Name: in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

Projektet finansierades av National Institute of Health (AI128406 www.nih.gov) till ZY och delvis av Johnson cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) i form av Graduate student Summer stipendium till PD.

1. beredning av DNA mall genom PCR för in vitro- transkription
<ol><li>För att förbereda DNA-mallen genom PCR, design primers. När designa primers överväga avgörande egenskaper som primer längd, glödgning temperatur (Tm), GC innehåll, 3 ' End med G eller C etc. Anmärkning: Diskuteras i detalj i dessa litteratur25,26,27.</li>
	<li>Design grund färger för att generera ...

<ol>
	<li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+protein+synthesis.">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li><li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Dogma+of+Molecular+Biology.">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes:+Mechanisms+and+Biological+Targets.">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress.">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li><li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).</li><li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes.">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li><li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+Translation:+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells.">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).</li><li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+against+the+Tide:+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff.">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li><li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5&#8217;+noncoding+region.">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5&#8217; noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li><li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA.">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li><li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3&#8242;+or+the+5&#8242;+untranslated+region.">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3&#8242; or the 5&#8242; untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li><li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3&#8242;+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses.">3&#8242; Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li><li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+poly(A)+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES.">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li><li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response.">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li><li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+poly(A)+leaders+of+variable+lengths+at+the+5&#8217;+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs.">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5&#8217; ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li><li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5&#8217;+poly(A)+leader+on+its+early+transcript.">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5&#8217; poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li><li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5&#8242;+poly(A)+leader.">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5&#8242; poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li><li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+initiation+and+3&#8242;+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs.">Pervasive initiation and 3&#8242; end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li><li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5&#8217;-poly(A)+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation.">The 5&#8217;-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase.">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li><li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff.">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li><li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors.">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23 (2005).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing.">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+the+5&#8242;+and+3&#8242;+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts.">Genome-Wide Analysis of the 5&#8242; and 3&#8242; Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li><li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).</li><li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter.">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li><li>Thornton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+by+Overlap+Extension+PCR+to+Obtain+Hybrid+DNA+Products.">Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products.</a> The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).</li><li>Akichika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific+terminal+N6-methylation+of+RNA+by+an+RNA+polymerase+II&#8211;associated+methyltransferase.">Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II&#8211;associated methyltransferase.</a> Science. , (2018).</li><li>Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific,+terminal+N6-methylation+by+a+mammalian+m6Am+methyltransferase.">Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase.</a> Cell Research. 1, (2018).</li><li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome.">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862 (2018).</li><li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation.">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+m6A,+m6Am,+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm.">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li></ol>

Alla fyra-core steg är avgörande för framgången för in vitro-transkriberade RNA-baserade luciferas reporter analysen. Särskild uppmärksamhet bör ägnas primer design, särskilt för T7 promotor sekvens. T7 RNA-polymeras påbörjar transkription från den understrukna första G (ggg-5 '-utr-aug-) i T7 Promotorn som lagts till före 5 '-utr-sekvensen. Även om transkription start site (TSS) startar från den första G vid 5 ' slutet, minskar antalet G: s mindre än tre i T7 promotor regionen minskade RNA avk...

Enligt den centrala dogm, genetisk information flödar från DNA till RNA och sedan slutligen till protein1,2. Detta flöde av genetisk information är mycket reglerad på många nivåer inklusive mRNA översättning3,4. Utveckling av rapportörs analyser för att mäta reglering av gen uttryck kommer att under lätta förståelsen av regleringsmekanismer som är involverade i denna process. Här beskriver vi ett protokoll för att studera mRNA översättning med hjälp av en in vitro transkriberat RNA-baserade luciferas reporter assay i poxvirus-infekterade celler.
Poxviruses omfattar många mycket farliga mänskliga och animaliska patogener5. Liksom alla andra virus, poxviruses förlitar sig uteslutande på värd cell maskiner för protein syntes6,7,8. För att effektivt syntetisera virala proteiner, utvecklade virus många strategier för att kapa cellulära translationella maskiner för att omdirigera den för översättning av viral mrnas7,8. En vanlig anställd mekanism av virus är att använda CIS-verkande element i sina utskrifter. Anmärknings värda exempel är den inre ribosome ingångs plats (IRES) och Cap-oberoende översättning förstärkare (Cite)9,10,11. Dessa CIS-element gör virus avskrifter till en translationell fördel genom att attrahera translationella maskiner via olika mekanismer12,13,14. Över 100 poxvirus mrnas har en evolutionärt bevarade CIS-verkande elementet i 5 '-oöversatt region (5 '-utr): en 5 '-poly (a) ledare vid mycket 5 ' ändar av dessa mrnas15,16. Längderna av dessa 5 '-poly (a) ledare är heterogena och genereras av glidning av poxvirus-kodade RNA-polymeras under transkription17,18. Vi, och andra, upptäckte nyligen att 5 '-poly (a) ledaren ger en översättning fördel till en mRNA i celler infekterade med vaccinia virus (vacv), den prototypiska medlemmen av poxviruses19,20.
In vitro transkriberade RNA-baserade luciferas reporter analysen utvecklades ursprungligen för att förstå den roll som 5 '-poly (a) ledare i mRNA översättning under poxvirus infektion19,21. Även plasmid DNA-baserade luciferas reporter analyser har använts i stor utsträckning, det finns flera nack delar som kommer att komplicera resultatet tolkningen i poxvirus-infekterade celler. Först, plasmider kan replikera i VACV-infekterade celler22. För det andra sker kryptisk transkription ofta från plasmid DNA18,23,24. För det tredje, VACV promotor-driven transkription genererar poly (A)-ledare av heterogena längder vilket gör det svårt att kontrol lera poly (A)-ledare längd i vissa experiment18. En in vitro transkriberat RNA-baserade luciferas reporter assay kringgår dessa frågor och data tolkningen är okomplicerad.
Det finns fyra viktiga steg i denna metod: (1) polymeras kedje reaktion (PCR) för att generera DNA-mall för in vitro-transkription; 2. in vitro-transkription för att generera mRNA. (3) transfektion för att leverera mRNA till celler; och (4) detektion av luciferasaktivitet som indikator för översättning (figur 1). Den resulterande PCR-Amplikonen innehåller följande element i 5 ' till 3 ' riktning: T7-Promotorn, poly (a) ledare eller önskad 5 '-utr sekvens, Firefly luciferas öppen läsram (ORF) följt av en poly (a) svans. PCR-amplikon används som mall för att syntetisera mRNA genom in vitro-transkription med T7-polymeras. Under in vitro-transkription, m7G Cap eller andra Cap analog ingår i nyligen syntetiserade mRNA. De utjämnade avskrifter är transfekterade till oinfekterade eller vacv-infekterade celler. Cellen lysate samlas på önskad tid efter transfektion att mäta luciferas aktiviteter som indikerar protein produktion från transfekterade mRNA. Denna reporter analys kan användas för att studera översättning förordning av CIS-element som finns i 5 '-utr, 3 '-utr eller andra regioner i en mRNA. Vidare, in vitro transkriberas RNA-baserade analysen kan användas för att studera olika mekanismer för översättning initiering inklusive Cap-beroende initiering, Cap-oberoende initiering, återinsättande och inre initiering som IRES.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492</td>
			<td>High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td>Anti reverse Cap analog or ARCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3693</td>
			<td>Opaque walled 96 well white plate with solid bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td>
			<td>OMEGA BIO-TEK</td>
			<td>D6492</td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM2010</td>
			<td>Referred as multimode plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td>In-Vitro transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Used to measure DNA and RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td>RNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080</td>
			<td>Capping system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells

Varje poxvirus mRNA transkriberas efter viral DNA-replikering har en evolutionärt bevaras, icke-templated 5 '-poly (A) ledare i 5 '-UTR. Att dissekera den roll som 5 '-poly (a) ledare i mRNA översättning under poxvirus infektion vi utvecklat en in vitro transkriberat RNA-baserade luciferas reporter assay. Denna reporter analys består av fyra centrala steg: (1) PCR att förstärka DNA-mall för in vitro-transkription; (2) in vitro-transkription för att generera mRNA med T7 RNA-polymeras; (3) transfektion för att introducera in vitro-transkriberad mRNA i celler; (4) detektion av luciferasaktivitet som indikator för översättningen. Den RNA-baserade luciferas reporter analysen beskrivs här kringgår frågor av Plasmid replikering i poxvirus-infekterade celler och kryptisk transkription från plasmid. Detta protokoll kan användas för att fastställa översättning reglering av CIS-element i en mRNA inklusive 5 '-utr och 3 '-utr i andra system än poxvirus-infekterade celler. Dessutom, olika former av översättning initiering som Cap-beroende, Cap-oberoende, återinsättande, och inre initiering kan undersökas med hjälp av denna metod.

De fyra stegen i in vitro transkriberade RNA-baserade luciferas reporter assay: PCR för att generera DNA mall för in vitro-transkription, in vitro-transkription för att generera mRNA, mRNA transfektion, och luciferas mätning, kan ses i Schematisk diagram ( Figur 1). Utformningen av primers för både DNA-mallar (Fluc och Rluc) och det allmänna systemet för överhäng förlängning PCR illustreras i den schematiska (figur 2A...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Vi presenterar ett protokoll för att studera mRNA översättning förordning i poxvirus-infekterade celler använder in vitro-transkriberas RNA-baserade luciferas reporter assay. Analysen kan användas för att studera översättning förordning av CIS-element i en mRNA, inklusive 5 '-oöversatt region (utr) och 3 '-utr. Olika lägen för översättnings initiering kan också undersökas med den här metoden.

In vitro transkriberas RNA-baserade Luciferase reporter assay att studera översättning förordning i Poxvirus-infekterade celler

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Vårt protokoll för en in vitro transkriberas RNA-baserade luciferas analys hjälper studera översättning reglering i pox virus infekterade celler. Dessutom tillåter en anpassad längd av Poly(A)liter studera dess reglerande effekter på översättning. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör studiet av översättningsreglering av Cis-element som 5'UTR och 3'UTR i mRNA och brett spektrum av översättningsinitiering.In vitro transkriberas RNA-baserade luciferase reporter assay kan vara anpassade för att införliva ändring av mössa och annan ändring och används för att testa effekten på översättning. Till att börja, designa framåt och omvänd primers för att generera PCR amplicon som innehåller följande element i 5'till 3'riktning:T7-Promoter, Poly(A)liter, Firefly Luciferase ORF i en Poly(A)svans som kallas T7_12A-Fluc, inkludera flera extra nukleotider i framåt primer följt av T7-Promoter Poly(A)liter eller önskad 5'UTR sekvens och cirka 20 nukleotider som motsvarar 5:ans 5:ans reportergenens ORF. Justera primerlängden baserat på smälttemperatur som motsvarar 5'end av reportergenens ORF som säkerställer att motsvarande region i primern är identisk med genens avkänningssträng.Designa sedan omvänd primer så att poly(A)svans och cirka 20 nukleotider ingår. Justera baserat på smälttemperatur som motsvarar 3'end av reportergenens ORF som säkerställer att motsvarande region av primern är identisk med antisense-strängen av genen och en in-frame stop-kodon är närvarande före Poly(A)svansen. För intern kontroll, designa en annan uppsättning primers som innehåller följande element i 5'till 3'direction:T7-Promoter, en slumpmässig 5'UTR-kodningssekvens som innehåller Kozak-sekvens, Renilla Luciferase ORF, och Poly(A)svans, kallad T7_Kozak-Rluc.För att ställa in reaktionen, tillsätt reagenser i följande ordning till ett PCR-rör:DNase fritt vatten, 2X high-fidelity DNA-polymeras, primers och sekvens bekräftade luciferas mall DNA. Efter en vanlig trestegs PCR-cykel för att generera en DNA-mall, detektera PCR-produkten genom att köra 5-10%av PCR-reaktionen i en 1%agarose TAE gel-elektrofores tillsammans med en molekylviktsstandard. För att bestämma storleken på PCR-produkten, visualisera gelen under en UV-belysning.Efter att ha fastställt den korrekta storleken på PCR-produkten, rena den med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt PCR-reningskit med 100 mikroliter av nukleasfritt vatten för att elera DNA: t. Kontrollera koncentrationen av det renade DNA:t med hjälp av en spektrofotometer och förvara den på minus 20 grader Celsius för användning för in vitro-transkription omedelbart. Om du vill syntetisera RNA från PCR-produkten, tillsätt följande reagenser till ett mikrocentrifugrör:DNase-RNase fritt vatten, NTP-buffertmix, cap analog, PCR-produktmall och T7-RNA-polymerasblandning från in vitro-transkriptionskit.Blanda ordentligt. Inkubera i 37 grader Celsius i två timmar och fortsätt sedan till rening av det syntetiserade RNA med hjälp av en RNA-reningssats. För att kontrollera det renade RNA, värme RNA vid 70 grader i fem minuter för att ta bort sekundär struktur och köra den på 1,5 agaros TBE gel.Visualisera sedan gelen under en UV-illuminator. Kontrollera koncentrationen av det renade RNA med hjälp av en spektrofotometer. Aliquot det och lagra på minus 80 grader Celsius.Frö HeLa celler i en 24 brunnsplatta för att uppnå 80-90%konfluency följande dag och inkubera över natten i en inkubator vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Infektera HeLa celler med Vaccinia virus vid en multiplicity av infektion av fem och hålla oinfekterade HeLa celler för jämförelse. Sedan inkubera plattan på 37 grader Celsius med 5%koldioxid i 10 till 12 timmar.Efter önskad timmar efter infektion, blanda 480 nanogram av 12A sekvens med Firefly Luciferase mRNA och 20 nanogram av Kozak sekvens bärande Renilla Luciferase mRNA i en mikrocentrifugrör. I ett annat mikrocentrifugrör, tillsätt 1,1 mikroliter av katjonidtransfection-reagens. Tillsätt 55 mikroliter av reducerat serum media till båda rören, blanda och inkubera i rumstemperatur i fem minuter.Tillsätt sedan 55 mikroliters katjonitlipid transfection reagens som innehåller reducerade serum media till mRNA innehållande rör. Blanda försiktigt men noggrant med en pipett och inkubera i rumstemperatur i 15 minuter. Under inkubationen, ta bort cellodlingsmediet från cellerna och tillsätt 400 mikroliter av reducerat serummedium per brunn.När inkubationen är avslutad, tillsätt 100 mikroliter av blandningen droppe klokt och jämnt per brunn av 24 väl plattan. Fem timmar efter co-transfection med 12A Fluc och Kozak Rluc mRNA, ta bort den reducerade serum mediet från cellerna och lyse cellerna genom att lägga till 150 microliters 1X lysis buffert från Luciferase assay kit kan utföra två reporter analyser. Efter inkubation i 10 minuter i rumstemperatur, skrapa cellerna med hjälp av gummi och steril spruta och överför till ett mikrocentrifugrör.Till pelletcellskräp, centrifug lysate vid 12, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Överför 30 mikroliter av supernatant per brunn av en ogenomskinlig muromgärdad 96 väl vit analysplatta med en solid botten. Använd Luciferase assay kit och en flerlägesplåtsläsare luminometer för att mäta den dubbla luminecisen med hjälp av kinetikfunktionen enligt beskrivningen i manuskriptet.Efter att ha exporterat luminisprocessen läsa data till ett önskvärt filformat, bestämma relativ översättningshastighet från 12A Fluc mRNA i oinfekterade och VACV infekterade HeLA celler genom att dividera Fluc värde med intern kontroll Rluc värde. Denna analys användes för att testa översättningseffektiviteten hos ett Fluc mRNA som innehåller en 5'Poly(A)liter i icke-infekterade och VACV-infekterade celler. Både oinfekterade och VACV infekterade celler var framgångsrikt co-transfected med Fluc och Rluc mRNA.Dividera Fluc med Rluc normaliserade transfektionseffektiviteten i RNA-stabilitet i celler. 5'Poly(A)liter som innehåller mRNA har en translationell fördel under VACV infektion jämfört med icke infekterade celler. Detta berodde inte på differentiell transfection effektivitet eller mRNA stabilitet som RNA nivån var liknande i uninfected och VACV infekterade celler fem timmar post mRNA transfection.Var särskilt försiktig när du utformar primers eftersom detta kan påverka inte bara PCR reaktionseffektivitet utan också alla nedströms processer som kräver det förstärkta DNA. Denna metod är en viktig analys för att snabbt testa översättningsförordningen av Cis-element. Om möjligt bör denna metod bekräftas av andra kompletterande experiment.Försiktighetsåtgärder bör vidtas medan man använder Vacciniavirus och undvika exponering för kemikalier som ethidiumbromid och fenol.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Använda luciferas till bild bakteriella infektioner hos möss

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro-analys av bakteriell vidhäftning på däggdjur epitelceller

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infektion modell för att studera<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions in Human primära monocyt-härledda Immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro och in vivo modell för att studera bakteriell vidhäftning till kärlväggen Under Flow Villkor

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fria System för massproduktion av murina naturliga mördarceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

En roman In Vitro Wound Healing analys för att utvärdera cellmigration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...