Name: human blastocyst biopsy and vitrification
Uploaded: 2019-07-26T12:30:00
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AG e RM hanno raccolto i dati e redatto il manoscritto. La DC analizzò i dati, redasse i risultati rappresentativi, eseguì le statistiche e rivedeva il manoscritto. FMU e LR hanno fornito una discussione critica dei risultati e dell'intero manoscritto.

Il protocollo per la biopsia della blastocisti umana, qui descritto, segue le linee guida del Comitato Etico della ricerca umana G.EN.E.R.A.
 NOT:</</c0> Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i materiali necessari. Ulteriori materiali necessari riguardano calzature e abiti da laboratorio, maschera chirurgica, copertura per capelli, guanti chirurgici, un marcatore permanente non tossico, pinze e disinfettante. L'uso di abito chirurgico, guanti chirurgici usa e...

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	<li>Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+stage+versus+blastocyst+stage+embryo+transfer+in+assisted+reproductive+technology.">Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).</li><li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection:+a+meta-analysis.">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Biopsy+on+Human+Embryo+Developmental+Potential+during+Preimplantation+Genetic+Diagnosis.">The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis.</a> Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+standard+blastocyst+morphology,+euploidy+and+implantation:+an+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts.">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+PGD/PGD-A+in+IVF+clinics:+considerations+for+the+best+laboratory+approach+and+management.">Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).</li><li>McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancies+and+live+births+after+trophectoderm+biopsy+and+preimplantation+genetic+testing+of+human+blastocysts.">Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).</li><li>Kokkali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+healthy+infant+following+trophectoderm+biopsy+from+blastocysts+for+PGD+of+beta-thalassaemia+major.">Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major.</a> Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).</li><li>Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preincubation+of+human+oocytes+may+improve+fertilization+and+embryo+quality+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection.</a> Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).</li><li>Wale, P. L., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+chemical+and+physical+factors+on+mammalian+embryo+culture+and+their+importance+for+the+practice+of+assisted+human+reproduction.">The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).</li><li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte,+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART:+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance.">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+blastocyst+features,+trophectoderm+biopsy+and+other+laboratory+practice+with+post-warming+behavior+and+implantation.">Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>Evans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fresh+versus+frozen+embryo+transfer:+backing+clinical+decisions+with+scientific+and+clinical+evidence.">Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence.</a> Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+reproducible+outcomes+of+blastocyst+biopsy+and+aneuploidy+screening+across+different+biopsy+practitioners:+a+multicentre+study+involving+2586+embryo+biopsies.">Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies.</a> Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+mode+and+effects+analysis+of+witnessing+protocols+for+ensuring+traceability+during+PGD/PGS+cycles.">Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles.</a> Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).</li><li>Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inconclusive+chromosomal+assessment+after+blastocyst+biopsy:+prevalence,+causative+factors+and+outcomes+after+re-biopsy+and+re-vitrification.+A+multicenter+experience.">Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+to+blastocyst+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis+and+single+embryo+transfer+at+Sydney+IVF.">Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF.</a> Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).</li><li>Capalbo, A., Rienzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+between+trophectoderm+and+inner+cell+mass.">Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass.</a> Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).</li><li>McCoy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+Selection+against+Complex+Mitotic-Origin+Aneuploidy+during+Preimplantation+Development.">Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).</li><li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not:+a+randomized+and+paired+clinical+trial.">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+births+after+transfer+of+rebiopsy+and+revitrification+of+blastocyst+that+had+&#8220;no+diagnosis&#8221;+following+trophectoderm+biopsy.">Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had &#8220;no diagnosis&#8221; following trophectoderm biopsy.</a> Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions.">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li><li>Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+mitochondrial+DNA+in+blastocoele+fluid+and+embryo+culture+medium:+evidence+and+potential+clinical+use.">Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use.</a> Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).</li><li>Vera-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+composition+of+cell-free+DNA+in+spent+medium+from+human+embryo+culture+during+preimplantation+development.">Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development.</a> Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).</li></ol>

Solo gli embriologi esperti di esperti che hanno completato il loro periodo di formazione dovrebbero eseguire sia la biopsia TE che la vitrificazione della blastocisti. Inoltre, un testimone è tenuto a monitorare le procedure e garantire un'efficiente tracciabilità durante i) i movimenti della blastocisti biopsied dal piatto di biopsia ( Figura supplementare1) alla parabola post-biopsia (Figurasupplementare 1 ), quindi alla targhetta di vitrificazione (figura supplementare 1</s...

L'obiettivo principale dell'embriologia umana moderna è quello di massimizzare il numero di nascite vive per ciclo stimolato e ridurre i costi, i tempi e gli sforzi per raggiungere una gravidanza. Per raggiungere questo obiettivo, dovrebbero essere utilizzati approcci convalidati per la selezione degli embrioni per identificare gli embrioni competenti riproduttivi all'interno di una coorte ottenuta durante un ciclo di fecondazione in vitro. Secondo le ultime evidenze, la cultura blastocisti1 combinata con test cromosomici completi e il trasferimento di embrioni euploidi vetrificati (ET) è il quadro più efficiente per aumentare l'efficienza della fecondazione in vitro2. Chiaramente, il test di aneuploidità richiede un campione embrionale, che attualmente è per lo più rappresentato da poche cellule recuperate dal trhectoderm (TE), cioè la sezione del blastocisti che dà origine agli annessi embrionali (ad esempio, la placenta) durante la gravidanza . Oltre all'analisi del cariotipo, anche le mutazioni genetiche singole potrebbero essere valutate da una biopsia TE come parte di una strategia clinica nota come test genetico preimpianto (PGT; -A per le aneuploidies, -SR per riarrangiamento cromosomiche strutturali, -M per le malattie monogeniche). Altri metodi di biopsia oocite/embrione sono stati teorizzati e adottati clinicamente negli ultimi decenni, vale a dire biopsia di corpi polari e biopsia blastomeri. Tuttavia, il loro uso è ancora ridotto al giorno d'oggi, poiché i loro inconvenienti procedurali (ad esempio, maggiore carico di lavoro e rischio di impatto riproduttivo) e le limitazioni diagnostiche (ad esempio, problemi di analisi a cella singola) ostacolano implicitamente un equilibrio sufficiente tra costi, rischi e benefici (per una revisione vedere3).
In questo documento, uno dei principali protocolli per la biopsia TE è accuratamente descritto insieme alle successive procedure di vitrificazione, riscaldamento e trasferimento necessarie. Il flusso di lavoro qui descritto è ideale per un'unità PGT occupata.
Come già descritto in precedenza dal nostro gruppo4,5, la procedura prevede l'apertura sequenziale della zona pellucida di blastocisti completamente espansi e la rimozione di poche cellule TE (in media 7-8). Rispetto al giorno 3 metodo di biopsia di schiusa-assistita da raggi6, questa procedura potrebbe facilitare l'orario giornaliero di un'unità di fecondazione in vitro in cui devono essere eseguite tempestivamente procedure delicate, come la biopsia blastocisti e la vitrificazione. Non appena la blastocisti raggiunge la sua piena espansione, la biopsia può essere effettuata selezionando le cellule TE da rimuovere, impedendo così il rischio di ernia della massa cellulare interna (ICM), che altrimenti renderebbe la procedura impegnativa. In letteratura, è stato descritto anche un terzo protocollo di biopsia di blastocisti, che comporta la schiusa assistita dal laser eseguita una volta che l'embrione ha già raggiunto lo stadio di blastocisti, poche ore prima della procedura5,7. Tuttavia, questo approccio richiede più tempo e si adatta principalmente alle unità di fecondazione in vitro che implementano la biopsia TE nelle mani di operatori con esperienza limitata e in considerazione di un carico di lavoro giornaliero moderato-basso.
L'iniezione intracitoplasmatica di spermatoi (ICSI)8 dovrebbe essere una tecnica consolidata se si mira a condurre analisi genetiche nella fecondazione in vitro. Allo stesso modo, un sistema di coltura adeguato per raccogliere in modo sicuro gli embrioni allo stadio di blastocisti è fondamentale per l'attuazione della strategia di biopsia TE. Un numero adeguato di incubatori, così come l'uso di bassa tensione di ossigeno sono prerequisiti fondamentali a tal fine, per non compromettere il tasso di blastocisti9. Allo stesso tempo, è necessario un programma di crioconservazione efficiente per gestire in modo sicuro un ciclo PGT. Nell'ultimo decennio, l'attuazione della vetrificazione ha aumentato i tassi di crio-sopravvivenza degli embrioni anche fino a >99%10,11. Ciò ha fornito tempo sufficiente per eseguire test genetici e rinviare il trasferimento dell'embrione al successivo ciclo mestruale, su un endometrio non stimolato e probabilmente più ricettivo12.
Sia la biopsia TE che la vitrificazione richiedono attività rigorose e la loro efficacia può variare a seconda degli operatori non esperti. Si propongono pertanto un periodo di formazione specifico prima di consentire a ciascun operatore di eseguire clinicamente queste procedure; inoltre, il mantenimento delle competenze degli operatori dovrebbe essere valutato periodicamente monitorando gli indicatori chiave di prestazione (KPI) per le procedure di crioconservazione e biopsia. Ogni clinica di fecondazione in vitro dovrebbe fissare KPI interni a tal fine, che deve approssimare quelli pubblicati dai consorzi internazionali e/o i risultati pubblicati dai laboratori di riferimento.
La biopsia TE, il riscaldamento della vitrificazione e le procedure di testimonianza sono tecniche convalidate presso la nostra unità, che sono state standardizzate in tutti gli operatori coinvolti come riportato in tre precedenti pubblicazioni11,13,14 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold tube rack</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>XTPCR96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipette controller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>710931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet adjustable handle set</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G18674</td>
			<td>Stripper holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>66003</td>
			<td>p20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Electronic Witness System</td>
			<td>CooperSurgical Fertility &#38; Genomic Solutions</td>
			<td></td>
			<td>RI Witness ART Management System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>IVF TECH</td>
			<td></td>
			<td>Grade A air flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser objective</td>
			<td>RI</td>
			<td>Saturn 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjectors</td>
			<td>Nikon Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge for PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CSLQSPIN</td>
			<td>for 0.2ml PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5AC-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5M-PE</td>
			<td>02/CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-30FB35720</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryolock</td>
			<td>Cryolock</td>
			<td>CL-R-CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSCM complete</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90165</td>
			<td>IVF culture medium supplemented with HSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Transfer Catheter</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G17934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G26712</td>
			<td>140&#181;m stripping pipette tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G46020</td>
			<td>300&#181;m stripping pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-IH35/20</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF One well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil for embryo culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified HTF Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90126</td>
			<td>Hepes-Buffered medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Delta Surface</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td>IVF dish 4-well plate with sliding lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td>60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reproplate</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>83016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable Gilson tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td>200&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Kit</td>
			<td>Provided by the genetic lab</td>
			<td></td>
			<td>PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrification media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT801</td>
			<td>Equilibration and vitrification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>Thawing and dilution solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human blastocyst biopsy and vitrification

La biopsia Blastocyst viene eseguita per ottenere una diagnosi genetica affidabile durante i cicli di fecondazione in vitro con test genetici preimpianto. Quindi, il flusso di lavoro ideale comporta un protocollo di vitrificazione sicuro ed efficiente, a causa dei tempi di consegna delle tecniche diagnostiche e per trasferire l'embrione o gli embrioni selezionati su un endometrio fisiologico in un ciclo naturale successivo. Un approccio di biopsia che comprende l'apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 5-10 cellule trophectoderm (idealmente 7-8) limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l'esposizione dell'embrione a condizioni ambientali non ottimali. Dopo un'adeguata formazione, la tecnica è stata riproducibile tra diversi operatori in termini di tempistica della biopsia (8 min, che vanno da 3 a 22 min in base al numero di embrioni alla biopsia per piatto), diagnosi conclusive ottenute (97,5%) e tassi di natalità vivi dopo il trasferimento di blastocisti euploidi vetrificati (>40%). Il tasso di sopravvivenza dopo la biopsia, la vitrificazione e il riscaldamento è stato del 99,8%. Il tasso di riespansione a 1,5 h dal riscaldamento era alto come 97%, in gran parte dipende dalla tempistica tra biopsia e vitrificazione (idealmente , 30 min), qualità morfologica blastocista e giorno della biopsia. In generale, è meglio vitrificare una blastocisti collassata; pertanto, nei cicli non PGT, potrebbe essere eseguito un restringimento artificiale assistito al laser per indurre il collasso dell'embrione prima della crioconservazione. La prospettiva futura più promettente è l'analisi non invasiva dei media di coltura della fecondazione in vitro dopo la coltura della blastocisti come fonte putativa di DNA embrionale. Tuttavia, questa potenziale avanguardia è ancora in fase di studio e un protocollo affidabile deve ancora essere definito e convalidato.

La figura 6 rappresenta uno schema di tutti i risultati di una procedura di biopsia che può essere adottata per standardizzare il protocollo e monitorare le prestazioni di ciascun operatore. Il principale risultato procedurale è la tempistica per completare la biopsia/biopsia; il principale risultato tecnico è la qualità della trama prodotta dopo i test genetici che potrebbero portare a una diagnosi conclusiva o inconcludente, quest'ultima delle quali ric...

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Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

La biopsia e la vitrificazione della blastocisti sono necessarie per condurre in modo efficiente i test genetici preimpianto. Un approccio che prevede l'apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 7-8 cellule di trectodermi nel giorno 5-7 post-inseminazione limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l'esposizione dell'embrione a condizioni ambientali non ottimali.

Biopsia e vetrificazione dell'esplosione umana

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Sia la biopsia blastocisti che la vetrificazione sono state una rivoluzione nella fecondazione in vitro, nella fecondazione in vitro, consentendo agli embriologi di tutto il mondo di eseguire test genetici preimpianto su embrioni umani con un rischio minimo per l'embrione. La biopsia del trophectoderm ha permesso il recupero di circa sette cellule da un embrione completamente cresciuto, consentendo così una solida analisi genetica a valle. Inoltre, finora non è stato dimostrato alcun impatto su questo approccio.L'efficienza clinica di questo flusso di lavoro consente ai pazienti con condizioni monogeniche e a tutti quei pazienti con un aumento del rischio di anomalie cromosomiche all'interno della loro blastocista di beneficiare di test genetici preimpianto. C'è ancora spazio per migliorare le attuali strategie di selezione degli embrioni. Ad esempio, la profilazione miRNomica e proteomica rappresenta opzioni intriganti per integrare i test genetici di preimpianto su una singola biopsia del trophectoderm.Gli operatori inesperti spesso faticano ad aprire e penetrare la zona pellucida. È solo una questione di concentrazione. La blastocista, l'obiettivo laser e le pipette dovrebbero essere sullo stesso piano focale.Dopo aver etichettato il piatto di biopsia con i dettagli del paziente, con un marcatore permanente e atossico, numera ogni goccia di 10 microliter di mezzo tamponato con HEPES con l'ID embrione e ciclo.Utilizzando una pipetta di stripping di 300 micrometri, trasferisci una blastocista vitale e completamente espansa alla prima goccia del piatto di biopsia e risciacqua la goccia per rimuovere il mezzo di coltura in eccesso, prima di spostare la blastocista nella seconda goccia nel piatto. Posizionare il piatto al microscopio invertito e innescare la pipetta di biopsia con il mezzo dalla terza goccia del piatto di biopsia. Sotto un ingrandimento 20 volte, orientare la blastocista per ottenere una visione chiara della massa cellulare interna a ore sette e fissare l'embrione sulla pipetta di tenuta.Concentrati sulla zona pellucida in modo che sia le pipette che la blastocista siano sullo stesso piano focale. Passare all'obiettivo laser e posizionare il puntatore laser sulla zona pellucida sul lato opposto della massa interna della cella. Perforare la zona pellucida con due o tre impulsi laser e premere delicatamente la pipetta di biopsia contro la zona pellucida per consentire al mezzo di soffiare attraverso la breccia per staccare le cellule del trophectoderm dalla superficie interna.Quando il trophectoderm è staccato, entra attraverso il foro e aspira da sette a otto cellule trophectoderm nella pipetta biopsia con delicata aspirazione. Durante l'applicazione di un'aspirazione moderata per allungare le cellule bersaglio, spostare leggermente la pipetta di biopsia all'indietro e dirigere il laser verso la parte più sottile delle cellule aspirate. Spara da due a cinque impulsi laser alle giunzioni tra le cellule per separare le cellule bersaglio dal corpo dell'embrione.Quando il frammento di trophectoderm è stato separato dalla blastocista, rilascia il frammento nella stessa goccia di biopsia lontano dalla blastocista per evitare che il frammento venga risucchiato nella pipetta della biopsia. Rilasciare la blastocista dalla pipetta di tenuta e sollevare prontamente entrambe le pipette per evitare che il frammento si attacchi alle pipette. Quindi immagine del frammento biopsied per scopi di controllo qualità.Quando tutte le blastoc cisti sono state biopsiate come appena dimostrato, spostare il piatto di biopsia nel cappuccio di flusso laminare ed etichettare il piatto di coltura post-biopsia con l'ID coppia e ogni goccia con l'id embrione e ciclo. In presenza di un testimone, sciacquare la blastocista in un mezzo di fecondazione in vitro pulito e spostare la blastocista alla corrispondente goccia nel piatto post-biopsia. Quindi posizionare il piatto post-biopsia su un'incubatrice di 37 gradi Celsius, 6% di anidride carbonica e 5% di ossigeno.In presenza del testimone e all'interno di una cappa di flusso laminare a temperatura ambiente, etichettare i tubi PCR con un marcatore permanente e atossico. Etichettare il coperchio di un piatto di coltura di tubi da 60 x 15 millimetri con gli ID embrionale biopsied e aggiungere due gocce da 10 microlitri di soluzione di lavaggio della biopsia al piatto. Innescare una pipetta di stripping di 140 micrometri con soluzione di lavaggio della biopsia dalla seconda goccia della piastra del tubo sotto il microscopio stereo per visualizzare i frammenti di trophectoderm.Rilasciare delicatamente una soluzione di lavaggio della biopsia sul frammento di trophectoderm e caricare il frammento nella pipetta di stripping. Spostare il frammento nella seconda goccia di soluzione di lavaggio della biopsia e sciacquare accuratamente il tessuto da due a tre volte. Trasferire il frammento di trophectoderm sul fondo del tubo PCR opportunamente etichettato con soluzione di carico, facendo attenzione a evitare di toccare le pareti del tubo con la punta della pipetta di stripping.Quando tutti i frammenti sono stati aggiunti ai loro tubi, ruotare tutti i tubi in una mini centrifuga per alcuni secondi per sedimentare i frammenti. Quindi conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius fino a quando non vengono spediti al laboratorio genetico di riferimento per i test. Entro 30 minuti dalla biopsia del trophectoderm, etichettare una piastra di vetrificazione con i dettagli del paziente e gli ID delle blastocsti che devono essere vetrificate.Utilizzando speciali crioetichetiche resistenti alla temperatura fredda, etichettare i supporti di vetrificazione con il nome e il cognome del paziente, l'ID coppia, l'ID dell'embrione che verrà caricato su di esso e la data della procedura. A temperatura ambiente, erogare 300 microlitri di soluzione di equilibrazione per ogni blastocisti che sarà vetrificato e, in presenza di un testimone, utilizzare una pipetta di stripping di 300 micrometri per spostare la blastocisti in un unico volume di soluzione di equilibrazione. Lasciare la blastocista nella soluzione di equilibrazione per 13-15 minuti.Dopo un iniziale restringimento del volume, si osserverà una graduale espansione. Al termine dell'equilibrazione, aggiungere 300 microlitri di soluzione di vetrificazione al secondo pozzo della piastra di vetrificazione e trasferire la blastocisti completamente ri-espansa alla soluzione di vetrificazione per un minuto. Al termine dell'incubazione, sciacquare la blastocista per diluire la soluzione di equilibrazione e, in presenza di un testimone, caricare la blastocista sul supporto di vetrificazione.Rimuovere l'eccesso di soluzione di vetrificazione. Un sottile film di soluzione dovrebbe circondare la blastocista. Immergere il supporto di vetrificazione in azoto liquido e spostare vigorosamente il supporto per ridurre il rischio di formazione di bolle vicino al campione.Quindi posizionare il cappuccio protettivo sul supporto mentre il supporto di vetrificazione è ancora immerso nell'azoto liquido. Delle 1.544 procedure di biopsia del trophectoderm condotte in questo periodo rappresentativo di due anni, da una a quattro blastocista sono state biopsiate per procedura per un periodo compreso tra i tre e i 22 minuti per procedura. In questi grafici viene mostrata la tempistica media della biopsia per ogni operatore lungo i trimestri di studio, con un valore complessivo medio di 8,24 minuti.È utile acquisire un'immagine di ogni frammento biopsied ai fini del controllo di qualità per valutare se la causa delle diagnosi inconcludenti fosse imputabile alla dimensione e/o alla qualità del frammento, ai tubi o ad alcuni problemi nella lavorazione del campione in laboratorio genetico. In questo studio, 572 blastocici euploidi sono stati riscaldati per sottoporsi a un trasferimento di embrioni dopo una diagnosi di euploidia. Tutte le blastoc cisti vetrificate in 30 minuti, con il 2,4% delle blastocsti che non si espande tra i 31 e i 90 minuti e il 4,9% non si ri-espande oltre i 90 minuti dal riscaldamento.Soprattutto per le blastocista di scarsa qualità e/o settima giornata, la tempistica tra biopsia e vetrificazione sembra cruciale per ottenere una espansione dopo il riscaldamento. Fare attenzione a mettere a fuoco prima di aprire la zona pellucida quando si espone la giunzione tra la cellula trophectoderm e la cottura, e fare attenzione anche a prevenire la rielezione della blastocista prima della vetrificazione. Esistono altri due approcci di biopsia blastocisti, che comportano sia l'apertura della zona pellucida che l'attesa di un arco spontaneo delle cellule del trophectoderm.Questi approcci sono più semplici ma richiedono più manipolazioni e richiedono più tempo. L'efficacia di questo flusso di lavoro consente l'implementazione di tecnologie molecolari in fecondazione in vitro al fine di cercare di selezionare la blastocista con la più alta probabilità di impianto prima del trasferimento dell'embrione. Ricorda di non utilizzare alcun dispositivo o soluzione che possa essere tossico per gli embrioni e di prevenire la contaminazione da DNA utilizzando materiali senza DNA.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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