Name: human blastocyst biopsy and vitrification
Uploaded: 2019-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Blastocyst Biopsy and Vitrification at JoVE.com

AG ו-RM אספו את הנתונים וניסחו את כתב היד. DC ניתח את הנתונים, ניסח את תוצאות הנציגים, ביצע את הסטטיסטיקות ושינו את כתב היד. FMU ו-LR סיפקו דיון קריטי בתוצאות ובכל כתב היד.

הפרוטוקול עבור ביופסיה של האדם בלסטוציסטה, כאן תיאר, עוקב אחר ההנחיות של הוועדה האנושית E.R.A. המחקר האנושי.
הערה: עיין בטבלת חומרים לחומרים הנדרשים. חומר נוסף נדרש כרוך הנעלה מעבדה התלבושת, מסכת מסיכה כירורגית, כיסוי שיער, כפפות כירורגי, סמן קבוע לא רעיל, מלק?...

<ol>
	<li>Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+stage+versus+blastocyst+stage+embryo+transfer+in+assisted+reproductive+technology.">Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).</li><li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection:+a+meta-analysis.">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Biopsy+on+Human+Embryo+Developmental+Potential+during+Preimplantation+Genetic+Diagnosis.">The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis.</a> Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+standard+blastocyst+morphology,+euploidy+and+implantation:+an+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts.">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+PGD/PGD-A+in+IVF+clinics:+considerations+for+the+best+laboratory+approach+and+management.">Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).</li><li>McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancies+and+live+births+after+trophectoderm+biopsy+and+preimplantation+genetic+testing+of+human+blastocysts.">Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).</li><li>Kokkali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+healthy+infant+following+trophectoderm+biopsy+from+blastocysts+for+PGD+of+beta-thalassaemia+major.">Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major.</a> Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).</li><li>Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preincubation+of+human+oocytes+may+improve+fertilization+and+embryo+quality+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection.</a> Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).</li><li>Wale, P. L., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+chemical+and+physical+factors+on+mammalian+embryo+culture+and+their+importance+for+the+practice+of+assisted+human+reproduction.">The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).</li><li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte,+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART:+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance.">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+blastocyst+features,+trophectoderm+biopsy+and+other+laboratory+practice+with+post-warming+behavior+and+implantation.">Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>Evans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fresh+versus+frozen+embryo+transfer:+backing+clinical+decisions+with+scientific+and+clinical+evidence.">Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence.</a> Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+reproducible+outcomes+of+blastocyst+biopsy+and+aneuploidy+screening+across+different+biopsy+practitioners:+a+multicentre+study+involving+2586+embryo+biopsies.">Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies.</a> Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+mode+and+effects+analysis+of+witnessing+protocols+for+ensuring+traceability+during+PGD/PGS+cycles.">Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles.</a> Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).</li><li>Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inconclusive+chromosomal+assessment+after+blastocyst+biopsy:+prevalence,+causative+factors+and+outcomes+after+re-biopsy+and+re-vitrification.+A+multicenter+experience.">Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+to+blastocyst+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis+and+single+embryo+transfer+at+Sydney+IVF.">Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF.</a> Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).</li><li>Capalbo, A., Rienzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+between+trophectoderm+and+inner+cell+mass.">Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass.</a> Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).</li><li>McCoy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+Selection+against+Complex+Mitotic-Origin+Aneuploidy+during+Preimplantation+Development.">Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).</li><li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not:+a+randomized+and+paired+clinical+trial.">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+births+after+transfer+of+rebiopsy+and+revitrification+of+blastocyst+that+had+&#8220;no+diagnosis&#8221;+following+trophectoderm+biopsy.">Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had &#8220;no diagnosis&#8221; following trophectoderm biopsy.</a> Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions.">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li><li>Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+mitochondrial+DNA+in+blastocoele+fluid+and+embryo+culture+medium:+evidence+and+potential+clinical+use.">Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use.</a> Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).</li><li>Vera-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+composition+of+cell-free+DNA+in+spent+medium+from+human+embryo+culture+during+preimplantation+development.">Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development.</a> Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).</li></ol>

רק embryologists מיומנים מנוסים שסיימו את תקופת ההכשרה שלהם צריך לבצע הן TE ביופסיה ו בלסטוציסט ויטריפיקציה. יתרה מזאת, על העד לפקח על ההליכים ולהבטיח שעקיבות יעילה במהלך הזמן שאני מבצע את התנועות של ביופסיה מצלחת הביופסיה (איור משלים 1) לצלחת הפוסט-ביופסיה (איור משלים 1) ), ואז לצ?...

המטרה העיקרית של אמבריולוגיה האנושי המודרני היא למקסם את המספר לידות חי לכל מחזור מגורה ולהפחית עלויות, זמן ומאמצים כדי להשיג הריון. כדי להשיג מטרה זו, גישות מאומתות עבור בחירת העובר צריך להיות מועסק כדי לזהות עוברים מוכשרים מחדש בתוך מפרק שהושג במהלך מחזור IVF. על פי העדויות האחרונות, התרבות בלסטוציסט1 בשילוב עם בדיקות כרומוזומלית מקיפה-העברת העובר התחמם העברה (ET) היא המסגרת היעילה ביותר כדי להגדיל את יעילות IVF2. ברור, בדיקות אנאפלואידיה דורש דגימה עובריים, אשר בשלב זה מיוצג בעיקר מתאים מעטים שאוחזרו מן הטרופטועור (TE), כלומר, את הקטע של הבלסטוציסטה המעניקה מקור לספח העובר (למשל, השליה) במהלך ההריון . מעבר ניתוח קריוטיפ, גם מוטציות גן יחיד עשוי להיות מוערך מתוך ביופסיה TE כחלק אסטרטגיה קלינית המכונה השתלת מראש בדיקות גנטיות (pgt;-a עבור aneuploidies,-SR עבור הסדרים מבניים כרומוקטיביות,-M עבור מחלות מונוגניים). אחרים oocyte/העובר ביופסיה שיטות כבר תיאוריה ואימץ קלינית לאורך העשורים האחרונים, כלומר גופים קוטביים ביופסיה ו blastomere ביופסיה. עם זאת, השימוש שלהם מופחת כיום מאז החסרונות הפרוצדורליים שלהם (למשל, עומס עבודה גבוה יותר וסיכון להשפעה הרבייה) ומגבלות אבחון (g., ניתוח תא בודד בעיות) לעכב במרומז איזון מספיק בין עלויות, סיכונים יתרונות (עבור סקירה ראה3).
במאמר זה, אחד הפרוטוקולים העיקריים של TE ביופסיה מתוארת ביסודיות יחד עם ויטריפיקציה הבאים, מחמם והעברת הליכים נדרשים. זרימת העבודה כאן מחולקת היא אידיאלית עבור יחידת PGT עמוסה.
כפי שתואר כבר בעבר על ידי הקבוצה שלנו4,5, ההליך כרוך פתיחה רציפה של הסונה pellucida של לחלוטין מורחב בלסטוציסטות והסרה של תאים TE מעטים (בממוצע 7-8). בהשוואה ליום 3 לייזר בסיוע בקיעה מבוסס ביופסיה שיטה6, הליך זה עשוי להקל על לוח הזמנים היומי של יחידת IVF שבו הליכים עדינים, כגון ביופסיה בלסטוציסט ו ויטריפיקציה, חייב להתבצע בעיתוי. ברגע שהציסטה הבלסטובה מגיעה להתרחבות המלאה שלה, הביופסיה יכולה להתבצע על ידי בחירת תאי ה-TE כדי להסיר, ובכך למנוע את הסיכון לפריצת המסה של התא הפנימי (ICM), אשר אחרת להפוך את ההליך מאתגר. בספרות, פרוטוקול שלישי של ביופסיה בלסטוציסט תוארה גם, אשר כרוכה הבקיעה בסיוע לייזר להתבצע פעם העובר כבר הגיע לשלב בלסטוציסט, כמה שעות לפני ההליך5,7. עם זאת, גישה זו היא יותר זמן רב ובעיקר חליפות IVF כי הם ביצוע ביופסיה TE בידיים של מגבילים מנוסים מנוסה ולאור עומס עבודה יומי מתון נמוך.
הזרקת זרע תאיים (ICSI)8 צריכה להיות טכניקה מאוחדת אם מכוון לביצוע ניתוחים גנטיים בהפריה חוץ גופית. באופן דומה, מערכת התרבות הנכונה לקצור בבטחה עוברים לשלב בלסטוציסט הוא חיוני ליישום של האסטרטגיה ביופסיה TE. מספר הולם של אינקובטורים, כמו גם השימוש במתח חמצן נמוך הם תנאי מפתח למטרה זו, לא להתפשר על שיעור בלסטוציסטה9. באותו זמן, תוכנית הקריוגנית יעילה נדרשת כדי לנהל בבטחה מחזור PGT. בעשור האחרון, יישום ויטריפיקציה יש שיפרה העובר שיעורי ההישרדות אפילו עד > 99%10,11. זה סיפק זמן מספיק כדי לבצע בדיקות גנטיות ולדחות העברת העובר אל המחזור הווסת הבא, על לא מגורה וכנראה יותר רירית האנדויום12.
הן ביופסיה ו-ויטריפיקציה הם תובעניים משימות הדורשות מיומנויות קפדניות והאפקטיביות שלהם עשוי להשתנות בין אופרטורים לא מנוסים. תקופת הכשרה מסוימת היא לפיכך מאפשרת לכל מפעיל לבצע הליכים אלה קלינית; יתר על כן, התחזוקה של מיומנויות המפעילים צריך להיות מוערך מעת לעת על ידי ניטור מחוונים ביצועים מפתח (KPI) עבור הקפאת הזמנות ונוהלי ביופסיה. כל מרפאת IVF צריך להגדיר מחווני Kpi פנימיים למטרה זו, אשר חייב להיות מקורב אלה שפורסמו על ידי קונסורציומים הבינלאומי ו/או את התוצאות שפורסמו על ידי מעבדות התייחסות.
TE ביופסיה, הליכים ויטריפיקציה-התחממות ועדים הם טכניקות מאומת ביחידה שלנו, כי כבר מתוקננת על פני כל המפעילים מעורבים כדיווח בשלוש פרסומים קודמים11,13,14 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold tube rack</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>XTPCR96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipette controller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>710931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet adjustable handle set</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G18674</td>
			<td>Stripper holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>66003</td>
			<td>p20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Electronic Witness System</td>
			<td>CooperSurgical Fertility &#38; Genomic Solutions</td>
			<td></td>
			<td>RI Witness ART Management System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>IVF TECH</td>
			<td></td>
			<td>Grade A air flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser objective</td>
			<td>RI</td>
			<td>Saturn 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjectors</td>
			<td>Nikon Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge for PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CSLQSPIN</td>
			<td>for 0.2ml PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5AC-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5M-PE</td>
			<td>02/CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-30FB35720</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryolock</td>
			<td>Cryolock</td>
			<td>CL-R-CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSCM complete</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90165</td>
			<td>IVF culture medium supplemented with HSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Transfer Catheter</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G17934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G26712</td>
			<td>140&#181;m stripping pipette tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G46020</td>
			<td>300&#181;m stripping pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-IH35/20</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF One well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil for embryo culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified HTF Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90126</td>
			<td>Hepes-Buffered medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Delta Surface</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td>IVF dish 4-well plate with sliding lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td>60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reproplate</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>83016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable Gilson tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td>200&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Kit</td>
			<td>Provided by the genetic lab</td>
			<td></td>
			<td>PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrification media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT801</td>
			<td>Equilibration and vitrification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>Thawing and dilution solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human blastocyst biopsy and vitrification

ביופסיה blastocyst מבוצעת כדי לקבל אבחנה גנטית אמינה במהלך מחזורי IVF עם השרשה גנטית בדיקות. אז, זרימת העבודה האידיאלית כרוך פרוטוקול ויטריפיקציה בטוח ויעיל, בשל זמן הטיפול של טכניקות אבחון ולהעביר את העובר הנבחר (של) על רירית המין הפיזיולוגי במחזור הטבעי הבא. גישה ביופסיה המקיף את הפתיחה רציפים של הסונה pellucida ושליפה של 5-10 תאי עור trophectoderm באופן אידיאלי 7-8) מגביל הן מספר המניפולציות הנדרשות ואת החשיפה של העובר לתנאים סביבתיים תת אופטימלית. לאחר אימון נאות, הטכניקה היתה להיות מיויית על פני מפעילי שונים במונחים של עיתוי של ביופסיה (~ 8 דקות, החל 3-22 דקות מבוסס על מספר העוברים ביופסיה לכל מנה), אבחנות מכרעת שהתקבלו (~ 97.5%) ושיעורי לידה חיים לאחר העברת-העברה שחומם-אאופואיד-בליילויד (> 40%). שיעור ההישרדות לאחר ביופסיה, ויטריפיקציה והתחממות היה גבוה כמו 99.8%. שיעור ההתרחבות מחדש ב 1.5 h מהתחממות היה גבוה כמו 97%, תלוי בעיקר בעיתוי בין ביופסיה ו ויטריפיקציה (באופן אידיאלי ≤ 30 דקות), בלסטוציסט באיכות וביום של ביופסיה. באופן כללי, עדיף להתקשות לכווץ בלסטוציסטה; לכן, במחזורים שאינם PGT, לייזר בסיוע מלאכותי הצטמקות עשוי להתבצע כדי לגרום לקריסה העובר לפני הקפאת ההזמנה. הפרספקטיבה העתידית המבטיחה ביותר היא ניתוח לא פולשני של התקשורת התרבותית IVF לאחר התרבות בלסטוציסט כמקור פיוטי של דנ א עובריים. עם זאת, האוונגרד הפוטנציאלי הזה עדיין תחת חקירה ופרוטוקול אמין עדיין צריך להיות מוגדר ומאומת.

איור 6 מייצג ערכה של כל התוצאות של הליך ביופסיה שניתן לאמץ כדי לתקנן את הפרוטוקול ולנטר את הביצועים של כל אופרטור. התוצאה הפרוצדורלית העיקרית היא העיתוי להשלמת ביופסיה/ביופסיות; התוצאה הטכנית העיקרית היא האיכות של העלילה המיוצר לאחר בדיקות גנטיות שעשוי ל...

Watch this Scientific Journal Video about Human Blastocyst Biopsy and Vitrification at JoVE.com

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

ביופסיה blastocyst ו ויטריפיקציה נדרשים ביעילות לבצע בדיקה גנטית מראש השרשה. גישה הדורשת את הפתיחה הרציפה של הסונה והחזרת התאים ה7-8 של תאי העור ביום 5-7 שלאחר ההפריה מגבילה גם את מספר המניפולציות הנדרשות ואת חשיפת העובר לתנאי הסביבה האופטימליים.

ביופסיה של האדם בלסטוציסטה וויטריפיקציה

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

הן ביופסיה blastocyst ו vitrification היו מהפכה בהפריה חוץ גופית, הפריה חוץ גופית, המאפשר עוברים מכל רחבי העולם לבצע בדיקות גנטיות טרום השתלה על עוברים אנושיים עם סיכון מינימלי לעובר. ביופסיה של טרופיקטודרמה אפשרה אחזור של כשבעה תאים מעובר בוגר, ובכך אפשרה ניתוח גנטי חזק במורד הזרם. יתר על כן, לא הוכחה כל השפעה, עד כה, לגישה זו.היעילות הקלינית של זרימת עבודה זו מאפשרת לחולים עם תנאים מונוגניים וכל אותם חולים עם סיכון מוגבר של מומים כרומוזומליים בתוך blastocyst שלהם ליהנות בדיקות גנטיות טרום תפללה. יש עדיין מקום לשיפור האסטרטגיות הנוכחיות של בחירת עוברים. לדוגמה, פרופיל miRNomic ופרוטומי מייצג אפשרויות מסקרנות להשלמת בדיקות גנטיות של טרום-נתיל בביופסיה אחת של טרופיקטרום.מפעילים לא מנוסים לעתים קרובות נאבקים עם פתיחה וחדירה של zona pellucida. זה רק עניין של מיקוד. הלסטוציסט, מטרת הלייזר והפיגט צריכים להיות באותו מישור מוקד.לאחר תיוג צלחת הביופסיה עם פרטי המטופל, עם סמן קבוע, לא רעיל, מספר כל טיפה 10 מיקרוליטר של מדיום HEPES-buffered עם העובר ומחזור ID.באמצעות צינור הפשטה 300 מיקרומטר, להעביר blastocyst קיימא, מורחב לחלוטין לירידה הראשונה של צלחת ביופסיה לשטוף את הירידה כדי להסיר את מדיום התרבות העודף, לפני העברת blastocyst לתוך הירידה השנייה בצלחת. מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ הפוך, ומאימים את הביופסיה עם מדיום מהירידה השלישית של צלחת הביופסיה. תחת הגדלה של פי 20, כוון את הפלסטוציסט כדי לקבל תצוגה ברורה של מסת התא הפנימי בשעה שבע, ולאבטח את העובר על פיפטה המחזיקה.התמקדו בזונה פלוצ'ידה כך שגם הפיפס וגם הפלסט נמצאים באותו מישור מוקד. עבור אל מטרת הלייזר, ולמקם את מצביע הלייזר על zona pellucida בצד הנגדי של מסת התא הפנימי. לקדוח את zona pellucida עם שניים עד שלושה פולסים לייזר, בעדינות ללחוץ על פיפטה ביופסיה נגד pellucida zona כדי לאפשר בינוני להיות פוצץ דרך הפרצה כדי לנתק את תאי trophectoderm מפני השטח הפנימיים.כאשר ה- trophectoderm מנותק, הזן דרך החור ושופע שבעה עד שמונה תאי טרופיה לתוך פיפטה ביופסיה עם יניקה עדינה. בעת החלת יניקה מתונה כדי למתוח את תאי היעד, להזיז מעט את פיפטה ביופסיה לאחור ולכוון את הלייזר לכיוון החלק הדק ביותר של התאים שאפתן. אש שניים עד חמישה פולסים לייזר בצמתים בין התאים כדי להפריד את תאי היעד מגוף העובר.כאשר שבר ה-trophectoderm הופרד מהבסטוציסט, שחרר את הרסיס לאותה טיפת ביופסיה הרחק מהמסרח כדי למנוע את הרסיס מלהיות נשאב בחזרה לתוך פיפטה הביופסיה. שחררו את ה-blastocyst מהפיגט המחזיק, והעלו מיד את שתי הפיפסות כדי למנוע מהרסיס להידבק לפיפסטים. לאחר מכן תדמיין את הקטע הביופסי למטרות בקרת איכות.כאשר כל blastocysts כבר ביופסיה כפי שהוכח רק, להעביר את צלחת הביופסיה בחזרה מכסה המנוע לזרימה למינאר ולתייג את צלחת תרבות שלאחר ביופסיה עם מזהה הזוג וכל טיפה עם העובר ומזהה מחזור. בנוכחות עד, לשטוף את blastocyst במדיום הפריה חוץ גופית נקייה ולהזיז את blastocyst לירידה המקבילה שלה בצלחת שלאחר הביופסיה. לאחר מכן מניחים את המנה שלאחר הביופסיה על 37 מעלות צלזיוס, 6% פחמן דו חמצני, ו 5% אינקובטור חמצן.בנוכחות העד ובתוך מכסה המנוע לזרימה למינארית בטמפרטורת החדר, סמן את צינורות PCR עם סמן קבוע ולא רעיל. סמן את המכסה של צלחת תרבות צינורות 60 x 15 מילימטר עם מזהי העובר ביופסיה, ולהוסיף שתי טיפות 10 מיקרוליטר של פתרון שטיפת ביופסיה לצלחת. ראש צינור הפשטה 140 מיקרומטר עם פתרון שטיפת ביופסיה מהטיפה השנייה של צלחת צינורות תחת מיקרוסקופ סטריאו לדמיין את שברי trophectoderm.שחרר בעדינות תמיסת כביסה ביופסית על שבר ה- trophectoderm, וטען את השבר לתוך פיפטה החשפנות. מעבירים את השבר לטיפה השנייה של תווי שטיפת ביופסיה, ושוטפי בזהירות את הרקמה פעמיים עד שלוש פעמים. להעביר את שבר trophectoderm לתחתית צינור PCR שכותרתו כראוי עם פתרון טעינה, דואג להימנע מנגיעה בקירות הצינור עם קצה פיפטה הפשטה.כאשר כל השברים נוספו לצינורות שלהם, לסובב את כל הצינורות בצנטריפוגה מיני במשך כמה שניות כדי לעים את השברים. לאחר מכן לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהם נשלחים למעבדה הגנטית המפנה לבדיקה. בתוך 30 דקות של ביופסיה של טרופיקטודרמה, סמן צלחת vitrification עם פרטי המטופל ואת תעודות הזהות של blastocysts כי יש vitrified.באמצעות cryolabels עמיד בטמפרטורה קרה מיוחדת, תווית vitrification תומך עם שם המטופל ואת שם המשפחה, מזהה זוג, זיהוי של העובר כי יהיה טעון על זה, ואת התאריך של ההליך. בטמפרטורת החדר, לוותר על 300 microliters של פתרון שיווי משקל עבור כל blastocyst כי יהיה vitrified, בנוכחות עד, להשתמש פיפטה חשפנות 300 מיקרומטר כדי להעביר את blastocyst לתוך נפח אחד של פתרון שיווי משקל. השאירו את הפיצוץ בתסרון שיווי המשקל למשך 13 עד 15 דקות.לאחר הצטמקות ראשונית של הנפח, תישמר התרחבות הדרגתית. בסוף שיווי המשקל, להוסיף 300 microliters של פתרון vitrification ל הבאר השנייה של צלחת vitrification ולהעביר את blastocyst המורחבת לחלוטין לפתרון vitrification במשך דקה אחת. בסוף הדגירה, לשטוף את blastocyst כדי לדלל את פתרון שיווי המשקל, בנוכחות עד, לטעון את blastocyst על תמיכה vitrification.הסר את עודף של פתרון vitrification. סרט עדין של פתרון צריך להקיף את blastocyst. לצלול את התמיכה vitrification לתוך חנקן נוזלי, במרץ להזיז את התמיכה כדי להפחית את הסיכון של היווצרות בועה קרוב לדגימה.לאחר מכן מניחים את מכסה המגן על התמיכה בעוד התמיכה vitrification עדיין שקוע חנקן נוזלי. מתוך 1, 544 הליכי ביופסיה trophectoderm שנערכו במהלך תקופה זו שנתיים נציג, בין אחד לארבעה blastocysts היו ביופסיה לכל הליך במשך בין שלוש ל 22 דקות לכל הליך. בחלקות אלה, התזמון הממוצע של הביופסיה עבור כל מפעיל לאורך שלבי המחקר מוצגים, עם ערך כולל ממוצע של 8.24 דקות.זה מועיל לרכוש תמונה של כל שבר biopsied למטרות בקרת איכות כדי להעריך אם הגורם לאבחונים חד משמעיים היה בלתי ניתן לערעור למימד ו / או לאיכות של השבר, לצנרת, או כמה בעיות בעיבוד המדגם במעבדה הגנטית. במחקר זה, 572 בלסטוציסטים euploid התחממו לעבור העברת עובר לאחר אבחנה של euploidy. כל הפלסטוציסטים התרחבו תוך 30 דקות, כאשר 2.4% מהפלסטוציסטים לא התרחבו מחדש בין 31 ל-90 דקות ו-4.9% לא התרחבו מחדש מעבר ל-90 דקות מיום המלחמה מחדש.במיוחד עבור איכות ירודה ו / או יום שבעה blastocysts, העיתוי בין ביופסיה vitrification נראה חיוני כדי להשיג התרחבות מחדש לאחר ההתחממות. יש לדאוג להתמקד לפני פתיחת zona pellucida בעת חשיפת הצומת בין תא trophectoderm וירי, ולדאוג גם כדי למנוע התפשטות מחדש blastocyst לפני vitrification. קיימות שתי גישות נוספות לביופסיה של בלסטוציסט, שתיהן כרוכות בפתיחה של פלוצ'ידה והמתנה לקשת ספונטנית של תאי הטרופיקטודרמה.גישות אלה קלות יותר אך דורשות יותר מניפולציות וגוזלות זמן רב יותר. היעילות של זרימת עבודה זו מאפשרת יישום של טכנולוגיות מולקולריות בהפריה חוץ גופית על מנת לנסות לבחור את blastocyst עם הסיכוי הגבוה ביותר להשתיל לפני העברת העובר. זכור לא להשתמש בכל מכשיר או פתרון שעלול להיות רעיל לעוברים ולמנוע זיהום DNA באמצעות חומרים ללא DNA.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Vitrification MicroSecure השתנה: כספת, פשוט מאוד נוהל Cryopreservation אפקטיבי עבור blastocysts אנוש

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

הערכה לפירעון ביצת אנוש ויישומו הקליני

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...