Name: human blastocyst biopsy and vitrification
Uploaded: 2019-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Blastocyst Biopsy and Vitrification at JoVE.com

AG en RM hebben de gegevens verzameld en het manuscript opgesteld. DC analyseerde de gegevens, stelde de representatieve resultaten voor, voerde de statistieken uit en reviseerde het manuscript. FMU en LR hebben een kritische bespreking van de resultaten en van het hele manuscript gegeven.

Het protocol voor humane blastocyst biopsie, hier beschreven, volgt de richtlijnen van G. EN. milieurisicobeoordeling van menselijk onderzoek.
Opmerking: Raadpleeg de materiaal tabel voor de benodigde materialen. Verder materiaal nodig omvat laboratorium schoeisel en uitrusting, chirurgische gelaatsmasker, haar deksel, chirurgische handschoenen, een permanente niet-giftige marker, Tang en ontsmettingsmiddel. Het gebruik van chirurgische Gown, wegwerp chirurgis...

<ol>
	<li>Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+stage+versus+blastocyst+stage+embryo+transfer+in+assisted+reproductive+technology.">Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).</li><li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection:+a+meta-analysis.">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Biopsy+on+Human+Embryo+Developmental+Potential+during+Preimplantation+Genetic+Diagnosis.">The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis.</a> Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+standard+blastocyst+morphology,+euploidy+and+implantation:+an+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts.">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+PGD/PGD-A+in+IVF+clinics:+considerations+for+the+best+laboratory+approach+and+management.">Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).</li><li>McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancies+and+live+births+after+trophectoderm+biopsy+and+preimplantation+genetic+testing+of+human+blastocysts.">Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).</li><li>Kokkali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+healthy+infant+following+trophectoderm+biopsy+from+blastocysts+for+PGD+of+beta-thalassaemia+major.">Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major.</a> Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).</li><li>Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preincubation+of+human+oocytes+may+improve+fertilization+and+embryo+quality+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection.</a> Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).</li><li>Wale, P. L., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+chemical+and+physical+factors+on+mammalian+embryo+culture+and+their+importance+for+the+practice+of+assisted+human+reproduction.">The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).</li><li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte,+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART:+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance.">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+blastocyst+features,+trophectoderm+biopsy+and+other+laboratory+practice+with+post-warming+behavior+and+implantation.">Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>Evans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fresh+versus+frozen+embryo+transfer:+backing+clinical+decisions+with+scientific+and+clinical+evidence.">Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence.</a> Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+reproducible+outcomes+of+blastocyst+biopsy+and+aneuploidy+screening+across+different+biopsy+practitioners:+a+multicentre+study+involving+2586+embryo+biopsies.">Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies.</a> Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+mode+and+effects+analysis+of+witnessing+protocols+for+ensuring+traceability+during+PGD/PGS+cycles.">Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles.</a> Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).</li><li>Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inconclusive+chromosomal+assessment+after+blastocyst+biopsy:+prevalence,+causative+factors+and+outcomes+after+re-biopsy+and+re-vitrification.+A+multicenter+experience.">Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+to+blastocyst+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis+and+single+embryo+transfer+at+Sydney+IVF.">Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF.</a> Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).</li><li>Capalbo, A., Rienzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+between+trophectoderm+and+inner+cell+mass.">Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass.</a> Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).</li><li>McCoy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+Selection+against+Complex+Mitotic-Origin+Aneuploidy+during+Preimplantation+Development.">Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).</li><li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not:+a+randomized+and+paired+clinical+trial.">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+births+after+transfer+of+rebiopsy+and+revitrification+of+blastocyst+that+had+&#8220;no+diagnosis&#8221;+following+trophectoderm+biopsy.">Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had &#8220;no diagnosis&#8221; following trophectoderm biopsy.</a> Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions.">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li><li>Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+mitochondrial+DNA+in+blastocoele+fluid+and+embryo+culture+medium:+evidence+and+potential+clinical+use.">Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use.</a> Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).</li><li>Vera-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+composition+of+cell-free+DNA+in+spent+medium+from+human+embryo+culture+during+preimplantation+development.">Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development.</a> Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).</li></ol>

Alleen goed ervaren, bekwame embryo logen die hun trainingsperiode hebben voltooid, moeten zowel TE biopsie als blastocyst vitrificatie uitvoeren. Bovendien is een getuige vereist om de procedures te monitoren en een efficiënte traceerbaarheid te garanderen tijdens i) de bewegingen van de biopsied blastocyst uit de biopsie schotel (aanvullend figuur 1) naar de post-biopsie schotel (aanvullend figuur 1 ), vervolgens op de vitrificatie plaat (aanvullend figuur 1) en ten s...

Het belangrijkste doel van de moderne menselijke embryologie is om het aantal levende geboorten per gestimuleerde cyclus te maximaliseren en kosten, tijd en inspanningen om een zwangerschap te bereiken te verminderen. Om dit doel te bereiken, moeten gevalideerde benaderingen voor embryoselectie worden gebruikt om reproductief bevoegde embryo's te identificeren binnen een cohort die tijdens een IVF-cyclus is verkregen. Volgens de laatste bewijzen is blastocyst Culture1 in combinatie met uitgebreide chromosomale testen en verglaasd euploïde embryo transfer (et) het meest efficiënte kader om IVF-efficiëntie2te verhogen. Het is duidelijk dat een aneuploïdie test een embryonaal specimen vereist, dat op dit moment meestal wordt weergegeven uit enkele cellen die worden opgehaald uit de trophectoderm (TE), d.w.z. het gedeelte van de blastocyst dat oorsprong geeft aan de embryonale bijlagen (bijv. de placenta) tijdens de zwangerschap . Naast de karyotype analyse, kunnen ook enkelvoudige genmutaties worden beoordeeld vanuit een TE biopsie als onderdeel van een klinische strategie die bekend staat als pre-implantatie genetische tests (PGT;-A voor aneuploidies,-SR voor structurele chromosomale herschikkingen,-M voor monogene ziekten). Andere methoden van eicel/embryo biopsie zijn theorie en de laatste decennia klinisch aangenomen, namelijk polaire lichamen biopsie en blastomere biopsie. Het gebruik ervan wordt tegenwoordig echter verminderd, omdat hun procedurele nadelen (bijv. hogere werklast en risico op reproductieve impact) en diagnostische beperkingen (bijv. problemen met één cel-analyse) impliciet een voldoende evenwicht tussen kosten, Risico's en voordelen (voor een beoordeling Zie3).
In dit document wordt een van de belangrijkste protocollen voor TE biopsie grondig beschreven, samen met de daaropvolgende verglavering, opwarming en overdrachtsprocedures vereist. De werkstroom die hier wordt geschetst is ideaal voor een drukke PGT-eenheid.
Zoals al eerder beschreven door onze groep4,5, de procedure omvat de sequentiële opening van de zona pellucida van volledig geëxpandeerde blastocysten en verwijdering van enkele te cellen (gemiddeld 7-8). Vergeleken met de dag 3 Laser-geassisteerde hatching gebaseerde blastocyst biopsie methode6, deze procedure zou kunnen verlichten het dagelijkse schema van een IVF-eenheid waar delicate procedures, zoals blastocyst biopsie en vitrificatie, moet tijdig worden uitgevoerd. Zodra de blastocyst zijn volledige expansie bereikt, kan de biopsie worden uitgevoerd door het selecteren van de TE cellen te verwijderen, waardoor het risico van herniatie van de binnenste celmassa (ICM), die anders de procedure uitdagend zou maken. In de literatuur is ook een derde Protocol van blastocyst biopsie beschreven, waarbij Laser-geassisteerde broedeieren worden uitgevoerd zodra het embryo al het blastocyst-stadium heeft bereikt, enkele uren voor de procedure5,7. Deze aanpak is echter meer tijdrovend en is vooral geschikt voor IVF-eenheden die TE biopsie uitvoeren in de handen van limitedly ervaren exploitanten en met het oog op een gematigde en lage dagelijkse werklast.
Intracytoplasmatische sperma injectie (ICSI)8 moet een geconsolideerde techniek zijn als het gaat om het uitvoeren van genetische analysen in IVF. Evenzo is een goed cultuur systeem om embryo's veilig te oogsten in de blastocyst-fase van cruciaal belang voor de uitvoering van de biopsie strategie. Een voldoende aantal incubators, evenals het gebruik van lage zuurstofspanning zijn belangrijke voorwaarden voor dit doel, niet te compromitteren de blastocyst rate9. Tegelijkertijd is een efficiënt cryopreservatie-programma nodig om een PGT-cyclus veilig te beheren. In de afgelopen tien jaar heeft de implementatie van vitrificatie de embryo Cryo-overlevingskansen zelfs tot > 99%10,11versterkt. Dit voorzag in voldoende tijd om genetische tests uit te voeren en embryo-overdracht uit te stellen naar de volgende menstruatiecyclus, op een niet-gestimuleerd en waarschijnlijk ontvankelijker endometrium12.
Zowel de biopsie als de vitrificatie zijn veeleisende taken waarvoor strenge vaardigheden nodig zijn en de effectiviteit ervan kan variëren tussen niet-ervaren operators. Een specifieke opleidingsperiode wordt daarom bepleit voordat elke exploitant deze procedures klinisch kan uitvoeren; Bovendien moet de instandhouding van de vaardigheden van de exploitanten periodiek worden geëvalueerd door monitoring van Key Performance Indicators (KPI) voor cryopreservatie en biopsie procedures. Elke IVF-kliniek moet daartoe interne Kpi's instellen, die de door internationale consortia gepubliceerde en/of de door de referentielaboratoria gepubliceerde uitkomsten moeten benaderen.
TE biopsie, vitrificatie-opwarming en getuige procedures zijn gevalideerde technieken in onze eenheid, die zijn gestandaardiseerd in alle betrokken operatoren zoals gerapporteerd in drie eerdere publicaties11,13,14 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold tube rack</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>XTPCR96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipette controller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>710931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet adjustable handle set</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G18674</td>
			<td>Stripper holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>66003</td>
			<td>p20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Electronic Witness System</td>
			<td>CooperSurgical Fertility &#38; Genomic Solutions</td>
			<td></td>
			<td>RI Witness ART Management System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>IVF TECH</td>
			<td></td>
			<td>Grade A air flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser objective</td>
			<td>RI</td>
			<td>Saturn 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjectors</td>
			<td>Nikon Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge for PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CSLQSPIN</td>
			<td>for 0.2ml PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5AC-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5M-PE</td>
			<td>02/CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-30FB35720</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryolock</td>
			<td>Cryolock</td>
			<td>CL-R-CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSCM complete</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90165</td>
			<td>IVF culture medium supplemented with HSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Transfer Catheter</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G17934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G26712</td>
			<td>140&#181;m stripping pipette tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G46020</td>
			<td>300&#181;m stripping pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-IH35/20</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF One well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil for embryo culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified HTF Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90126</td>
			<td>Hepes-Buffered medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Delta Surface</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td>IVF dish 4-well plate with sliding lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td>60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reproplate</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>83016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable Gilson tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td>200&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Kit</td>
			<td>Provided by the genetic lab</td>
			<td></td>
			<td>PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrification media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT801</td>
			<td>Equilibration and vitrification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>Thawing and dilution solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human blastocyst biopsy and vitrification

Blastocyst biopsie wordt uitgevoerd om een betrouwbare genetische diagnose te verkrijgen tijdens IVF-cycli met pre-implantatie genetische testen. De ideale workflow omvat dan een veilig en efficiënt vitrificatie protocol, door de doorlooptijd van de diagnostische technieken en om de geselecteerde embryo (s) over een fysiologisch endometrium over te brengen in een volgende natuurlijke cyclus. Een biopsie benadering die de sequentiële opening van de zona pellucida omvat en het opvragen van 5-10 trophectoderm cellen (idealiter 7-8) beperkt zowel het aantal benodigde manipulaties als de blootstelling van het embryo aan suboptimale omgevingscondities. Na de juiste training, de techniek was reproduceerbaar over verschillende exploitanten in termen van timing van biopsie (~ 8 min, variërend 3-22 min op basis van het aantal embryo's tot biopsie per gerecht), definitieve diagnoses verkregen (~ 97,5%) en levende geboortecijfers na verglaasd-opgewarmde euploïde blastocyst overdracht (> 40%). De overlevingskans na biopsie, vitrificatie en opwarming was zo hoog als 99,8%. De re-expansie snelheid bij 1,5 uur van opwarming van de aarde was zo hoog als 97%, grotendeels afhankelijk van de timing tussen biopsie en vitrificatie (idealiter ≤ 30 min), blastocyst morfologische kwaliteit en de dag van de biopsie. In het algemeen is het beter om een ingeklapte blastocyst te vitrificeren; Daarom kan in niet-PGT-cycli lasergeassisteerde kunstmatige krimp worden uitgevoerd om embryo-instorting voorafgaand aan cryopreservation te induceren. Het meest veelbelovende toekomstperspectief is de niet-invasieve analyse van de IVF-cultuur media na de blastocyst-cultuur als een bron van embryonaal DNA. Deze potentiële avant-garde wordt echter nog steeds onderzocht en een betrouwbaar protocol moet nog worden gedefinieerd en gevalideerd.

Figuur 6 vertegenwoordigt een schema van alle uitkomsten van een biopsie procedure die kunnen worden vastgesteld om het protocol te standaardiseren en de prestaties van elke operator te bewaken. De belangrijkste procedurele uitkomst is de timing voor het voltooien van de biopsie/biopsieën; de belangrijkste technische uitkomst is de kwaliteit van het perceel dat wordt geproduceerd na genetische tests die kunnen resulteren in een afdoende of twijfelachtige dia...

Watch this Scientific Journal Video about Human Blastocyst Biopsy and Vitrification at JoVE.com

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Blastocyst biopsie en vitrificatie zijn vereist voor het efficiënt uitvoeren van preimplantatie genetische testen. Een aanpak die de sequentiële opening van de zona pellucida en het ophalen van 7-8 trophectoderm cellen in dag 5-7 post-inseminatie beperkt zowel het aantal benodigde manipulaties en de blootstelling van het embryo aan suboptimale omgevingscondities.

Menselijke blastocyst biopsie en vitrificatie

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Zowel blastocyst biopsie en vitrification zijn een revolutie in IVF, in vitro fertilisatie, waardoor embryologen uit de hele wereld preimplantatie genetische testen op menselijke embryo's met een minimaal risico voor het embryo uit te voeren. Trophectoderm biopsie heeft het ophalen van ongeveer zeven cellen uit een volgroeid embryo mogelijk gemaakt, waardoor robuuste downstream genetische analyse mogelijk werd. Bovendien is tot op heden geen effect op deze aanpak aangetoond.De klinische efficiëntie van deze workflow stelt patiënten met monogene aandoeningen en al die patiënten met een verhoogd risico op chromosomale afwijkingen binnen hun blastocyst in staat om te profiteren van preimplantatie genetische tests. Er is nog ruimte voor het verbeteren van de huidige strategieën van embryoselectie. MiRNomic en proteomische profilering vormen bijvoorbeeld intrigerende opties om preimplantatiegeneticatesten op één trophectodermbiopsie aan te vullen.Onervaren operators worstelen vaak met het openen en penetreren van de zona pellucida. Het is gewoon een kwestie van focus. De blastocyst, laser doelstelling, en pipetten moeten op hetzelfde brandpuntsvlak.Na het labelen van de biopsie schotel met de gegevens van de patiënt, met een permanente, niet-toxische marker, nummer elke 10-microliter druppel van HEPES-gebufferd medium met het embryo en de cyclus ID.Using een 300-micrometer strippen pipet, breng een levensvatbare, volledig uitgebreide blastocyst naar de eerste druppel van de biopsie schotel en spoel de druppel om de overtollige cultuur medium te verwijderen, voordat u de blastocyst in de tweede druppel in de schotel. Plaats de schotel onder een omgekeerde microscoop, en prime de biopsie pipet met medium uit de derde druppel van de biopsie schotel. Onder een 20 keer vergroting, oriënteren van de blastocyst om een duidelijk zicht op de binnenste cel massa te verkrijgen op zeven uur, en zet het embryo op het bedrijf pipet.Focus op de zona pellucida, zodat zowel de pipetten als de blastocyst zich op hetzelfde brandpuntsvlak bevinden. Schakel over naar de laserdoelstelling en plaats de laseraanwijzer op de zona pellucida aan de andere kant van de binnenste celmassa. Boor de zona pellucida met twee tot drie laserpulsen en druk de biopsiepipet voorzichtig tegen de zona pellucida om het medium door de breuk te laten blazen om de trophectodermcellen los te maken van het interne oppervlak.Wanneer het trophectoderm wordt losgemaakt, gaat u door het gat en zuigt zeven tot acht trophectodermcellen in de biopsiepipet met zachte zuigkracht. Terwijl u een matige zuigkracht toepast om de doelcellen uit te rekken, beweegt u de biopsiepipet lichtjes naar achteren en leidt u de laser naar het dunste deel van de aangezogen cellen. Vuur twee tot vijf laserpulsen af op de verbindingen tussen de cellen om de doelcellen te scheiden van het lichaam van het embryo.Wanneer het trophectodermfragment is gescheiden van de blastocyst, laat u het fragment los in dezelfde biopsiedruppel ver van de blastocyst om te voorkomen dat het fragment weer in de biopsiepipet wordt gezogen. Laat de blastocyst los van de houdpijp en hef beide pipetten onmiddellijk op om te voorkomen dat het fragment aan pipetten blijft plakken. Beeld vervolgens het gebiopte fragment voor kwaliteitscontroledoeleinden.Wanneer alle blastocysten zijn biopten zoals net aangetoond, verplaats de biopsie schotel terug naar de laminaire flow kap en label de post-biopsie cultuur schotel met het paar ID en elke druppel met het embryo en cyclus ID's. In aanwezigheid van een getuige, spoel de blastocyst in schoon IVF-medium en verplaats de blastocyst naar de overeenkomstige daling in de post-biopsie schotel. Plaats vervolgens de post-biopsie schotel tot een 37-graden Celsius, 6%kooldioxide, en 5% zuurstof incubator.In aanwezigheid van de getuige en in een laminaire stroomkap bij kamertemperatuur, label de PCR-buizen met een permanente, niet-toxische marker. Label het deksel van een 60 x 15-millimeter buizenkweekschotel met de biopsied embryo-id's en voeg twee 10-microliter druppels biopsiewasoplossing toe aan de schotel. Prime een 140-micrometer strippen pipet met biopsie wassen oplossing van de tweede druppel van de buisschotel onder de stereo microscoop om de trophectoderm fragmenten visualiseren.Laat voorzichtig een biopsiewasoplossing los op het trophectodermfragment en laad het fragment in de strippijp. Verplaats het fragment naar de tweede druppel biopsiewasoplossing en spoel het weefsel twee tot drie keer zorgvuldig af. Breng het trophectodermfragment met de punt van de strippijp naar de bodem van de juiste gelabelde PCR-buis, waarbij u ervoor zorgt dat de wanden van de buis niet met de punt van de strippipet raken.Wanneer alle fragmenten zijn toegevoegd aan hun buizen, draai alle buizen in een mini-centrifuge voor een paar seconden om sediment de fragmenten. Bewaar de monsters vervolgens op min 20 graden Celsius totdat ze worden verzonden naar het verwijzende genetische laboratorium voor het testen. Label binnen 30 minuten na trophectodermbiopsie een vitrificatieplaat met de gegevens van de patiënt en de id's van de blastocysten die moeten worden verglaasd.Met behulp van speciale koude temperatuur-resistente cryolabels, label de vitrificatie ondersteunt met de naam van de patiënt en achternaam, paar ID, ID van het embryo dat zal worden geladen op het, en de datum van de procedure. Bij kamertemperatuur, 300 microliter van evenwichtsoplossing voor elke blastocyst die zal worden verglaasd en, in aanwezigheid van een getuige, gebruik maken van een 300-micrometer strippen pipet om de blastocyst te verplaatsen in een volume van evenwicht oplossing. Laat de blastocyst 13 tot 15 minuten in de evenwichtsoplossing.Na een eerste krimp van het volume zal een geleidelijke heruitbreiding worden waargenomen. Voeg aan het einde van de evenwichtsoplossing 300 microliter vitrificatieoplossing toe aan de tweede put van de vitrification-plaat en breng de volledig opnieuw uitgebreide blastocyst gedurende één minuut over naar de vitrificatieoplossing. Spoel aan het einde van de incubatie de blastocyst af om de evenwichtsoplossing te verdunnen en laad de blastocyst in aanwezigheid van een getuige op de vitrificatieondersteuning.Verwijder de overmaat aan vitrificatieoplossing. Een subtiele film van oplossing moet de blastocyst omringen. Dompel de vitrificatiesteun in vloeibare stikstof en verplaats de steun krachtig om het risico op bellenvorming dicht bij het monster te verminderen.Plaats vervolgens de beschermkap op de steun, terwijl de vitrification-ondersteuning nog steeds onder water staat in vloeibare stikstof. Van de 1, 544 trophectoderm biopsie procedures uitgevoerd over deze representatieve periode van twee jaar, tussen de een tot vier blastocysten werden biopsied per procedure voor tussen de drie tot 22 minuten per procedure. In deze percelen wordt de gemiddelde timing van de biopsie voor elke operator langs de studietristers weergegeven, met een gemiddelde totale waarde van 8,24 minuten.Het is nuttig om een beeld van elk gebiopt fragment te verkrijgen voor kwaliteitscontroledoeleinden om te beoordelen of de oorzaak van niet-overtuigende diagnoses te maken had met de dimensie en/of kwaliteit van het fragment, aan de slang of aan enkele problemen bij de verwerking van het monster in het genetische laboratorium. In deze studie werden 572 euploïde blastocysten opgewarmd om een embryotransfer te ondergaan na een diagnose van euploidy. Alle blastocysten verglaasd binnen 30 minuten, met 2,4% van de blastocysten niet opnieuw uit te breiden tussen 31 en 90 minuten en 4,9%niet opnieuw uit te breiden dan 90 minuten na het opwarmen.Vooral voor slechte kwaliteit en/of dag zeven blastocys, lijkt de timing tussen biopsie en vitrificatie cruciaal om na opwarming opnieuw uit te breiden. Zorg ervoor dat u zich concentreert voordat u de zona pellucida opent bij het blootstellen van de kruising tussen de trophectodermcel en het afvuren, en zorg er ook voor om blastocyst re-expansie voor vitrification te voorkomen. Twee andere blastocyst biopsie benaderingen bestaan, zowel met zona pellucida openen en wachten op een spontane aartsvijand van de trophectoderm cellen.Deze benaderingen zijn gemakkelijker, maar vereisen meer manipulaties en zijn tijdrovender. De werkzaamheid van deze workflow maakt de implementatie van moleculaire technologieën in IVF mogelijk om te proberen de blastocyst te selecteren met de hoogste kans om te implanteren vóór de embryotransfer. Vergeet niet geen apparaat of oplossing te gebruiken die giftig kan zijn voor de embryo's en om DNA-besmetting te voorkomen met behulp van DNA-vrije materialen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Gewijzigd MicroSecure Vitrificatie: Een veilige, eenvoudige en zeer effectieve cryopreservatie Procedure for Human Blastocysten

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bepaling van de Galkanaal dichtheid in de lever van de muis

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

Menselijke Eier looptijd beoordeling en de klinische toepassing ervan

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...