Name: human blastocyst biopsy and vitrification
Uploaded: 2019-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Blastocyst Biopsy and Vitrification at JoVE.com

AG и RM собрали данные и составили рукопись. УК проанализировала данные, составила репрезентативные результаты, выполнила статистику и пересмотрела рукопись. FMU и LR обеспечили критическое обсуждение результатов и всей рукописи.

Протокол для биопсии бластоциста человека, описанный здесь, следует руководящим принципам G.EN.E.R.A. Комитет по этике человеческих исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице материалов для необходимых материалов. Дополнительный необходимый материал...

<ol>
	<li>Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+stage+versus+blastocyst+stage+embryo+transfer+in+assisted+reproductive+technology.">Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).</li><li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection:+a+meta-analysis.">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Biopsy+on+Human+Embryo+Developmental+Potential+during+Preimplantation+Genetic+Diagnosis.">The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis.</a> Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+standard+blastocyst+morphology,+euploidy+and+implantation:+an+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts.">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+PGD/PGD-A+in+IVF+clinics:+considerations+for+the+best+laboratory+approach+and+management.">Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).</li><li>McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancies+and+live+births+after+trophectoderm+biopsy+and+preimplantation+genetic+testing+of+human+blastocysts.">Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).</li><li>Kokkali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+healthy+infant+following+trophectoderm+biopsy+from+blastocysts+for+PGD+of+beta-thalassaemia+major.">Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major.</a> Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).</li><li>Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preincubation+of+human+oocytes+may+improve+fertilization+and+embryo+quality+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection.</a> Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).</li><li>Wale, P. L., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+chemical+and+physical+factors+on+mammalian+embryo+culture+and+their+importance+for+the+practice+of+assisted+human+reproduction.">The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).</li><li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte,+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART:+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance.">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+blastocyst+features,+trophectoderm+biopsy+and+other+laboratory+practice+with+post-warming+behavior+and+implantation.">Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>Evans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fresh+versus+frozen+embryo+transfer:+backing+clinical+decisions+with+scientific+and+clinical+evidence.">Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence.</a> Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+reproducible+outcomes+of+blastocyst+biopsy+and+aneuploidy+screening+across+different+biopsy+practitioners:+a+multicentre+study+involving+2586+embryo+biopsies.">Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies.</a> Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+mode+and+effects+analysis+of+witnessing+protocols+for+ensuring+traceability+during+PGD/PGS+cycles.">Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles.</a> Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).</li><li>Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inconclusive+chromosomal+assessment+after+blastocyst+biopsy:+prevalence,+causative+factors+and+outcomes+after+re-biopsy+and+re-vitrification.+A+multicenter+experience.">Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+to+blastocyst+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis+and+single+embryo+transfer+at+Sydney+IVF.">Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF.</a> Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).</li><li>Capalbo, A., Rienzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+between+trophectoderm+and+inner+cell+mass.">Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass.</a> Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).</li><li>McCoy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+Selection+against+Complex+Mitotic-Origin+Aneuploidy+during+Preimplantation+Development.">Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).</li><li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not:+a+randomized+and+paired+clinical+trial.">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+births+after+transfer+of+rebiopsy+and+revitrification+of+blastocyst+that+had+&#8220;no+diagnosis&#8221;+following+trophectoderm+biopsy.">Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had &#8220;no diagnosis&#8221; following trophectoderm biopsy.</a> Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions.">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li><li>Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+mitochondrial+DNA+in+blastocoele+fluid+and+embryo+culture+medium:+evidence+and+potential+clinical+use.">Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use.</a> Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).</li><li>Vera-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+composition+of+cell-free+DNA+in+spent+medium+from+human+embryo+culture+during+preimplantation+development.">Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development.</a> Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).</li></ol>

Только опытные опытные эмбриологи, прошедшие свой учебный период, должны выполнять как биопсию TE, так и витрификацию бластоциста. Кроме того, свидетель обязан контролировать процедуры и гарантировать эффективную прослеживаемость во время i) движения биопсии бластоциста из биопсии блю...

Основной целью современной эмбриологии человека является максимизация числа живорождений на стимулируемый цикл и сокращение затрат, времени и усилий для достижения беременности. Для достижения этой цели должны быть использованы проверенные подходы к отбору эмбрионов для выявления репродуктивно компетентных эмбрионов в когорте, полученных в ходе цикла ЭКО. Согласно последним данным, бластоцист культура1 в сочетании с комплексным хромосомным тестированием и витрифицированной теплой euploid переносэмбриона эмбриона (ET) является наиболее эффективной основой для повышения эффективности ЭКО2. Очевидно, что тестирование анеуплоидии требует эмбрионального образца, который в настоящее время в основном представлен из нескольких клеток, извлеченных из трофектодерма (TE), т.е. раздела бластоциста, который дает происхождение эмбриона приложения (например, плацента) во время беременности . Помимо анализа кариотипа, также мутации одного гена могут быть оценены из биопсии Т как часть клинической стратегии, известной как предимплантационное генетическое тестирование (PGT; -A для анеуплоидий, -SR для структурных хромосомных перестановок, -M для моногенных заболеваний). Другие методы биопсии яйцеклеток/эмбрионов были теоретизированы и приняты клинически на протяжении последних десятилетий, а именно биопсия полярных тел и биопсия бластомеров. Однако их использование в настоящее время сокращается, поскольку их процедурные недостатки (например, более высокая рабочая нагрузка и риск для репродуктивного воздействия) и диагностические ограничения (например, вопросы анализа одной ячейки) неявно препятствуют достаточному балансу между издержками, рисками и льготы (для обзора см.3).
В этой работе один из основных протоколов биопсии TE тщательно описан вместе с последующими процедурами витрификации, нагревания и передачи. Рабочий процесс здесь изложены идеально подходит для занят PGT единицы.
Как уже описано ранее нашей группой4,5, процедура включает в себя последовательное открытие zona pellucida полностью расширенных бластоцистых и удаление нескольких тЭцклеток (в среднем 7-8). По сравнению с днем 3 лазерной помощи штрихучийметод биопсии 6, эта процедура может облегчить ежедневный график ЭКО единицы, где деликатные процедуры, такие как бластоциста биопсии и витрификации, должны быть своевременно выполнены. Как только бластоцист достигает своего полного расширения, биопсия может быть проведена путем выбора т.д. клеток для удаления, тем самым предотвращая риск грыжи внутренней клеточной массы (ICM), что в противном случае сделать процедуру сложной. В литературе, третий протокол бластоциста биопсии также был описан, который включает в себя лазерной помощи штриховки осуществляется после эмбриона уже достигли стадии бластоциста, за несколько часов до процедуры5,7. Однако этот подход занимает больше времени и в основном подходит для единиц ЭКО, которые внедряют биопсию TE в руках малоопытных операторов и с учетом умеренно-низкой ежедневной рабочей нагрузки.
Интрацитоплазматическая инъекция спермы (ICSI)8 должна быть консолидированной техникой, если она направлена на проведение генетического анализа при ЭКО. Аналогичным образом, надлежащая система культуры для безопасного сбора эмбрионов до стадии бластоциста имеет решающее значение для осуществления стратегии биопсии TE. Достаточное количество инкубаторов, а также использование низкого уровня кислородного напряжения являются ключевыми предпосылками для этого, чтобы не скомпрометировать бластоциста скорость9. В то же время, эффективная программа криоконсервации необходима для безопасного управления циклом PGT. В последнее десятилетие, внедрение витрификации увеличила эмбрион крио-выживаемости даже до йgt;99%10,11. Это обеспечило достаточно времени для выполнения генетического тестирования и отложить перенос эмбриона на следующий менструальный цикл, на нестимулируемый и, вероятно, более восприимчивый эндометрий12.
Биопсия TE и витрификация требуют выполнения задач, требующих строгих навыков, и их эффективность может варьироваться в зависимости от неопытных операторов. Поэтому проводится специальный учебный период, прежде чем позволять каждому оператору проводить эти процедуры клинически; кроме того, необходимо периодически оценивать повышение квалификации операторов путем мониторинга ключевых показателей эффективности (КПИ) для процедур криоконсервации и биопсии. Каждая клиника ЭКО должна установить внутренние KPI для этой цели, которые должны приблизитьте те, опубликованные международными консорциумами и / или результаты, опубликованные справочными лабораториями.
TE биопсии, витрификации потепления и свидетельские процедуры являются проверенными методами в нашем подразделении, которые были стандартизированы во всех операторов, участвующих, как сообщалось в трех предыдущих публикациях11,13,14 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold tube rack</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>XTPCR96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipette controller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>710931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet adjustable handle set</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G18674</td>
			<td>Stripper holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>66003</td>
			<td>p20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Electronic Witness System</td>
			<td>CooperSurgical Fertility &#38; Genomic Solutions</td>
			<td></td>
			<td>RI Witness ART Management System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>IVF TECH</td>
			<td></td>
			<td>Grade A air flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser objective</td>
			<td>RI</td>
			<td>Saturn 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjectors</td>
			<td>Nikon Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge for PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CSLQSPIN</td>
			<td>for 0.2ml PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5AC-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5M-PE</td>
			<td>02/CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-30FB35720</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryolock</td>
			<td>Cryolock</td>
			<td>CL-R-CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSCM complete</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90165</td>
			<td>IVF culture medium supplemented with HSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Transfer Catheter</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G17934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G26712</td>
			<td>140&#181;m stripping pipette tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G46020</td>
			<td>300&#181;m stripping pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-IH35/20</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF One well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil for embryo culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified HTF Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90126</td>
			<td>Hepes-Buffered medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Delta Surface</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td>IVF dish 4-well plate with sliding lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td>60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reproplate</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>83016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable Gilson tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td>200&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Kit</td>
			<td>Provided by the genetic lab</td>
			<td></td>
			<td>PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrification media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT801</td>
			<td>Equilibration and vitrification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>Thawing and dilution solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human blastocyst biopsy and vitrification

Биопсия Blastocyst выполняется для получения надежной генетической диагностики во время циклов ЭКО с предимплантационным генетическим тестированием. Затем идеальный рабочий процесс влечет за собой безопасный и эффективный протокол витрификации, в связи с временем поворота диагностических методов и переноса выбранного эмбриона (ы) на физиологический эндометрий в следующем естественном цикле. Подход к биопсии, охватывающий последовательное открытие zona pellucida и извлечение 5-10 трофектодермных клеток (в идеале 7-8), ограничивает как количество необходимых манипуляций, так и воздействие эмбриона на неоптимальные условия окружающей среды. После надлежащей подготовки, техника была воспроизводима между различными операторами с точки зрения сроков биопсии (8 мин, в диапазоне 3-22 мин в зависимости от количества эмбрионов к биопсии на блюдо), убедительные диагнозы, полученные (97,5%) и живой коэффициент рождаемости после vitrified-разогретый euploid blastocyst передачи (Зgt;40%). Выживаемость после биопсии, витрификации и потепления составила 99,8%. Скорость повторного расширения на 1,5 ч от потепления была выше, чем 97%, в значительной степени зависит от сроков между биопсией и витрификации (в идеале 30 мин), бластоцист морфологического качества и день биопсии. В общем, лучше vitrify рухнул бластоцист; поэтому в циклах, не связанных с PGT, может быть выполнена лазерная искусственная усадка, чтобы вызвать коллапс эмбриона до криоконсервации. Наиболее перспективной перспективой будущего является неинвазивный анализ средств массовой информации культуры ЭКО после бластоциста культуры в качестве предположительного источника эмбриональной ДНК. Однако этот потенциальный авангард все еще находится в стадии расследования, и еще предстоит определить и утвердить надежный протокол.

Рисунок 6 представляет собой схему всех результатов процедуры биопсии, которая может быть принята для стандартизации протокола и контроля за работой каждого оператора. Основным процедурным результатом является сроки завершения биопсии/биопсии; осно?...

Watch this Scientific Journal Video about Human Blastocyst Biopsy and Vitrification at JoVE.com

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Для эффективного проведения предимплантационного генетического тестирования требуется карангоцистая биопсия и витрификация. Подход, предусматривающий последовательное открытие zona pellucida и извлечение 7-8 трофектодермных клеток в день 5-7 после оплодотворения, ограничивает как количество необходимых манипуляций, так и воздействие эмбриона на неоптимальные условия окружающей среды.

Биопсия и витрификация человека

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Как бластоцист биопсии и витрификации были революцией в ЭКО, экстракорпоральное оплодотворение, что позволяет эмбриологов со всего мира для выполнения предимплантации генетического тестирования на человеческие эмбрионы с минимальным риском для эмбриона. Trophectoderm биопсии позволило извлечения около семи клеток из полностью выращенного эмбриона, тем самым позволяя надежный вниз по течению генетического анализа. Кроме того, до настоящего времени не было показано никакого воздействия на этот подход.Клиническая эффективность этого рабочего процесса позволяет пациентам с моногенными состояниями и всем пациентам с повышенным риском хромосомных аномалий в пределах их бластоцист извлечь выгоду из предимплантационного генетического тестирования. По-прежнему имеются возможности для совершенствования нынешних стратегий отбора эмбрионов. Например, miRNomic и протеомное профилирование представляют интригующие варианты в дополнение к предимплантации генетического тестирования на одной биопсии trophectoderm.Неопытные операторы часто борются с открытием и проникновением zona pellucida. Это просто вопрос фокусировки. Бластоцист, лазерная цель и пипетки должны быть на одной координационной плоскости.После маркировки биопсии блюдо с деталями пациента, с постоянным, нетоксичным маркером, число каждого 10-микролитровая капля HEPES-буферной среды с эмбрионом и цикл ID.Using 300-микрометр зачистки пипетки, передача жизнеспособной, полностью расширенный бластоцист к первой капле биопсии блюдо и промыть каплю, чтобы удалить избыток культуры среды, прежде чем двигаться. Поместите блюдо под перевернутый микроскоп, и премьер биопсии пипетки со средним от третьей капли биопсии блюдо. Под 20-кратное увеличение, сориентировать бластоцист, чтобы получить четкое представление о внутренней массе клетки в семь часов, и обеспечить эмбрион на проведение пипетки.Сосредоточьтесь на zona pellucida так, чтобы и пипетки, и бластоцист были на одной координационной плоскости. Переключитесь на лазерную цель и распояйте лазерную указку на zona pellucida на противоположной стороне внутренней клеточной массы. Просверлите zona pellucida с двумя-тремя лазерными импульсами, и осторожно нажмите биопсии пипетки против zona pellucida, чтобы среда будет взорван через нарушение, чтобы отделить трофиктодерм клетки от внутренней поверхности.Когда trophectoderm отделяется, введите через отверстие и аспирировать от семи до восьми trophectoderm клеток в биопсии пипетки с нежным всасывания. При применении умеренного всасывания растянуть целевые клетки, слегка переместить биопсии пипетки назад и направить лазер к тонкой части аспирированных клеток. Огонь от двух до пяти лазерных импульсов на стыках между клетками, чтобы отделить клетки-мишени от тела эмбриона.Когда фрагмент трофиктодерма был отделен от бластоциста, отпустите фрагмент в ту же каплю биопсии далеко от бластоциста, чтобы предотвратить втягиваемый фрагмент обратно в пипету биопсии. Освободите бластоцист от удерживаемой пипетки и быстро поднимите обе пипетки, чтобы фрагмент не прилип к пипетки. Затем изображение биопсии фрагмента для целей контроля качества.Когда все бластоцисты были биопсии, как только что продемонстрировано, переместить биопсии блюдо обратно в ламинарный капюшон потока и этикетки после биопсии культуры блюдо с парой ID и каждая капля с эмбрионом и цикл идентификаторов. В присутствии свидетеля, промыть бластоцист в чистой среде ЭКО и переместить бластоцист к его соответствующей капли в после биопсии блюдо. Затем поместите после биопсии блюдо на 37 градусов по Цельсию, 6%углекислого газа, и 5%кислородный инкубатор.В присутствии свидетеля и внутри капота ламинарного потока при комнатной температуре, этикетка ПЦР трубки с постоянным, нетоксичным маркером. Этикетка крышку 60 х 15-миллиметровый трубки культуры блюдо с биопсией эмбриона IDs, и добавить две 10-микролитровые капли биопсии стиральный раствор к блюду. Премьер 140-микрометровый зачистки пипетки с биопсией стиральный раствор от второй капли трубки блюдо под стерео микроскопом, чтобы визуализировать фрагменты trophectoderm.Аккуратно отпустите некоторые биопсии стиральный раствор на фрагмент trophectoderm, и загрузить фрагмент в зачистки пипетки. Переместите фрагмент на вторую каплю раствора для мытья биопсии и тщательно промойте ткань два-три раза. Перенесите фрагмент трофиктодерма на дно соответствующе помеченной ПЦР трубки с погрузочным раствором, заботясь о том, чтобы не касаться стенок трубки кончиком зачистки пипетки.Когда все фрагменты были добавлены в их трубы, спина все трубы в мини-центрифуги в течение нескольких секунд, чтобы осадок фрагментов. Затем храните образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию, пока они не будут отправлены в ссылаясь генетической лаборатории для тестирования. В течение 30 минут после биопсии трофиктодерма, этикетка витрификации пластины с деталями пациента и IDs бластоцист, которые должны быть vitrified.Используя специальные холодостойкие криолабели, маркировать витрификации поддерживает с именем пациента и фамилией, пара ID, ID эмбриона, который будет загружен на него, и дата процедуры. При комнатной температуре, обойтись 300 микролитров эквилибрации раствор для каждого бластоцист, который будет vitrified и, в присутствии свидетеля, использовать 300-микрометровый зачистки пипетки для перемещения бластоцист в один объем раствора эквилибрации. Оставьте бластоцист в растворе эквилибрации на 13-15 минут.После первоначального сокращения объема будет наблюдаться постепенное повторное расширение. В конце эквилибрации добавьте 300 микролитров раствора витрификации на вторую колодец пластины витрификации и перенесите полностью повторно расширенный бластоцист в раствор витрификации на одну минуту. В конце инкубации, промыть бластоцист, чтобы разбавить раствор эквилибрации и, в присутствии свидетеля, загрузить бластоцист на витрификации поддержки.Удалите избыток раствора витрификации. Тонкая пленка раствора должна окружать бластоцист. Окунитесь в поддержку витрификации в жидкий азот, и энергично перемещать поддержку, чтобы уменьшить риск образования пузырьков близко к образцу.Затем поместите защитную крышку на опору, в то время как поддержка витрификации все еще погружена в жидкий азот. Из 1 544 процедуры биопсии трофиктодерма, проведенные в течение этого репрезентативного двухгородного периода, от одного до четырех бластоцист были биопсизированы за процедуру в течение от трех до 22 минут за процедуру. На этих участках показаны средние сроки биопсии для каждого оператора вдоль триместров исследования, со средним общим значением 8,24 минут.Полезно получить изображение каждого биопсии фрагмента для целей контроля качества, чтобы оценить, была ли причина безрезультатных диагнозов вменяемой размеру и/или качеству фрагмента, тюбингу или некоторым проблемам в обработке образца в генетической лаборатории. В этом исследовании, 572 эуплоидных бластоцистов были подогреты, чтобы пройти перенос эмбриона после диагноза эвплоидии. Все бластоцисты vitrified в течение 30 минут, с 2,4% бластоцист не повторно расширяется между 31 и 90 минут и 4,9%не повторно расширяется за 90 минут от повторного овеяния.Особенно для низкого качества и / или день семь бластоцист, сроки между биопсией и витрификации кажется решающим для достижения повторного расширения после потепления. Позаботьтесь, чтобы сосредоточиться перед открытием zona pellucida при разоблачении соединения между клеткой trophectoderm и стрельбы, и заботиться также, чтобы предотвратить бластоцист повторного расширения до витрификации. Существуют два других подхода к биопсии бластоциста, которые влечет за собой открытие zona pellucida и ожидание спонтанного выгиба клеток трофиктодерма.Эти подходы проще, но требуют больше манипуляций и ото дня. Эффективность этого рабочего процесса позволяет внедрение молекулярных технологий в ЭКО, чтобы попытаться выбрать бластоцист с наибольшим шансом имплантировать перед переносом эмбриона. Помните, что не использовать любое устройство или решение, которое может быть токсичным для эмбрионов и для предотвращения загрязнения ДНК с помощью материалов, свободных от ДНК.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Выделение и количественный Иммуноцитохимическая Характеристика первичных Миогенные клеток и фибробластов из человеческих скелетных мышц

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Трехмерная Количественное дендритных шипиков пирамидальных нейронов из производных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Модифицированный MicroSecure Витрификация: Безопасный, простой и очень эффективная процедура криоконсервации для человека бластоцисты

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Малоинвазивный перенос эмбрионов и Витрификация эмбрионов на оптимальном этапе развития эмбриона в кроличьей модели

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Изоляция, Культура, Характеристика и Дифференциация клеток-прародителей мышц человека от процедуры биопсии скелетных мышц

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Определение плотности bile Duct в мышечной печени

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

Оценка зрелости яйцеклеток человека и его клиническое применение

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Поколение многоклеточных органов эндометрия человека

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...