td>Nikon Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge for PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CSLQSPIN</td>
			<td>for 0.2ml PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5AC-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5M-PE</td>
			<td>02/CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-30FB35720</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryolock</td>
			<td>Cryolock</td>
			<td>CL-R-CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSCM complete</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90165</td>
			<td>IVF culture medium supplemented with HSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Transfer Catheter</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G17934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G26712</td>
			<td>140&#181;m stripping pipette tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G46020</td>
			<td>300&#181;m stripping pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-IH35/20</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF One well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil for embryo culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified HTF Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90126</td>
			<td>Hepes-Buffered medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Delta Surface</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td>IVF dish 4-well plate with sliding lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td>60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reproplate</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>83016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable Gilson tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td>200&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Kit</td>
			<td>Provided by the genetic lab</td>
			<td></td>
			<td>PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrification media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT801</td>
			<td>Equilibration and vitrification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>Thawing and dilution solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human blastocyst biopsy and vitrification

يتم إجراء خزعة الكيسة الكيسية للحصول على تشخيص وراثي موثوق به خلال دورات التلقيح الاصطناعي مع الاختبار الوراثي قبل الزرع. ثم، فإن سير العمل المثالي ينطوي على بروتوكول التزجيج آمنة وفعالة، وذلك بسبب الوقت التحول من تقنيات التشخيص ونقل الجنين (الأجنة) المختارة على بطانة الرحم الفسيولوجية في دورة طبيعية التالية. نهج خزعة يشمل فتح تسلسلي للpellucida المنطقة واسترجاع 5-10 خلايا التروبسيتوديرم (من الناحية المثالية 7-8) يحد من كل من عدد التلاعبات المطلوبة والتعرض للجنين لظروف بيئية دون المستوى الأمثل. بعد التدريب المناسب، تم استنساخ هذه التقنية عبر مشغلين مختلفين من حيث توقيت الخزعة (حوالي 8 دقائق، تتراوح 3-22 دقيقة استناداً إلى عدد الأجنة إلى خزعة لكل طبق)، والتشخيصات القاطعة التي تم الحصول عليها (حوالي 97.5٪) ومعدلات المواليد الحية بعد نقل الكيسة الكيسية النيولويدية الدافئة (> 40٪). وكان معدل البقاء على قيد الحياة بعد خزعة، والتزجيج والاحترار يصل إلى 99.8٪. وكان معدل إعادة التوسع في 1.5 ساعة من الاحترار يصل إلى 97٪، ويعتمد إلى حد كبير على التوقيت بين خزعة والتزجيج (من الناحية المثالية ≤ 30 دقيقة)، ونوعية الكيسة الكيسية المورفولوجية ويوم الخزعة. بشكل عام، فمن الأفضل لvitrify الكيسة الكيسية المنهارة. ولذلك، في دورات غير PGT، يمكن إجراء انكماش اصطناعي بمساعدة الليزر للحث على انهيار الجنين قبل الحفظ بالتبريد. المنظور المستقبلي الواعد هو التحليل غير الغازي لوسائل الإعلام الثقافية التلقيح الاصطناعي بعد ثقافة الكيسة الكيسية كمصدر مفترض للحمض النووي الجنيني. ومع ذلك، لا تزال هذه الطليعة المحتملة قيد التحقيق، ومع ذلك لا بد من تحديد بروتوكول موثوق به والتحقق من صحته.

يمثل الشكل 6 مخططًا لجميع نتائج إجراء الخزعة الذي يمكن اعتماده لتوحيد البروتوكول ورصد أداء كل مشغل. والنتيجة الإجرائية الرئيسية هي توقيت إكمال الخزعة/الخزعات؛ النتيجة التقنية الرئيسية هي نوعية المؤامرة التي تنتج بعد الاختبارات الجينية التي قد تؤدي إما ?...

Watch this Scientific Journal Video about Human Blastocyst Biopsy and Vitrification at JoVE.com

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

الخزعة الكيسية الكيسية والتزجيج مطلوبان لإجراء اختبارات جينية قبل الزرع بكفاءة. نهج ينطوي على فتح تسلسلي للpellucida المنطقة واسترجاع 7-8 خلايا التروبسيتوديرم في اليوم 5-7 بعد التلقيح يحد من كل من عدد التلاعبات المطلوبة والتعرض للجنين لظروف بيئية دون الأمثل.

خزعة الكيسة الكيسية البشرية والتزجيج

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

وقد كانت كل من خزعة الكيس الفوتيست والتجويل ثورة في التلقيح الاصطناعي، والتخصيب في المختبر، مما يسمح لأطباء الأجنة من جميع أنحاء العالم لإجراء الاختبارات الجينية قبل الزرع على الأجنة البشرية مع الحد الأدنى من المخاطر على الجنين. سمحت خزعة تروفكتوديرم باستعادة حوالي سبع خلايا من جنين كامل النمو، مما مكن من إجراء تحليل وراثي قوي للمصب. وعلاوة على ذلك، لم يظهر أي أثر لهذا النهج حتى الآن.الكفاءة السريرية لهذا العمل يسمح للمرضى الذين يعانون من ظروف أحادية وجميع هؤلاء المرضى الذين يعانون من زيادة خطر الشذوذ الكروموسومات داخل الكيسة البلاستك للاستفادة من التجارب الجينية قبل الزرع. ولا يزال هناك مجال لتحسين الاستراتيجيات الحالية لاختيار الأجنة. على سبيل المثال، يمثل التنميط البروتومي والبروتيومي خيارات مثيرة للاهتمام لاستكمال الاختبارات الجينية قبل الزرع على خزعة واحدة من الترومنكتد.المشغلين غير تجربة غالبا ما النضال مع فتح واختراق pellucida زونا. إنها مسألة تركيز فقط وينبغي أن يكون الكيسة blastocyst ، والهدف ليزر ، والماصات على نفس المستوى البؤري.بعد وضع علامة على طبق الخزعة مع تفاصيل المريض ، مع علامة دائمة غير سامة ، عدد كل قطرة 10 ميكرولتر من المتوسط العازلة من HEPES مع الجنين ودورة ID.Using 300 ميكرومتر تجريد ماصة ، ونقل قابلة للحياة ، وتوسيع كامل الكيسة الأرمصة إلى أول قطرة من طبق الخزعة وشطف قطرة لإزالة المتوسط الثقافة الزائدة ، قبل تحريك الكيسة البلاستكية في قطرة ثانية في الطبق. ضع الطبق تحت مجهر مقلوب، وافتحي ماصة الخزعة مع متوسطة من القطرة الثالثة من طبق الخزعة. تحت التكبير 20 مرة، وتوجيه الكيسة للحصول على رؤية واضحة للكتلة الخلية الداخلية في الساعة السابعة، وتأمين الجنين على ماصة عقد.التركيز على pellucida زونا بحيث كل من الماصات وsspsocyst على نفس المستوى البؤري. التبديل إلى الهدف ليزر، ووضع مؤشر الليزر على pellucida زونا في الجانب الآخر من كتلة الخلية الداخلية. حفر pellucida زونا مع اثنين إلى ثلاثة نبضات الليزر، واضغط بلطف ماصة خزعة ضد pellucida زونا للسماح المتوسطة ليتم في مهب من خلال خرق لفصل الخلايا تروفكتديرم من السطح الداخلي.عندما يتم فصل trophectoderm، أدخل من خلال ثقب وpirate سبعة إلى ثمانية الخلايا التروفيكتودرم في ماصة خزعة مع شفط لطيف. أثناء تطبيق شفط معتدل لتمتد الخلايا المستهدفة، قليلا تحريك ماصة خزعة إلى الوراء وتوجيه الليزر نحو أنحف جزء من الخلايا المستنشقة. إطلاق نبضات ليزر 2-5 عند تقاطعات بين الخلايا لفصل الخلايا المستهدفة من جسم الجنين.عندما تم فصل جزء trophectoderm من الكيسة، والإفراج عن جزء في نفس قطرة خزعة بعيدا عن الكيسة لمنع جزء من امتص مرة أخرى في ماصة خزعة. الافراج عن الكيسة من الماصات عقد، ورفع على الفور كل من الماصات لمنع جزء من التمسك الماصات. ثم صورة جزء من الخزعة لأغراض مراقبة الجودة.عندما تم خزعة جميع البلاستوسيست كما أظهرت للتو، نقل طبق الخزعة مرة أخرى إلى غطاء محرك التدفق الفاتنة وتسمية طبق ثقافة ما بعد الخزعة مع معرف الزوجين وكل قطرة مع معرفات الجنين ودورة. في وجود شاهد، شطف الكيسة في وسيط التلقيح الاصطناعي نظيفة ونقل الكيسة إلى انخفاض المقابلة لها في طبق ما بعد الخزعة. ثم ضع طبق ما بعد الخزعة إلى 37 درجة مئوية ، 6 ٪ ثاني أكسيد الكربون ، وحاضنة الأكسجين 5٪.في وجود الشاهد وداخل غطاء محرك تدفق المفارق في درجة حرارة الغرفة، وتسمية أنابيب PCR مع علامة دائمة وغير سامة. تسمية غطاء من 60 × 15 ملليمتر حوض طبق ثقافة مع بطاقات العهون الجنين، وإضافة اثنين من قطرات 10 ميكرولتر من محلول غسل خزعة إلى الطبق. رئيس 140 ميكرومتر تجريد ماصة مع محلول غسل خزعة من قطرة الثانية من طبق الأنابيب تحت المجهر ستيريو لتصور شظايا trophectoderm.الإفراج بلطف بعض محلول الغسيل خزعة على جزء trophectoderm، وتحميل جزء في ماصة تجريد. نقل جزء إلى قطرة ثانية من محلول غسل الخزعة، وشطف بعناية الأنسجة مرتين إلى ثلاث مرات. نقل جزء trophectoderm إلى الجزء السفلي من أنبوب PCR المسمى بشكل مناسب مع حل التحميل، مع الحرص على تجنب لمس جدران الأنبوب مع غيض من ماصة تجريد.عندما يتم إضافة جميع الشظايا إلى أنابيبها، تدور جميع الأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير لبضع ثوان لرواسب الشظايا. ثم تخزين العينات في ناقص 20 درجة مئوية حتى يتم شحنها إلى المختبر الوراثي الإحالة للاختبار. في غضون 30 دقيقة من خزعة التروستروم، تسمية لوحة التعبئة مع تفاصيل المريض و بطاقات من البلاستوسيست التي يجب أن تكون vitrified.باستخدام كريولاbels الباردة المقاومة للحرارة الخاصة، تسمية يدعم vitrification مع اسم المريض ولقبه، معرف الزوجين، معرف الجنين الذي سيتم تحميلها على ذلك، وتاريخ الإجراء. في درجة حرارة الغرفة، الاستغناء 300 ميكرولترات من محلول التوازن لكل blastocyst التي سيتم vitrified و، في وجود شاهد، واستخدام ماصة تجريد 300 ميكرومتر لنقل الكيسة في حجم واحد من محلول التوازن. اترك الكيسة في محلول التوازن لمدة 13 إلى 15 دقيقة.بعد انكماش أولي للحجم، سيتم ملاحظة إعادة التوسع التدريجي. في نهاية التوازن، إضافة 300 ميكرولترات من محلول التبريب إلى البئر الثاني من لوحة التبزج ونقل البلاستوسيست إعادة توسيع تماما إلى حل vitrification لمدة دقيقة واحدة. في نهاية الحضانة ، شطف الكيسة لتمييع محلول التوازن ، وفي وجود شاهد ، قم بتحميل الكيسة على دعم التبريب.إزالة فائض من محلول الtrification. يجب أن يحيط فيلم دقيق من الحل بـ blastocyst. يغرق دعم الزج في النيتروجين السائل، ونقل بقوة الدعم للحد من خطر تشكيل فقاعة قريبة من العينة.ثم ضع الغطاء الواقي على الدعم بينما لا يزال دعم التزجيج مغمورًا في النيتروجين السائل. من 1,544 إجراءات خزعة trophectoderm التي أجريت على مدى هذه الفترة التمثيل سنتين, ما بين واحد إلى أربعة الكيسات البلاستيك كانت خزعة لكل إجراء لمدة تتراوح بين ثلاث إلى 22 دقيقة لكل إجراء. في هذه المؤامرات، يتم عرض متوسط توقيت الخزعة لكل عامل على طول الثلث الدراسي، مع متوسط القيمة الإجمالية من 8.24 دقيقة.ومن المفيد الحصول على صورة لكل جزء من الخزعات لأغراض مراقبة الجودة لتقييم ما إذا كان سبب التشخيصات غير الحاسمة يعزى إلى بُعد و/أو نوعية الشظية، أو إلى الأنابيب، أو إلى بعض المسائل المتعلقة بمعالجة العينة في المختبر الوراثي. في هذه الدراسة، تم تسخين 572 من البلاستوسيستات الولبية للخضوع لنقل الجنين بعد تشخيص الأوبلويدي. جميع البلاستوسيستات vitrified في غضون 30 دقيقة، مع 2.4٪ من الكيسات لا إعادة توسيع بين 31 و 90 دقيقة و 4.9٪ لا إعادة توسيع بعد 90 دقيقة من إعادة الدفء.خاصة بالنسبة لسوء نوعية و / أو اليوم السابع من الكيسات ، يبدو التوقيت بين الخزعة والتزجيج أمرًا حاسمًا لتحقيق إعادة التوسع بعد الاحترار. الحرص على التركيز قبل فتح zona pellucida عند تعريض تقاطع بين خلية trophectoderm واطلاق النار، والحرص أيضا على منع blastocyst إعادة التوسع قبل vitrification. يوجد نهجان آخران من أساليب الخزعة البلاستكية، وكلاهما ينطوي على فتح زونا بيلوسيدا وانتظار تقوس عفوي من خلايا تروفكتوديرم.وهذه النهج أسهل ولكنها تتطلب المزيد من التلاعبات وتستغرق وقتاً أطول. فعالية هذا العمل يسمح بتنفيذ التقنيات الجزيئية في التلقيح الاصطناعي من أجل محاولة لتحديد الكيسة مع أكبر فرصة لزرع قبل نقل الجنين. تذكر عدم استخدام أي جهاز أو حل قد يكون سامًا للأجنة ومنع تلوث الحمض النووي باستخدام مواد خالية من الحمض النووي.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

زراعة متعددة القدرات البشرية والعصبية الخلايا الجذعية في نظام زراعة الخلايا المغلقة للبحوث الأساسية وقبل السريرية

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

تعديل التزجيج MicroSecure: وفعالة للغاية إجراء الحفظ بالتبريد آمنة وبسيطة والكيسات الأريمية الإنسان

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

العزلة والثقافة والتوصيف والتمايز بين خلايا ذرية العضلات البشرية من إجراء خزعة العضلات الهيكلية

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

تحديد كثافة القناة الصفراوية في كبد الفأر

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

تقييم نضج البويضة البشرية وتطبيقها السريري

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...