Name: in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

تم تمويل المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (AI128406 www.nih.gov) إلى ZY وجزئيا من قبل مركز جونسون لأبحاث السرطان (http://cancer.k-state.edu) في شكل راتب الصيف طالب الدراسات العليا إلى PD.

1. اعداد قالب الحمض النووي من قبل PCR للنسخ في المختبر
<ol><li>لاعداد قالب الحمض النووي من قبل PCR ، تصميم الإشعال. عند تصميم الإشعال النظر في الخصائص الحاسمة مثل طول التمهيدي ، ودرجه الحرارة الصلب (Tm) ، GC المحتوي ، 3 ' نهاية مع G أو C الخ. ملاحظه: تناقشت [أين دتيل] في هذا أدب<su...

<ol>
	<li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+protein+synthesis.">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li><li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Dogma+of+Molecular+Biology.">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes:+Mechanisms+and+Biological+Targets.">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress.">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li><li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).</li><li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes.">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li><li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+Translation:+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells.">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).</li><li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+against+the+Tide:+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff.">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li><li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5&#8217;+noncoding+region.">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5&#8217; noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li><li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA.">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li><li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3&#8242;+or+the+5&#8242;+untranslated+region.">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3&#8242; or the 5&#8242; untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li><li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3&#8242;+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses.">3&#8242; Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li><li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+poly(A)+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES.">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li><li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response.">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li><li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+poly(A)+leaders+of+variable+lengths+at+the+5&#8217;+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs.">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5&#8217; ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li><li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5&#8217;+poly(A)+leader+on+its+early+transcript.">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5&#8217; poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li><li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5&#8242;+poly(A)+leader.">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5&#8242; poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li><li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+initiation+and+3&#8242;+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs.">Pervasive initiation and 3&#8242; end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li><li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5&#8217;-poly(A)+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation.">The 5&#8217;-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase.">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li><li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff.">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li><li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors.">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23 (2005).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing.">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+the+5&#8242;+and+3&#8242;+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts.">Genome-Wide Analysis of the 5&#8242; and 3&#8242; Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li><li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).</li><li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter.">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li><li>Thornton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+by+Overlap+Extension+PCR+to+Obtain+Hybrid+DNA+Products.">Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products.</a> The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).</li><li>Akichika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific+terminal+N6-methylation+of+RNA+by+an+RNA+polymerase+II&#8211;associated+methyltransferase.">Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II&#8211;associated methyltransferase.</a> Science. , (2018).</li><li>Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific,+terminal+N6-methylation+by+a+mammalian+m6Am+methyltransferase.">Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase.</a> Cell Research. 1, (2018).</li><li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome.">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862 (2018).</li><li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation.">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+m6A,+m6Am,+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm.">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li></ol>

جميع الخطوات الاربعه الاساسيه هي حاسمه لنجاح في المختبر المستندة إلى الحمض الريبي النيبالي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز. وينبغي إيلاء اهتمام خاص لتصميم التمهيدي ، وخاصه بالنسبة للتسلسل المروج T7. T7 [رنا] [بولمرس] يبدا نسخ من ال يؤكد اولي [غ] ([غ] [ز-5 '-UTR-أب-]) في T7 مروج يضيف قبل ال [5 '-utr] ت...

وفقا ل العقيدة مركزيه, يتدفق معلومة وراثيه من [دنا] إلى [رنا] وبعد ذلك أخيرا إلى بروتين1,2. وينظم هذا التدفق من المعلومات الوراثية للغاية علي العديد من المستويات بما في ذلك mrna الترجمة3,4. ومن شان تطوير اختبارات المراسلين لقياس تنظيم التعبير الجيني ان ييسر فهم أليات التنظيمية المعنية بهذه العملية. هنا نحن وصف بروتوكول لدراسة mrna الترجمة باستخدام في المختبر المستندة إلى الجيش الريبي النيبالي القائم علي فحص المخبر لوسيفيراز في الخلايا المصابة poxvirus.
وتشمل الفيروسات العديد من مسببات الامراض البشرية والحيوانية خطيره جدا5. مثل جميع الفيروسات الأخرى ، poxvirusesات تعتمد حصرا علي آلات الخلية المضيفة لتخليق البروتين6،7،8. لتوليف بكفاءة البروتينات الفيروسية ، تطورت الفيروسات العديد من الاستراتيجيات لخطف آلات الخلوية الانتقالية لأعاده توجيهها لترجمه mrnas الفيروسية7،8. وتتمثل أحدي أليات الشائعة الاستخدام بواسطة الفيروسات في استعمال عناصر رابطه الدولالمستقلة في محاضرها. ومن الامثله البارزة علي ذلك الموقع الداخلي للدخول إلى الريبوسوم (المعهد الوطني للترجمة) ومحسن الترجمة المستقلة بالكاب (سايت)9و10و11. هذه العناصر cisجعل المستنسخات الفيروسية ميزه متعديه من خلال جذب آلات متعديه عبر أليات متنوعة12,13,14. أكثر من 100 الفيروسه الجدريه mrnas لديها تطور العنصر cis-بالوكالة بالانابه في 5 '-المنطقة غير المترجمة (5 '-utr): 5 '-بولي (a) زعيم في غاية 5 ' نهايات من هذه mrnas15,16. أطوال هذه 5 '-بولي (ا) القادة غير المتجانسة والتي تولدها الانزلاق من الحمض الريبي النيبالية المشفرة poxvirus خلال النسخ17,18. ونحن ، وغيرها ، اكتشفت مؤخرا ان الزعيم 5 '-بولي (A) يمنح ميزه الترجمة إلى mrna في الخلايا المصابة بفيروس فاكينيا (vacv) ، عضو تراجعي من poxviruses19،20.
في المختبر وقد تم تطويره في البداية لفهم دور 5 '-بولي (A) الرائدة في الترجمة في mrna التي كتبها الحمض الريبي النيبالي-المستندة إلى المخبر المخبري الفحص خلال العدوى الفيروسه الجدريه19,21. علي الرغم من ان التحاليل المستندة إلى الحمض النووي plasferase علي أساس الدنا وقد استخدمت علي نطاق واسع ، وهناك العديد من العيوب التي من شانها ان تعقد تفسير النتيجة في الخلايا المصابة poxvirus. أولا ، البلازميدات قادره علي تكرار في الخلايا المصابة VACV22. الثانية ، وغالبا ما يحدث النسخ خفي من البلازميد الحمض النووي18،23،24. الثالثة ، VACV المروج يحركها النسخ يولد بولي (A)-زعيم أطوال غير متجانسة مما يجعل من الصعب السيطرة علي بولي (A)-طول الزعيم في بعض التجارب18. في المختبر التي كتبها الجيش الريبي النيبالي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز بالتفاف هذه القضايا وتفسير البيانات واضحة.
هناك أربع خطوات رئيسيه في هذا الأسلوب: (1) تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) لتوليد قالب الحمض النووي للنسخ في المختبر. (2) في النسخ الأنبوبي لتوليد mRNA ؛ (3) النقل العابر لتسليم mRNA إلى الخلايا ؛ و (4) الكشف عن نشاط لوسيفيراز كمؤشر للترجمة (الشكل 1). الناتج PCR الفتحة يحتوي علي العناصر التالية في 5 ' إلى 3 ' الاتجاه: T7 المروج ، بولي (A) زعيم أو المطلوب 5 '-utr تسلسل ، اليراع لوسيفيراز فتح اطار القراءة (ORF) متبوعا بولي (a) الذيل. يستخدم PCR الاتساع كقالب لتوليف mRNA من خلال النسخ في المختبر باستخدام T7 البوليميرات. خلال النسخ في المختبر ، يتم تضمين m7G كاب أو غيرها من التناظرية غطاء في mrna توليفها حديثا. يتم نقل النصوص التي تمت تغطيتها إلى خلايا غير مصابه أو خاليه من العدوى. يتم جمع الخلية محلله في الوقت المطلوب بعد التحويل لقياس الانشطه لوسيفيراز التي تشير إلى إنتاج البروتين من mrna المحولة. ويمكن استخدام هذا الفحص الصحفي لدراسة تنظيم الترجمة من قبل رابطه الدولالمستقلة-عنصر الحاضر في 5 '-utr ، 3 '-utr أو مناطق أخرى من mrna. وعلاوة علي ذلك ، فان الفحص المستند إلى الحمض الريبي في المختبر يمكن استخدامه لدراسة أليات مختلفه لبدء الترجمة بما في ذلك البدء المعتمد علي الغطاء ، والبدء المستقل ، وأعاده البدء ، والبدء الداخلي مثل المعهد الوطني للدراسات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492</td>
			<td>High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td>Anti reverse Cap analog or ARCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3693</td>
			<td>Opaque walled 96 well white plate with solid bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td>
			<td>OMEGA BIO-TEK</td>
			<td>D6492</td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM2010</td>
			<td>Referred as multimode plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td>In-Vitro transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Used to measure DNA and RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td>RNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080</td>
			<td>Capping system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells

كل mrna الفيروسه الجدريه المنسوخة بعد الفيروسية الحمض النووي النسخ المتماثل لديه المحافظة علي التطور ، غير--templated 5 '--بولي (A) زعيم في 5 '-utr. لتشريح دور 5 '-بولي (A) الرائدة في الترجمة mrna اثناء العدوى الفيروسه الجدريه وضعنا في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي علي أساس الفحص الصحفي لوسيفيراز. هذا الفحص الصحفي يتكون من أربع خطوات أساسيه: (1) PCR لتضخيم قالب الحمض النووي للنسخ في المختبر. (2) في النسخ الأنبوبي لتوليد mRNA باستخدام T7 الجيش النيبالي الريبي البوليميريز; (3) الانتقال إلى إدخال في المختبر كتبت mRNA في الخلايا ؛ (4) الكشف عن نشاط لوسيفيراز كمؤشر للترجمة. فحص المخبر لوسيفيراز المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي وصفت هنا القضايا من النسخ المتماثل البلازميد في الخلايا المصابة poxvirus والنسخ خفي من البلازميد. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد تنظيم الترجمة من قبل عناصر رابطه الدولالمستقلة في mrna بما في ذلك 5 '-utr و 3 '-utr في أنظمه أخرى غير الخلايا المصابة بفيروسات. وعلاوة علي ذلك ، يمكن التحقيق في طرق مختلفه لبدء الترجمة مثل الاعتماد علي الغطاء ، والغطاء المستقل ، وأعاده البدء ، والبدء الداخلي باستخدام هذه الطريقة.

الخطوات الأربع من في المختبر التي كتبها الحمض النووي الريبي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز: PCR لتوليد قالب DNA للنسخ في المختبر ، في النسخ الأنبوبي لتوليد mrna ، نقل mrna ، وقياس لوسيفيراز ، يمكن ان ينظر اليه في الرسم التخطيطي ( الشكل 1). ويتضح تصميم الإشعال لك...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

نحن نقدم بروتوكولا لدراسة قواعد الترجمة mRNA في الخلايا المصابة بفيروس الإيدز باستخدام في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي القائم علي فحص المخبر. ويمكن استخدام الفحص لدراسة تنظيم الترجمة من قبل رابطه الدولالمستقلة-عناصر من mrna ، بما في ذلك 5 '-المنطقة غير المترجمة (utr) و 3 '-utr. يمكن أيضا فحص أوضاع بدء الترجمة المختلفة باستخدام هذه الطريقة.

في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي القائم علي الفحص التشخيصي لدراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة Poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

لدينا بروتوكول لفيرو نسخها الحمض النووي الريبي القائم على luciferase المقايس يساعد على دراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة فيروس الجدري. بالإضافة إلى ذلك، يسمح طول بولي (A) لتر مخصص لدراسة آثاره التنظيمية على الترجمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة تنظيم الترجمة من قبل عناصر رابطة الدول المستقلة مثل 5'UTR و 3'UTR في مرنا وطيف واسع من بدء الترجمة.قد تكون مقايسة مراسل luciferase التي تستند إلى الحمض النووي الريبي في المختبر مصممة خصيصًا لدمج التعديل على الحد الأقصى والتعديل الآخر واستخدامها لاختبار التأثير على الترجمة. للبدء ، وتصميم إلى الأمام وعكس التمهيدي لتوليد ابر ابر ابر تحتوي على العناصر التالية في 5'to 3'direction : T7 - المروج ، Poly(A) liter, اليرا فيتر لوسيفيراز ORF في بولي (A) الذيل المشار إليها باسم T7_12A فلوك, وتشمل عدة نيوكليوتيدات اضافية في التمهيدي إلى الأمام تليها T7-المروج بولي (A) لتر أو المطلوب 5'UTR تسلسل وتقريرا 20 النيوكليوتيدات المقابلة ل5'نهاية من ORF الجينات مراسل. ضبط طول التمهيدي على أساس ذوبان درجة الحرارة المقابلة ل5'نهاية من مورون مراسل ORF ضمان أن المنطقة المقابلة في التمهيدي مطابقا لخيطا الإحساس من الجين.ثم تصميم التمهيدي العكسي لتشمل بولي (A) الذيل وحوالي 20 النيوكليوتيدات. ضبط على أساس ذوبان درجة الحرارة المقابلة ل3'نهاية من ORF الجينات مراسل ضمان أن المنطقة المقابلة من التمهيدي مطابقا لخيطا antisense من الجين وتوقف في الإطار كودون موجود قبل بولي (A) الذيل. للرقابة الداخلية، تصميم مجموعة أخرى من التمهيديات التي تحتوي على العناصر التالية في 5'إلى 3'direction: T7-Promoter، وهو تسلسل الترميز 5'UTR عشوائي يحتوي على تسلسل كوزاك، رينيه لوسيفراز ORF، وبولي (A) الذيل، ويشار إلى T7_Kozak-Rluc.لإعداد رد فعل، إضافة الكواشف بالترتيب التالي إلى أنبوب PCR: DNase المياه الحرة، 2X عالية الدقة الحمض النووي البوليمرات، التمهيديات وتسلسل أكد luciferase قالب الحمض النووي. بعد دورة PCR القياسية من ثلاث خطوات لتوليد قالب الحمض النووي، والكشف عن المنتج PCR عن طريق تشغيل 5-10٪ من تفاعل PCR في 1٪ agarose TAE هلام electrophoresis جنبا إلى جنب مع معيار الوزن الجزيئي. لتحديد حجم المنتج PCR، تصور هلام تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية.بعد تحديد الحجم الصحيح للمنتج PCR، تنقية باستخدام طقم تنقية PCR المتاحة تجاريا باستخدام 100 ميكرولترات من المياه الحرة النوى ل elute الحمض النووي. تحقق من تركيز الحمض النووي المنقى باستخدام مقياس الطيف وتخزينه عند ناقص 20 درجة مئوية للاستخدام في النسخ في المختبر على الفور. لتجميع RNA من المنتج PCR، إضافة الكواشف التالية إلى أنبوب microcentrifuge: DNase-RNase المياه الحرة، ومزيج العازلة NTP، كاب التناظرية، PCR قالب المنتج، و T7-RNA البوليميراز مزيج من في مجموعة النسخ في المختبر.اخلطي جيداً. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ومن ثم المضي قدما في تنقية الحمض النووي الريبي توليفها باستخدام طقم تنقية RNA. للتحقق من الحمض النووي الريبي المنقى، سخني الحمض النووي الريبي عند 70 درجة لمدة خمس دقائق لإزالة الهيكل الثانوي وتشغيله على هلام 1.5 agarose TBE.ثم تصور هلام تحت مضيئة الأشعة فوق البنفسجية. تحقق من تركيز الحمض النووي الريبي المنقى باستخدام مقياس الطيف الضوئي. Aliquot ذلك وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.بذور خلايا HeLa في 24 بئر لوحة لتحقيق 80-90٪ التقاء في اليوم التالي واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تصيب خلايا HeLa مع فيروس Vaccinia في تعدد العدوى من خمسة والحفاظ على خلايا HeLa غير المصابة للمقارنة. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 إلى 12 ساعة.بعد الساعات المطلوبة بعد العدوى، مزيج 480 نانوغرام من 12A تسلسل تحمل اليراعات Luciferase مرنا و 20 نانوغرام من تسلسل كوزاك تحمل رينيه لوسيفراز مرنا في أنبوب واحد microcentrifuge. في أنبوب آخر microcentrifuge، إضافة 1.1 ميكرولترات من مُكشف نقل الدهون الموجبة. إضافة 55 ميكرولترات من وسائل الإعلام المصل خفضت إلى كل من الأنابيب، مزيج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.ثم إضافة 55 microliters مبيد الدهون الموجبة transfection التي تحتوي على وسائل الاعلام المصل مخفضة لممر RNA التي تحتوي على أنبوب. تخلط بلطف ولكن بدقة مع ماصة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أثناء الحضانة، وإزالة متوسطة ثقافة الخلية من الخلايا وإضافة 400 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة في البئر.عند الانتهاء من الحضانة، إضافة 100 ميكرولترات من الخليط قطرة الحكمة وبصفة في بئر من 24 لوحة جيدا. خمس ساعات بعد المشاركة مع 12A فلوك وكوزاك Rluc مرنا، وإزالة متوسطة المصل خفضت من الخلايا وlyse الخلايا عن طريق إضافة 150 ميكرولترس 1X تحلل العازلة من مجموعة المقايسة لوسيفرايز قادرة على أداء اثنين من المقايسات مراسل. بعد احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، كشط الخلايا باستخدام حقنة مطاطية ومعقمة ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge.إلى بيليه خلية الحطام، الطرد المركزي في 12، 000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. نقل 30 ميكرولترات من السوبر في بئر من لوحة مُعَرَضِة مُبَرَّحة 96 مُعَلَّمَة بيضاءً أيضاً مع قاع صلب. استخدم مجموعة أدوات فحص Luciferase ومقياس إضاءة قارئ لوحة متعدد المستويات لقياس الإنارة المزدوجة باستخدام وظيفة الحركية كما هو موضح في المخطوطة.بعد تصدير بيانات قراءة الإنارة إلى تنسيق ملف مرغوب فيه، تحديد معدل الترجمة النسبية من 12A Fluc مرنا في خلايا HeLA المصابة بفيروس VACV عن طريق تقسيم قيمة Fluc على قيمة Rluc التحكم الداخلي. وقد استخدم هذا الفحص لاختبار كفاءة الترجمة من مرنا فلوك الذي يحتوي على 5'بولي (A) لتر في الخلايا المصابة غير المصابة وVACV. وقد نجحت الخلايا غير المصابة والخلايا المصابة بفيروس VACV في الإصابة بـ Fluc وRluc mRNA.تقسيم فلوك من قبل Rluc تطبيع كفاءة transfection في استقرار الحمض النووي الريبي في الخلايا. 5'بولي (A) لتر يحتوي على مرنا لديه ميزة الترجمة أثناء عدوى VACV مقارنة بالخلايا غير المصابة. ولم يكن ذلك بسبب اختلاف كفاءة النقل أو استقرار الحمض النووي الريبي لأن مستوى الحمض النووي الريبي النووي كان مماثلاً في الخلايا غير المصابة وVACV المصابة خمس ساعات بعد عدوى مرنا.اتخاذ عناية خاصة عند تصميم التمهيديات لأن هذا يمكن أن تؤثر ليس فقط على كفاءة تفاعل PCR ولكن أيضا جميع العمليات المصب التي تتطلب الحمض النووي تضخيمها. هذه الطريقة هي اختبار مهم لاختبار تنظيم الترجمة بسرعة من قبل عناصر Cis. وينبغي، إن أمكن، أن تُدعم هذه الطريقة بتجارب تكميلية أخرى.وينبغي اتخاذ الاحتياطات أثناء استخدام فيروس فاتشينيا وتجنب التعرض للمواد الكيميائية مثل بروميد الإثيديوم والفينول.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Seven Steps to Stellate Cells

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

و<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك عدوى نموذج لدراسة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

رواية في المختبر الجرح المقايسة الشفاء لتقييم الهجرة الخلية

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...