Name: human blastocyst biopsy and vitrification
Uploaded: 2019-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Blastocyst Biopsy and Vitrification at JoVE.com

AG och RM samlade in uppgifterna och utarbetade manuskriptet. DC analyserade uppgifterna, utarbetade de representativa resultaten, utförde statistiken och reviderade manuskriptet. FMU och LR gav kritisk diskussion om resultaten och hela manuskriptet.

Protokollet för Human blastocyststadiet biopsi, här beskrivs, följer riktlinjerna i G. EN. miljöriskbedömning Human Research etikkommittén.
Anmärkning: Se tabellen med material för material som krävs. Ytterligare material som krävs innebär laboratorie skor och kläder, kirurgisk ansiktsmask, hår skydd, kirurgiska handskar, en permanent giftfri markör, pinps och desinfektionsmedel. Användningen av kirurgisk klänning, engångskirurgiska handskar, ...

<ol>
	<li>Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+stage+versus+blastocyst+stage+embryo+transfer+in+assisted+reproductive+technology.">Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).</li><li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection:+a+meta-analysis.">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Biopsy+on+Human+Embryo+Developmental+Potential+during+Preimplantation+Genetic+Diagnosis.">The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis.</a> Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+standard+blastocyst+morphology,+euploidy+and+implantation:+an+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts.">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+PGD/PGD-A+in+IVF+clinics:+considerations+for+the+best+laboratory+approach+and+management.">Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).</li><li>McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancies+and+live+births+after+trophectoderm+biopsy+and+preimplantation+genetic+testing+of+human+blastocysts.">Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).</li><li>Kokkali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+healthy+infant+following+trophectoderm+biopsy+from+blastocysts+for+PGD+of+beta-thalassaemia+major.">Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major.</a> Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).</li><li>Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preincubation+of+human+oocytes+may+improve+fertilization+and+embryo+quality+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection.</a> Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).</li><li>Wale, P. L., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+chemical+and+physical+factors+on+mammalian+embryo+culture+and+their+importance+for+the+practice+of+assisted+human+reproduction.">The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).</li><li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte,+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART:+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance.">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+blastocyst+features,+trophectoderm+biopsy+and+other+laboratory+practice+with+post-warming+behavior+and+implantation.">Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>Evans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fresh+versus+frozen+embryo+transfer:+backing+clinical+decisions+with+scientific+and+clinical+evidence.">Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence.</a> Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+reproducible+outcomes+of+blastocyst+biopsy+and+aneuploidy+screening+across+different+biopsy+practitioners:+a+multicentre+study+involving+2586+embryo+biopsies.">Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies.</a> Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+mode+and+effects+analysis+of+witnessing+protocols+for+ensuring+traceability+during+PGD/PGS+cycles.">Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles.</a> Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).</li><li>Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).</li><li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inconclusive+chromosomal+assessment+after+blastocyst+biopsy:+prevalence,+causative+factors+and+outcomes+after+re-biopsy+and+re-vitrification.+A+multicenter+experience.">Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience.</a> Human Reproduction. , (2018).</li><li>de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+to+blastocyst+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis+and+single+embryo+transfer+at+Sydney+IVF.">Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF.</a> Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).</li><li>Capalbo, A., Rienzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+between+trophectoderm+and+inner+cell+mass.">Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass.</a> Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).</li><li>McCoy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+Selection+against+Complex+Mitotic-Origin+Aneuploidy+during+Preimplantation+Development.">Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).</li><li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not:+a+randomized+and+paired+clinical+trial.">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+births+after+transfer+of+rebiopsy+and+revitrification+of+blastocyst+that+had+&#8220;no+diagnosis&#8221;+following+trophectoderm+biopsy.">Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had &#8220;no diagnosis&#8221; following trophectoderm biopsy.</a> Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions.">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li><li>Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+mitochondrial+DNA+in+blastocoele+fluid+and+embryo+culture+medium:+evidence+and+potential+clinical+use.">Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use.</a> Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).</li><li>Vera-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+composition+of+cell-free+DNA+in+spent+medium+from+human+embryo+culture+during+preimplantation+development.">Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development.</a> Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).</li></ol>

Endast väl erfarna skickliga embryologer som har avslutat sin träningsperiod bör utföra både TE biopsi och blastocyststadiet vitrifiering. Dessutom krävs ett vittne för att övervaka förfarandena och garantera en effektiv spårbarhet under i) förflyttning av biopsier blastocysten från biopsi skålen (kompletterande figur 1) till post-biopsi skålen (kompletterande figur 1 ), därefter till förglasnings plattan (kompletterande figur 1) och slutligen till förgl...

Det huvudsakliga målet med modern mänsklig embryologi är att maximera antalet levande födda per stimulerad cykel och minska kostnader, tid och ansträngningar för att uppnå en graviditet. För att uppnå detta mål bör validerade metoder för embryoval användas för att identifiera reproduktivt kompetenta embryon inom en kohort som erhållits under en IVF-cykel. Enligt de senaste bevisen, blastocyststadiet kultur1 kombinerat med omfattande kromosomala tester och förglasad-värmda euploid Embryo Transfer (et) är den mest effektiva ramen för att öka IVF effektivitet2. Det är uppenbart att aneuploidi-tester kräver ett embryonala preparat, som för närvarande huvudsakligen representeras av få celler som hämtats från trophectoderm (te), det vill säga den del av blastocysten som ger ursprung till embryobilagor (t. ex. moderkakan) under graviditet . Bortom karyotypanalysen kan även enstaka genmutationer bedömas från en vävnads analys som en del av en klinisk strategi som kallas preimplantatorisk genetisk testning (PGT;-A för aneuploidier,-SR för strukturella kromosom rekonstruktioner,-M för monogena sjukdomar). Andra äggocyter/embryo biopsi metoder har teoretiserade och antas kliniskt under de senaste decennierna, nämligen Polar organ biopsi och biopsi biopsi. Deras användning minskar dock nuförtiden eftersom deras processuella nackdelar (t. ex. högre arbetsbörda och risk för reproduktionseffekter) och diagnostiska begränsningar (t. ex. problem med enstaka cell analyser) implicit hindrar en tillräcklig balans mellan kostnader, risker och förmåner (för en översyn se3).
I detta papper, en av de viktigaste protokollen för TE biopsi är grundligt beskrivs tillsammans med efterföljande förglasning, uppvärmning och förfaranden för överföring krävs. Arbetsflödet här som beskrivs är perfekt för en upptagen PGT-enhet.
Som redan beskrivits tidigare av vår grupp4,5, innebär förfarandet den sekventiella öppnandet av zona pellucida av fullt expanderade blastocyster och avlägsnande av några te celler (i genomsnitt 7-8). Jämfört med den dag 3 Laser-assisted kläcknings-baserade blastocyststadiet biopsi metod6, detta förfarande kan lindra det dagliga schemat för en IVF-enhet där känsliga förfaranden, såsom blastocyststadiet biopsi och förglasning, måste utföras i tid. Så snart blastocysten når sin fulla expansion, kan biopsi utföras genom att välja te celler att ta bort, vilket förhindrar risken för diskbråck av inre cellmassan (ICM), som annars skulle göra förfarandet utmanande. I litteraturen har även ett tredje protokoll med blastocystbiopsi beskrivits, vilket innebär att laser assisterad kläckning utförs när embryot redan har nått blastocyststadiet, några timmar före förfarandet5,7. Men detta tillvägagångssätt är mer tidskrävande och främst passar IVF-enheter som genomför TE biopsi i händerna på Limit erfarna operatörer och med utsikt över en måttlig-låg daglig arbetsbelastning.
Intracytoplasmatisk spermie injektion (ICSI)8 bör vara en konsoliderad teknik om syftet är att utföra genetiska analyser inom IVF. På samma sätt är ett lämpligt kultur system för att på ett säkert sätt skörda embryon till blastocyststadiet avgörande för genomförandet av strategin för TE-biopsi. Ett tillräckligt antal inkubatorer, liksom användningen av låg syre spänning är viktiga förutsättningar för detta ändamål, inte för att äventyra blastocysthastigheten9. Samtidigt, ett effektivt kryopreservation program behövs för att säkert hantera en PGT cykel. Under det senaste decenniet har genomförandet av förglasning ökat embryo Cryo-överlevnaden ända upp till > 99%10,11. Detta gav tillräckligt med tid för att utföra genetisk testning och skjuta embryoöverföring till följande menstruationscykeln, på en icke-stimulerad och förmodligen mer mottaglig endometriet12.
Både TE biopsi och förglasning är krävande uppgifter som kräver strikta färdigheter och deras effektivitet kan variera mellan oerfaren aktörer. En särskild utbildningsperiod förordas därför innan varje verksamhetsutövare ges möjlighet att utföra dessa förfaranden kliniskt. Dessutom bör bibehållandet av operatörernas kompetens bedömas regelbundet genom övervakning av nyckeltal (KPI) för kryopreservering och biopsiprocedurer. Varje IVF-klinik bör ställa interna nyckeltal i detta syfte, som måste approximera de som publicerats av internationella konsortium och/eller de resultat som publicerats av referenslaboratorier.
TE biopsi, förglasning-uppvärmningen och bevittnande förfaranden är validerade tekniker på vår enhet, som har standardiserats i alla inblandade aktörer som rapporterats i tre tidigare publikationer11,13,14 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold tube rack</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>XTPCR96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipette controller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>710931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet adjustable handle set</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G18674</td>
			<td>Stripper holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>66003</td>
			<td>p20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Electronic Witness System</td>
			<td>CooperSurgical Fertility &#38; Genomic Solutions</td>
			<td></td>
			<td>RI Witness ART Management System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>IVF TECH</td>
			<td></td>
			<td>Grade A air flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser objective</td>
			<td>RI</td>
			<td>Saturn 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjectors</td>
			<td>Nikon Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge for PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CSLQSPIN</td>
			<td>for 0.2ml PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5AC-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5M-PE</td>
			<td>02/CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-30FB35720</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryolock</td>
			<td>Cryolock</td>
			<td>CL-R-CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSCM complete</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90165</td>
			<td>IVF culture medium supplemented with HSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Transfer Catheter</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G17934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G26712</td>
			<td>140&#181;m stripping pipette tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexipet pipette</td>
			<td>Cook</td>
			<td>G46020</td>
			<td>300&#181;m stripping pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>RI</td>
			<td>7-71-IH35/20</td>
			<td>30&#181;m ID, flat 35&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF One well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil for embryo culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified HTF Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90126</td>
			<td>Hepes-Buffered medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Delta Surface</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td>IVF dish 4-well plate with sliding lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td>60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reproplate</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>83016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable Gilson tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td>200&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Kit</td>
			<td>Provided by the genetic lab</td>
			<td></td>
			<td>PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrification media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT801</td>
			<td>Equilibration and vitrification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming media</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>Thawing and dilution solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human blastocyst biopsy and vitrification

Blastocystbiopsi utförs för att erhålla en tillförlitlig genetisk diagnostik under IVF-cykler med preimplantatorisk genetisk testning. Sedan, det ideala arbetsflödet innebär en säker och effektiv förglasning protokoll, på grund av handläggningstiden för diagnostiska tekniker och att överföra de valda embryot (s) på en fysiologisk endometriet i en följande naturlig cykel. En biopsi metod som omfattar den sekventiella öppnandet av zona pellucida och hämtning av 5-10 trophectoderm celler (helst 7-8) begränsar både antalet manipulationer som krävs och exponeringen av embryot till suboptimala miljöförhållanden. Efter ordentlig träning, var tekniken reproducerbar mellan olika aktörer när det gäller tidpunkten för biopsi (~ 8 min, som sträcker sig 3-22 min baserat på antalet embryon till biopsi per maträtt), avgörande diagnoser erhålls (~ 97,5%) och levande födelsetalen efter förglasad-värmde euploid blastocyststadiet överföring (> 40%). Överlevnaden efter biopsi, förglasning och uppvärmningen var så hög som 99,8%. Den re-expansion på 1,5 h från uppvärmningen var så hög som 97%, till stor del beroende av tidpunkten mellan biopsi och förglasning (helst ≤ 30 min), blastocyststadiet morfologisk kvalitet och dag av biopsi. I allmänhet är det bättre att vitrify en kollapsad blastocyst; i icke-PGT-cykler kan därför laserassisterad konstgjord krympning utföras för att inducera embryokollaps före frysförvaring. Det mest lovande framtidsperspektivet är den icke-invasiva analysen av IVF-kulturmedierna efter blastocystkulturen som en förmodad källa till embryonala DNA. Detta potentiella Avant-Garde är dock fortfarande under utredning och ett tillförlitligt protokoll måste ändå definieras och valideras.

Figur 6 är ett system av alla utfall av en biopsi förfarande som kan antas för att standardisera protokollet och övervaka prestandan hos varje aktör. Den viktigaste processuella resultatet är tidpunkten för att slutföra biopsi/biopsier; Det viktigaste tekniska resultatet är kvaliteten på den tomt som produceras efter genetiska tester som kan resultera i antingen en avgörande eller tveksam diagnos, varav den senare kräver en ny biopsi av odiagnosti...

Watch this Scientific Journal Video about Human Blastocyst Biopsy and Vitrification at JoVE.com

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Blastocystbiopsi och förglasning krävs för att effektivt genomföra preimplantatorisk genetisk testning. Ett tillvägagångssätt som innebär en sekventiell öppning av zona pellucida och hämtning av 7-8 trophectoderm-celler i dag 5-7 efter insemination begränsar både antalet manipulationer som krävs och embryots exponering för att under optimala miljöförhållanden.

Human blastocyst biopsi och förglasning

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Både blastocyst biopsi och förglasning har varit en revolution i IVF, provrörsbefruktning, vilket gör att embryologer från hela världen att utföra preimplantation genetisk testning på mänskliga embryon med minimal risk för embryot. Trophectoderm biopsi har gjort det möjligt att hämta cirka sju celler från ett fullvuxet embryo, vilket möjliggör robust nedströms genetisk analys. Dessutom har det hittills inte visats någon inverkan på detta tillvägagångssätt.Den kliniska effektiviteten i detta arbetsflöde gör att patienter med monogena villkor och alla de patienter med ökad risk för kromosomal avvikelser inom deras blastocyst att dra nytta av preimplantation genetisk testning. Det finns fortfarande utrymme för att förbättra de nuvarande strategierna för embryourval. Till exempel, miRNomic och proteomic profilering representerar spännande alternativ för att komplettera preimplantatori genetisk testning på en enda trophectoderm biopsi.Oerfarna operatörer kämpar ofta med att öppna och tränga in i zona pellucida. Det är bara en fråga om fokus. Blastocyst, laser mål, och pipetter bör vara på samma fokalplan.Efter att ha märkt biopsiskålen med patientens detaljer, med en permanent, giftfri markör, nummer varje 10-microliter droppe HEPES-buffrat medium med embryot och cykel-ID.Använda en 300-mikrometer strippa pipett, överföra en livskraftig, helt expanderad blastocyst till den första droppen av biopsi skålen och skölj droppe för att ta bort överskottet kultur mediet, innan du flyttar blastocyst i den andra droppen i skålen. Placera skålen under ett inverterat mikroskop, och prime biopsi pipetten med medium från den tredje droppen av biopsi skålen. Under en 20 gånger förstoring, orientera blastocyst för att få en klar bild av den inre cellmassan klockan sju, och säkra embryot på anläggningen pipett.Fokusera på zona pellucida så att både pipetterna och blastocysten är på samma fokalplan. Byt till lasermålet, och placera laserpekaren på zona pellucida på motsatt sida av den inre cellmassan. Borra zona pellucida med två till tre laserpulser, och tryck försiktigt biopsipipetten mot zona pellucida så att medium kan blåsas genom brottet för att lossa trofrotekodermcellerna från den inre ytan.När trophectoderm lossnar, gå in genom hålet och aspirera sju till åtta trophectoderm celler i biopsi pipetten med mild sug. Samtidigt som man applicerar en måttlig sug för att sträcka ut målcellerna, flytta något biopsipipetten bakåt och rikta lasern mot den tunnaste delen av de aspirerade cellerna. Avfyra två till fem laserpulser vid korsningarna mellan cellerna för att skilja målcellerna från embryots kropp.När trophectoderm-fragmentet har separerats från blastocyst, släpp fragmentet i samma biopsi droppe långt från blastocyst för att förhindra att fragmentet sugs tillbaka in i biopsi pipett. Släpp blastocyst från anläggningen pipett, och snabbt höja båda pipetter för att förhindra att fragmentet fastnar på pipetter. Sedan bild det biopsied fragmentet för kvalitetskontroll ändamål.När alla blastocyster har biopsied som just visat, flytta biopsi skålen tillbaka till laminar flöde huva och märka efter biopsi kultur skålen med paret ID och varje droppe med embryot och cykel-ID. I närvaro av ett vittne, skölj blastocyst i ren IVF medium och flytta blastocyst till dess motsvarande droppe i efter biopsi skålen. Placera sedan efter biopsi skålen till en 37-graders Celsius, 6% koldioxid, och 5% syre inkubator.I närvaro av vittnet och inuti en laminär flödeshuv vid rumstemperatur, märka PCR-rören med en permanent, giftfri markör. Märk locket på en 60 x 15-millimeters slangkulturskål med biopsied embryo-ID: erna och tillsätt två 10-mikroliter droppar biopsitvättlösning till skålen. Prime en 140-mikrometer strippa pipett med biopsi tvättlösning från den andra droppen av slangen skålen under stereo mikroskop för att visualisera trophectoderm fragment.Släpp försiktigt några biopsi tvättlösning på trophectoderm fragmentet, och ladda fragmentet i strippning pipett. Flytta fragmentet till den andra droppen av biopsi tvättlösning, och skölj försiktigt vävnaden två till tre gånger. Överför trophectoderm-fragmentet till botten av det lämpligt märkta PCR-röret med lastningslösning, var noga med att undvika att röra vid rörets väggar med spetsen på avstrypningspipetten.När alla fragment har lagts till sina rör, snurra alla rör i en mini centrifug i några sekunder för att sediment fragmenten. Förvara sedan proverna på minus 20 grader Celsius tills de skickas till det hänvisande genetiska laboratoriet för testning. Inom 30 minuter av trophectoderm biopsi, etikett en förglasning platta med patientens detaljer och ID för blastocysts som måste förglasas.Med hjälp av särskilda kalla temperaturbeständiga cryolabels, etikett förglasning stöder med patientens namn och efternamn, par ID, ID av embryot som kommer att laddas på den, och datum för förfarandet. Vid rumstemperatur, dispensera 300 mikroliter av jämviktslösning för varje blastocyst som kommer att förglasas och, i närvaro av ett vittne, använd en 300-mikrometer strippning pipetten för att flytta blastocyst i en volym av jämvikt lösning. Låt blastocysten vara kvar i jämviktslösningen i 13 till 15 minuter.Efter en inledande krympning av volymen kommer en gradvis återexpansion att observeras. I slutet av jämvikten, tillsätt 300 mikroliter av förglasningslösning till den andra brunnen av förglasningsplattan och överför den helt åter expanderade blastocysten till förglasningslösningen i en minut. Vid slutet av inkubationen skölj blastocysten för att späda ut jämviktslösningen och, i närvaro av ett vittne, lasta blastocyst på förglasningsstödet.Ta bort överskottet av förglasningslösning. En subtil film av lösning bör omge blastocyst. Kasta förglasningsstödet i flytande kväve, och flytta kraftfullt stödet för att minska risken för bubblabildning nära exemplaret.Placera sedan skyddslocket på stödet medan förglasningsstödet fortfarande är nedsänkt i flytande kväve. Av de 1, 544 trophectoderm biopsi förfaranden som genomförs under denna representativa tvåårsperiod, mellan en till fyra blastocysts var biopsied per förfarande för mellan tre till 22 minuter per förfarande. I dessa tomter visas medelvärdet för biopsin för varje operatör längs studietrimmestern, med ett genomsnittligt totalvärde på 8,24 minuter.Det är bra att förvärva en bild av varje biopsied fragment för kvalitetskontroll ändamål att utvärdera om orsaken till ofullständiga diagnoser var tilla tiska till del av dimensionen och / eller kvaliteten på fragmentet, till slangen, eller till vissa frågor i bearbetningen av provet i det genetiska laboratoriet. I denna studie, 572 euploid blastocysts värmdes att genomgå ett embryo överföring efter en diagnos av euploidy. Alla blastocysts förglasas inom 30 minuter, med 2,4%av blastocysts inte expandera mellan 31 och 90 minuter och 4,9%inte åter expanderar bortom 90 minuter från rewarming.Speciellt för dålig kvalitet och / eller dag sju blastocysts, timingen mellan biopsi och förglasning verkar avgörande för att uppnå åter expansion efter uppvärmningen. Var noga med att fokusera innan du öppnar zona pellucida när du exponerar korsningen mellan trophectoderm cell och bränning, och var försiktig också för att förhindra blastocyst åter expansion före förglasning. Två andra blastocyst biopsi metoder finns, både innebär zona pellucida öppning och väntar på en spontan arching av trophectoderm cellerna.Dessa tillvägagångssätt är lättare men kräver fler manipulationer och är mer tidskrävande. Effekten av detta arbetsflöde möjliggör genomförandet av molekylär teknik i IVF för att försöka välja blastocyst med den högsta chansen att implantera innan embryoöverföringen. Kom ihåg att inte använda någon anordning eller lösning som kan vara giftig för embryona och för att förhindra DNA-kontaminering genom att använda DNA-fria material.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering och Kvantitativ Immuncytokemiska karakterisering av primära myogena celler och fibroblaster från Human skelettmuskulatur

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensionell Kvantifiering av Dendritutskotten från Pyramidal nervceller Härstammar från Human inducerade pluripotenta stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Odling av humana pluripotenta och neurala stamceller i en sluten cellodlingssystem för Basic och preklinisk forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Ändrad MicroSecure Förglasning: En säker, enkel och mycket effektiv Kryokonservering ordningen för mänskliga Blastocyster

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalinvasiv embryoöverföring och embryo-förglasning vid det optimala embryonala steget i Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolering, kultur, karakterisering, och differentiering av humana muskelstamceller från skelettmuskulaturen biopsi förfarande

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bestämning av gallgången densitet i mus levern

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

Bedömning av Human ägg mognad och dess kliniska tillämpning

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generering av Multicellulära humana primära Endometrieorganoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...