Name: in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00
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이 프로젝트는 지 부 및 존슨 암 연구 센터 (http://cancer.k-state.edu)에 의해 부분적으로 PD에 대학원 학생 여름 급여의 형태로 건강의 국립 연구소 (AI128406 www.nih.gov)에 의해 투자 되었다.

1. 시험관 내 전사 를 위한 PCR에의 한 DNA 템플릿 제조
<ol><li>PCR에 의해 DNA 템플릿을 제조 하기 위해, 프라이 머를 설계 하였다. 프라이 머를 설계 할 때 뇌관 길이, 어 닐 링 온도 (Tm), GC 내용, G 또는 C 등으로 3 끝과 같은 중요 한 특성을 고려 참고: 이들 문헌25,26,27에서 상세히 논의 한다.</li>
	<...

<ol>
	<li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+protein+synthesis.">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li><li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Dogma+of+Molecular+Biology.">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes:+Mechanisms+and+Biological+Targets.">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress.">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li><li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).</li><li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes.">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li><li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+Translation:+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells.">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).</li><li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+against+the+Tide:+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff.">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li><li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5&#8217;+noncoding+region.">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5&#8217; noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li><li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA.">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li><li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3&#8242;+or+the+5&#8242;+untranslated+region.">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3&#8242; or the 5&#8242; untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li><li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3&#8242;+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses.">3&#8242; Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li><li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+poly(A)+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES.">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li><li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response.">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li><li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+poly(A)+leaders+of+variable+lengths+at+the+5&#8217;+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs.">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5&#8217; ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li><li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5&#8217;+poly(A)+leader+on+its+early+transcript.">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5&#8217; poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li><li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5&#8242;+poly(A)+leader.">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5&#8242; poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li><li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+initiation+and+3&#8242;+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs.">Pervasive initiation and 3&#8242; end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li><li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5&#8217;-poly(A)+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation.">The 5&#8217;-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase.">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li><li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff.">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li><li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors.">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23 (2005).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing.">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+the+5&#8242;+and+3&#8242;+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts.">Genome-Wide Analysis of the 5&#8242; and 3&#8242; Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li><li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).</li><li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter.">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li><li>Thornton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+by+Overlap+Extension+PCR+to+Obtain+Hybrid+DNA+Products.">Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products.</a> The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).</li><li>Akichika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific+terminal+N6-methylation+of+RNA+by+an+RNA+polymerase+II&#8211;associated+methyltransferase.">Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II&#8211;associated methyltransferase.</a> Science. , (2018).</li><li>Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific,+terminal+N6-methylation+by+a+mammalian+m6Am+methyltransferase.">Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase.</a> Cell Research. 1, (2018).</li><li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome.">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862 (2018).</li><li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation.">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+m6A,+m6Am,+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm.">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li></ol>

모든 4-코어 단계는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 성공에 매우 중요 합니다. 특히 T7 프로모터 서 열에 대 한 프라이 머 디자인에 특별 한 주의가 주어져야 한다. T7 RNA 중 합 효소는 T7 프로모터의 밑줄이 그어진 첫 번째 G (gGG-5'-UTR) 로부터 전사를 시작 하 여 5 ' UTR 서 열 전에 첨가 하였다. 전사 개시 사이트 (TSS)는 5 ' 말단에서 제 1 G 로부터 시작 하지만, T7 프로모터 영?...

중앙 교리에 따르면, 유전 정보는 DNA에서 RNA로 그리고 마침내 단백질1,2로 흐릅니다. 유전 정보의이 흐름은 mRNA 번역3을포함 하 여 많은 수준에서 높게 통제 됩니다,4. 유전자 발현 조절을 측정 하기 위한 리포터 분석의 개발은이 과정에 관여 하는 규제 메커니즘의 이해를 용이 하 게 한다. 여기서 우리는 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법을 사용 하 여 mRNA 번역을 연구 하는 프로토콜을 설명 한다.
폭스 바이러스는 많은 매우 위험한 인간과 동물 병원 균을 포함 한다5. 다른 모든 바이러스 처럼, 폭스 바이러스 독점적으로 단백질 합성에 대 한 호스트 세포 기계에 의존6,7,8. 바이러스 성 단백질을 효율적으로 합성 하기 위해 바이러스는 세포 중개 기계를 납치 하 여 바이러스 mrnas7,8의 번역을 위해이를 리디렉션하는 많은 전략을 진화 시켰습니다. 바이러스에 의해 일반적으로 채택 되는 기계 장치는 그들의 전사체에 있는 cis행동 요소를 사용 하는 것입니다. 주목할 만한 예로는 내부 리보솜 진입 부위 (에 어) 및 캡 독립적인 번역 증강 인자 (인용),11등이 있다. 이러한 cis요소는 다양 한 기 작12,13,14를 통해 중개 기계를 유치 함으로써 번역 적 우위를 바이러스 전사체를 렌더링 한다. 100 폭스 바이러스 mrnas는 5 ' 미 번역 지역 (UTR)에서 진화 하 여 보존 된 시스-작동 소자를가지고 있으며,이러한 mrnas15의 5 ' 말단에서 5 ' 폴 리 (a) 리더입니다. 이러한 5 '-폴 리 (A) 지도자의 길이는 이종 이며 전사 동안 폭스 바이러스 부호화 RNA 중 합 효소17,18의 미 끄 러 짐에 의해 생성 된다. 우리와 다른 사람들은 최근 5 '-폴 리 (A) 지도자가 백 시 니 아 바이러스 (vacv)에 감염 된 세포에서 mRNA에 번역 이점을 부여 한다는 것을 발견 하였으며,이는 폭스 바이러스19,20의 프로토 타입 부재 이다.
시험관 내 전사 된 RNA 계 루시퍼 라 제 리포터 분석은 처음에 폭스 바이러스 감염19,21동안 mRNA 번역에서 5 '-폴 리 (A) 지도자의 역할을 이해 하기 위하여 개발 되었다. 플라스 미드 DNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법이 널리 사용 되 고 있지만, 폭스 바이러스 감염 세포에서의 결과 해석을 복잡 하 게 하는 몇 가지 단점이 있다. 먼저, 플라스 미드는 VACV 감염 세포 (22)에서 복제할 수 있다. 둘째, 암호화 된 전사는 플라스 미드 DNA18,23,24에서 종종 발생 한다. 셋째, VACV 프로모터 구동 전사는 불균일 한 길이의 폴 리 (A) 리더를 생성 하 여 일부 실험18에서 폴 리 (a) 지시선 길이를 제어 하기 어렵게 한다. 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 이러한 문제를 회피 하 고 데이터 해석은 간단 합니다.
이 방법에는 4 가지 주요 단계가 있습니다. (1) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성 하는 단계; (2) 시험관 내 전사 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 세포에 mRNA를 전달 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출 (그림 1) 얻어진 PCR 증폭은 5 ' ~ 3 ' 방향으로 다음과 같은 요소를 포함 합니다: T7, 폴 리 (a) 리더 또는 원하는 5 ' UTR 서 열, 반딧불 루시퍼 라 제 오픈 리딩 프레임 (ORF) 뒤에 폴 리 (a) 꼬리. PCR 증폭은 T7 중 합 효소를 사용 하 여 시험관 내 전사에 의해 mRNA를 합성 하는 템플릿으로 사용 된다. 시험관 내 전사 동안, m7G 캡 또는 다른 캡 아날로그는 새로 합성 된 mRNA에 혼 입 된다. 캡 핑 된 전사체는 감염 되지 않은 또는 VACV 감염 된 세포로 형질 전환 된다. 세포 파쇄 액은 형질 감염 후 원하는 시간에 수집 되어 mRNA 로부터 단백질 생산을 나타내는 루시퍼 라 제 활동을 측정 한다. 이 리포터 분석 법은 mRNA의 5 '-UTR, 3 '-UTR 또는 그밖 지구에 있는 cis원소 존재에 의해 번역 규칙을 공부 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 더욱이, 시험관 내 전사 된 RNA-기반 어 세이는 캡 의존적 개시, 캡 독립적 개시, 재 개시 및 아 스와 같은 내부 개시를 포함 하는 번역 개시의 상이한 메커니즘을 연구 하는데 사용 될 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492</td>
			<td>High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td>Anti reverse Cap analog or ARCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3693</td>
			<td>Opaque walled 96 well white plate with solid bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td>
			<td>OMEGA BIO-TEK</td>
			<td>D6492</td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM2010</td>
			<td>Referred as multimode plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td>In-Vitro transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Used to measure DNA and RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td>RNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080</td>
			<td>Capping system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells

바이러스 DNA 복제 후에 전사 된 모든 폭스 바이러스 mRNA는 5 '-UTR의 진화 적으로 보존 된 비 템플릿 기반 5 ' 폴 리 (A) 선두 주자입니다. 폭스 바이러스 감염 시 mRNA 번역에서 5 '-폴 리 (A) 지도자의 역할을 해 하는 우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 검정을 개발 했습니다. 이 리포터 검정은 4 개의 핵심 단계를 포함 한다: (1) 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 증폭 하는 PCR; (2) 시험관 내 전사 T7 RNA 중 합 효소를 사용 하 여 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 시험관 내에서 세포 내로 전사 된 mRNA를 도입 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출. 여기에 설명 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 플라스 미드 로부터 폭스 바이러스에 감염 된 세포 및 비밀 전사의 플라스 미드 복제의 문제를 회피 한다. 이 프로토콜은 폭스 바이러스에 감염 된 세포가 아닌 시스템에서 5 '-UTR 및 3 '-UTR를 포함 한 mRNA의 cis원소에의 한 번역 조절을 결정 하는데 사용 될 수 있다. 또한이 방법을 사용 하 여 cap 종속, cap 독립적, 다시 시작 및 내부 시작과 같은 다양 한 번역 시작 모드를 조사할 수 있습니다.

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 4 단계: 시험관 내 기록 체에 대 한 DNA 템플릿 생성 PCR, mRNA 트랜스 펙 션 및 루시퍼 라 제 측정을 생성 하는 생체 외 전사, 개략도에서 볼 수 있다 ( 그림 1). DNA 템플릿 (Fluc 및 Rluc) 모두를 위한 프라이 머의 설계 및 오버행 확장 PCR의 일반적인 계획은 도식 적으로 예시 된다 (도 2a</st...

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In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석을 사용 하 여 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 mRNA 번역 조절을 연구 하기 위한 프로토콜을 제시 합니다. 분석 법은 5 '-미 번역 지역 (UTR) 및 3 '-UTR를 포함 하 여 mRNA의 cis요소에 의해 번역 조절을 연구 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여 다른 변환 시작 모드를 검사할 수도 있습니다.

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

시험관 내 전사 RNA 기반 루시파라제 분석법에 대한 당사의 프로토콜은 두우스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구하는 데 도움이 됩니다. 또한 Poly(A) 리터의 사용자 지정 길이를 사용하면 번역에 대한 규제 효과를 연구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 mRNA의 5'UTR 및 3'UTR 및 광범위한 번역 개시와 같은 Cis 요소에 의한 번역 조절연구를 허용한다는 것입니다.시험관 내 전사 RNA 기반 루시파라제 기자 분석은 캡 및 기타 수정에 대한 수정을 통합하도록 조정되어 번역에 미치는 영향을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 시작하려면 앞으로 의 선상 및 역방향 프라이머를 설계하여 5'to 3'direction:T7-Promoter에서 다음 요소를 포함하는 PCR 앰플리션을 생성합니다. 폴리(A)리터, T7_12A-Fluc라고 불리는 폴리(A) 꼬리의 반딧불 루시파제 ORF는 앞으로 프라이머에 몇 가지 추가 뉴클레오티드를 포함하고 있으며, 그 다음으로 T7-Promoter Poly(A) 리터 또는 원하는 5'UTR 서열 및 약 20개의 뉴클레오티드가 리포터 유전자의 ORF의 5엔드에 대응하는 것을 포함한다. 리포터 유전자의 ORF의 5엔드에 해당하는 용융 온도에 기초하여 프라이머 길이를 조정하여 프라이머내의 해당 영역이 유전자의 감각 가닥과 동일하도록 한다.그런 다음 폴리(A)꼬리와 약 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 역프라이머를 설계한다. 리포터 유전자의 ORF의 3엔드에 해당하는 용융 온도에 기초하여 조정하여 프라이머의 해당 영역이 유전자의 안티센스 가닥과 동일하고 프레임 내 스톱 코돈이 폴리(A) 꼬리 앞에 존재하도록 한다. 내부 제어를 위해 5'to 3'direction:T7-Promoter, 코작 시퀀스를 포함하는 무작위 5'UTR 코딩 시퀀스, 레닐라 루시파아제 ORF 및 폴리(A)꼬리의 다음 요소를 포함하는 다른 프라이머 세트를 설계하여 T7_Kozak-Rluc라고 합니다.반응을 설정하려면, PCR 튜브에 다음 순서로 시약을 추가: DNase 무료 물, 2배 높은 충실도 DNA 폴리머라제, 프라이머 및 서열 확인 루시포어 템플릿 DNA. 표준 3단계 PCR 주기후 DNA 템플릿을 생성한 후, 분자량 표준과 함께 1%아가로산 TAE 겔 전기포광에서 PCR 반응의 5-10%를 실행하여 PCR 제품을 검출한다. PCR 제품의 크기를 확인하려면 UV 조명기 아래에서 젤을 시각화합니다.PCR 제품의 정확한 크기를 결정한 후, DNA를 용해시키기 위해 100 마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터를 사용하여 시판되는 PCR 정화 키트를 사용하여 정제한다. 분광광계를 사용하여 정제 된 DNA의 농도를 확인하고 즉시 체외 전사에 사용하기 위해 영하 20도에서 저장하십시오. PCR 제품으로부터 RNA를 합성하기 위해, 마이크로센심분리기 튜브에 다음과 같은 시약을 추가하십시오: DNase-RNase 무료 물, NTP 버퍼 믹스, 캡 아날로그, PCR 제품 템플릿 및 시험관 내 전사 키트의 T7-RNA 폴리머라제 믹스.완전히 섞으세요. 2시간 동안 섭씨 37도에서 배양한 다음 RNA 정화 키트를 사용하여 합성된 RNA의 정제를 진행한다. 정제된 RNA를 확인하려면 RNA를 5분 동안 70도에서 가열하여 이차 구조를 제거하고 1.5 아가로즈 TBE 젤로 실행합니다.그런 다음 UV 조명기 아래에서 젤을 시각화합니다. 분광광계를 사용하여 정제 된 RNA의 농도를 확인하십시오. 알리쿼트하고 영하 80도에 보관하십시오.24개의 웰 플레이트에 있는 종자 HeLa 세포는 다음 날 80-90%의 합류를 달성하고 이산화탄소 5%의 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 하룻밤을 배양합니다. 5의 감염의 복합성에 Vaccinia 바이러스로 HeLa 세포를 감염하고 비교를 위해 감염되지 않은 HeLa 세포를 유지합니다. 그런 다음 10~12시간 동안 이산화탄소 5%를 37도에서 배양합니다.원하는 시간 후 감염 후, 혼합 480 12A 서열 베어링 반딧불 루시파제 mRNA와 코자크 서열 베어링 코자크 서열의 20 나노그램 한 마이크로 센트심분리기 튜브에. 또 다른 미세 원심 분리관에서 양이온 지질 경질 시약의 1.1 마이크로 리터를 추가하십시오. 55 마이크로리터의 감소된 혈청 매체를 두 튜브에 넣고 실온에서 5분간 배양합니다.그런 다음 튜브를 포함하는 mRNA에 감소된 혈청 매체를 포함하는 55개의 마이크로리터 양이온 지질 경질 시약을 추가합니다. 피펫과 부드럽게 섞고 실온에서 15분간 배양합니다. 인큐베이션 하는 동안, 세포 배양 배지를 세포로부터 제거하고 잘 당 감소된 혈청 배지의 400 마이크로리터를 추가한다.인큐베이션이 완료되면, 혼합물의 100 마이크로리터를 넣고 24웰 플레이트의 웰당 현명하고 균등하게 떨어뜨립니다. 12A Fluc 및 Kozak Rluc mRNA와 5시간 후 의 결합 후, 세포로부터 감소된 혈청 배지를 제거하고 2개의 리포터 분석제를 수행할 수 있는 루시파아제 분석 키트로부터 150마이크로리터 1X 리시스 버퍼를 추가하여 세포를 용해시킨다. 실온에서 10분 동안 배양한 후 고무와 멸균 주사기를 사용하여 세포를 긁어 내고 미세 원심분리기 튜브로 옮김합니다.세포 파편을 펠릿하기 위해, 12, 000 배 g에서 4섭씨에서 10 분 동안 lysate을 원심분리합니다. 불투명한 벽으로 둘러싸인 96의 웰당 30 마이크로리터를 단단한 바닥으로 옮기는 흰색 분석 플레이트. 루시파라제 분석 키트와 다중 모드 플레이트 판독기 조명계를 사용하여 원고에 설명된 바와 같이 운동 기능을 사용하여 이중 발광을 측정합니다.발광 판독 데이터를 바람직한 파일 형식으로 내보낸 후, 플루크 값을 내부 제어 Rluc 값으로 나누어 감염되지 않은 및 VACV 감염 된 HeLA 세포에서 12A Fluc mRNA에서 상대 적 번역 속도를 결정합니다. 이 분석은 감염되지 않은 및 VACV 감염 된 세포에 5'Poly (A) 리터를 포함하는 Fluc mRNA의 번역 효율을 테스트하는 데 사용되었다. 감염되지 않은 및 VACV 감염된 세포는 모두 성공적으로 Fluc 및 Rluc mRNA와 공동 으로 감염되었습니다.Rluc에 의해 Fluc를 분할하면 세포의 RNA 안정성에서 형질 전환 효율을 정규화했습니다. mRNA를 함유하는 5'Poly(A) 리터는 감염되지 않은 세포에 비해 VACV 감염 시 번역이 이점이 있다. 이는 RNA 수준이 감염되지 않은 및 VACV 감염 세포에서 5시간 후 mRNA 경질 후 유사했기 때문에 차분성 경피 효율 또는 mRNA 안정성 때문이 아니었다.이는 PCR 반응 효율뿐만 아니라 증폭된 DNA를 요구하는 모든 다운스트림 프로세스에도 영향을 줄 수 있기 때문에 프라이머를 설계할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 이 방법은 Cis 요소에 의한 번역 규정을 신속하게 테스트하는 중요한 분석입니다. 가능하면 이 메서드는 다른 보완 실험에 의해 확증되어야 합니다.예방 조치는 바치니아 바이러스를 사용하는 동안 취해야하며 에디듐 브로마이드및 페놀과 같은 화학 물질에 노출되지 않아야합니다.

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Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

연구

면역학 및 감염병학

Seven Steps to Stellate Cells

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

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포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

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<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...