Name: in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

Proje, Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI128406 www.nih.gov) tarafından ZY 'ye ve kısmen Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) tarafından PD 'ye Lisansüstü öğrenci yaz maaşları şeklinde finanse edildi.

1. In vitro transkripsiyon için PCR tarafından DNA şablonunun hazırlanması
<ol><li>DNA şablonunu PCR tarafından hazırlamak için, tasarım astar. Astarları tasarlarken, astar uzunluğu, tavlama sıcaklığı (Tm), GC Içeriği, G veya C ile 3 ' End vb. gibi önemli özellikleri dikkate alın. Not: Bu literatürde ayrıntılı olarak25,26,27.</li>
	<li>5 '-3 ' yönünde a...

<ol>
	<li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+protein+synthesis.">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li><li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Dogma+of+Molecular+Biology.">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes:+Mechanisms+and+Biological+Targets.">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress.">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li><li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).</li><li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes.">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li><li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+Translation:+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells.">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).</li><li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+against+the+Tide:+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff.">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li><li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5&#8217;+noncoding+region.">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5&#8217; noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li><li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA.">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li><li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3&#8242;+or+the+5&#8242;+untranslated+region.">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3&#8242; or the 5&#8242; untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li><li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3&#8242;+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses.">3&#8242; Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li><li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+poly(A)+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES.">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li><li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response.">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li><li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+poly(A)+leaders+of+variable+lengths+at+the+5&#8217;+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs.">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5&#8217; ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li><li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5&#8217;+poly(A)+leader+on+its+early+transcript.">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5&#8217; poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li><li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5&#8242;+poly(A)+leader.">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5&#8242; poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li><li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+initiation+and+3&#8242;+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs.">Pervasive initiation and 3&#8242; end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li><li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5&#8217;-poly(A)+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation.">The 5&#8217;-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase.">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li><li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff.">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li><li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors.">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23 (2005).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing.">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+the+5&#8242;+and+3&#8242;+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts.">Genome-Wide Analysis of the 5&#8242; and 3&#8242; Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li><li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).</li><li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter.">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li><li>Thornton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+by+Overlap+Extension+PCR+to+Obtain+Hybrid+DNA+Products.">Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products.</a> The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).</li><li>Akichika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific+terminal+N6-methylation+of+RNA+by+an+RNA+polymerase+II&#8211;associated+methyltransferase.">Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II&#8211;associated methyltransferase.</a> Science. , (2018).</li><li>Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific,+terminal+N6-methylation+by+a+mammalian+m6Am+methyltransferase.">Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase.</a> Cell Research. 1, (2018).</li><li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome.">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862 (2018).</li><li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation.">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+m6A,+m6Am,+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm.">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li></ol>

Tüm dört çekirdekli adımlar in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil başarısı için önemlidir. Özellikle T7 Organizatör dizisi için primer tasarıma özel dikkat verilmelidir. T7 RNA polimeraz, 5 '-UTR dizisinden önce eklenen T7 promotör 'de ilk altı çizili G (ggg-5'-UTR-Aug-) den transkripsiyon başlar. Transkripsiyon başlangıç sitesi (TSS) 5 ' ucunda ilk g 'den başlaysa da, T7 Organizatör bölgesinde 3 ' ten az olan g sayısının azaltılması RNA verim/çıkışını i...

Orta dogma 'ya göre, genetik bilgiler DNA 'dan RNA 'ya ve sonunda protein1,2' ye akar. Genetik bilgi bu akışı yüksek mRNA çeviri3,4dahil olmak üzere birçok düzeyde düzenlenir. Bu süreçte yer alan düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, Gen ifadesinin düzenlenmesini ölçmek için gazetecinin geliştirilmesi konusunda yardımcı olmaktadır. Burada poxvirus enfekte hücrelerde bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil kullanarak mRNA çeviri çalışması için bir protokol açıklanmaktadır.
Poxvirüsler birçok son derece tehlikeli insan ve hayvan patojenleri5oluşturur. Diğer tüm virüsler gibi, poxvirüsler sadece protein sentezi6,7,8için ana hücre makineleri güveniyor. Verimli viral proteinleri sentezlemek için, virüsler viral mrnas7,8çevirisi için yönlendirmek için hücresel translasyonel makine kaçırmak için birçok stratejiler gelişti. Virüsler tarafından yaygın olarak kullanılan bir mekanizma, kendi transkriptlerinde BDTetkili unsurları kullanmaktır. Önemli örnekler iç ribosome giriş sitesi (IRES) ve Cap-bağımsız çeviri artırıcı (CITE)9,10,11içerir. Bu BDTelemanları, çeşitli mekanizmalar aracılığıyla translasyonel makineleri alarak viral transkriptler bir translasyonel avantajı render12,13,14. 100 Over poksvirüs mrnas 'ın 5 '-untranslated bölgesi (5 '-UTR) içinde evrimsel olarak koruma altında olan bir eleman var: Bu mrnas15,16' nın çok 5 ' ucunda 5 '-Poly (a) lideri. Bu 5 ' Poly (A) liderlerin uzunlukları heterojen ve Transkripsiyon sırasında poxvirus kodlu RNA polimeraz kayma tarafından üretilir17,18. Biz, ve diğerleri, son zamanlarda keşfetti 5 '-Poly (A) lideri Vaccinia virüs ile enfekte hücrelerde bir mRNA bir çeviri avantajı confers (vacv), poxvirüsler Prototipik üyesi19,20.
İn vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz Reporter assay başlangıçta poksvirüs enfeksiyonu sırasında mRNA çeviri 5 '-Poly (A) lideri rolünü anlamak için geliştirilmiştir19,21. Plazmid DNA tabanlı Lusiferaz muhabiri olarak yaygın olarak kullanılan olsa da, poxvirus enfekte hücrelerde sonuç yorumu zorlaştıracak çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, plazmids VACV enfekte hücrelerde çoğaltmak edebiliyoruz22. İkinci olarak, kriptik transkripsiyon genellikle Plasmid DNA18,23,24oluşur. Üçüncü olarak, VACV Promoter güdümlü transkripsiyon Poly (A) oluşturur-heterojen uzunlukları lideri sonuç olarak Poly (A)-bazı deneyler18lider uzunluğu kontrol etmek zor hale. Bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil bu sorunları circumvents ve veri yorumu basittir.
Bu yöntemde dört önemli adım vardır: (1) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) in vitro transkripsiyon için DNA şablonunu oluşturmak için; (2) içinde vitro transkripsiyon mRNA oluşturmak için; (3) mRNA 'yı hücrelere teslim etmek için transfeksiyon; ve (4) tercüme göstergesi olarak Lusiferaz aktivitesinin tespiti (Şekil 1). Elde edilen PCR amplikon, 5 '-3 ' yönünde aşağıdaki unsurları içerir: T7-Promoter, Poly (a) lideri veya istenen 5 '-UTR dizisi, Firefly Lusiferaz açık okuma çerçevesi (ORF) ve ardından Poly (a) kuyruk. PCR amplikon, T7 polimeraz kullanarak mRNA 'yı in vitro transkripsiyon ile sentezlemek için şablon olarak kullanılır. İn vitro Transkripsiyon sırasında, m7G CAP veya diğer kapak analog yeni sentezlenmiş mRNA eklenmiştir. Capped transkriptler enfekte olmayan veya vacv enfekte hücrelere transfekte vardır. Hücre lysate transfeksiyon mRNA protein üretimini gösteren Lusiferaz faaliyetleri ölçmek için nakli sonra istenilen zamanda toplanır. Bu muhabir assay 5 '-UTR, 3 '-UTR veya bir mRNA diğer bölgelerinde BDTelemanı mevcut tarafından çeviri Yönetmeliği çalışmak için kullanılabilir. Ayrıca, in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı tahlil Cap-bağımlı başlatma, Cap-bağımsız başlatma, yeniden başlatma ve InAs gibi iç inisiyasyon dahil olmak üzere çeviri başlatma farklı mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492</td>
			<td>High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td>Anti reverse Cap analog or ARCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3693</td>
			<td>Opaque walled 96 well white plate with solid bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td>
			<td>OMEGA BIO-TEK</td>
			<td>D6492</td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM2010</td>
			<td>Referred as multimode plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td>In-Vitro transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Used to measure DNA and RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td>RNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080</td>
			<td>Capping system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells

Viral DNA replikasyonu sonrasında yapılan her poksvirüs mRNA, 5 '-UTR ' a evrimsel olarak koruma altına alınan, templated olmayan 5 '-Poly (A) lideridir. Poksvirüs enfeksiyonu sırasında mRNA tercüme 5 '-Poly (A) lideri rolünü incelemek için biz bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil geliştirdi. Bu muhabir tahlil dört temel adımlardan oluşur: (1) PCR in vitro transkripsiyon için DNA şablonunu yükseltmek için; (2) T7 RNA polimeraz kullanarak mRNA oluşturmak için in vitro transkripsiyon; (3) hücrelerde in vitro transkripsiyonu mRNA 'yı tanıtmak için transfeksiyon; (4) tercüme göstergesi olarak Lusiferaz aktivitesinin tespiti. RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil burada açıklanan poxvirus enfekte hücreler ve plazmid gelen şifreli transkripsiyon plazmid çoğaltma sorunları circumvents. Bu protokol, poxvirus enfekte hücreler dışındaki sistemlerde 5 '-UTR ve 3 '-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri düzenleme belirlemek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntem kullanılarak Cap-bağımlı, Cap-bağımsız, yeniden başlatma ve iç başlatma gibi farklı çeviri başlatma modları incelenebilir.

İn vitro transkripsiyon RNA tabanlı Lusiferaz Reporter tahlil dört adım: PCR In vitro transkripsiyonu için DNA şablonu oluşturmak için, mRNA üretmek için in vitro transkripsiyon, mRNA transfeksiyon, ve Lusiferaz ölçümü, şematik diyagramda görülebilir ( Şekil 1). Hem DNA şablonları (Fluc ve rluc) hem de çıkıntı uzantısı PCR genel şeması için astar tasarımı şematik olarak gösterilmiştir (Şekil 2a)...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Biz poxvirus enfekte hücreler içinde vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir assay kullanarak mRNA çeviri Yönetmeliği çalışmak için bir protokol sunuyoruz. Tahlil, 5 '-untranslated bölgesi (UTR) ve 3 '-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri Yönetmeliği eğitim için kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak farklı çeviri başlatma modları da incelenebilir.

In vitro transkripsiyonu RNA tabanlı luciferase Reporter assay Poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri Yönetmeliği çalışma

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

RNA tabanlı luciferase testi nin transkripsiyonu için protokolümüz, çiçek virüsü enfekte hücrelerde çeviri regülasyonunun incelenmesine yardımcı olur. Ayrıca, Poly (A) litre özelleştirilmiş bir uzunluk çeviri üzerindeki düzenleyici etkileri incelenmesine olanak sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, mRNA'da 5'UTR ve 3'UTR gibi Cis elemanları tarafından çeviri düzenlemesinin incelenmesine ve geniş çeviri başlatma spektrumuna olanak sağlamasıdır.In vitro transkripsiyonlu RNA tabanlı luciferase muhabir testi, kap ve diğer modifikasyonlara değişiklik yapmak üzere uyarlanmış ve çeviri üzerindeki etkisini test etmek için kullanılabilir. Başlamak için, 5'to 3'yönünde aşağıdaki öğeleri içeren PCR amplicon oluşturmak için ileri ve geri astar tasarımı:T7-Promoter, Poly(A)litre, Firefly Luciferase ORF bir Poly (A) kuyruk T7_12A-Fluc olarak anılacaktır, ileri astar birkaç ekstra nükleotitler t7-Promoter Poly (A)litre veya istenen 5'UTR dizisi ve yaklaşık 20 nükleotit muhabir genin ORF 5'sonuna karşılık gelen takip içerir. Astar uzunluğunu, muhabir genin ORF'sinin 5'sonuna karşılık gelen erime sıcaklığına göre ayarlayın ve astardaki ilgili bölgenin genin duyu iplikçiği ile aynı olmasını sağlar.Daha sonra Poly(A) kuyruğu nuve yaklaşık 20 nükleotit içerecek şekilde ters astar tasarlayın. Muhabir genin ORF'sinin 3'ucuna karşılık gelen erime sıcaklığına göre ayarlayın, astarın ilgili bölgesinin genin antisense iplikçiği ile aynı olmasını ve Poli(A) kuyruğundan önce çerçeve içi durdurma kodonunun bulunmasını sağlar. İç kontrol için, 5'to 3'yönünde aşağıdaki öğeleri içeren başka bir astar kümesi tasarlayabilirsiniz: T7-Promoter, Kozak dizisini içeren rastgele bir 5'UTR kodlama dizisi, Renilla Luciferase ORF ve T7_Kozak-Rluc olarak adlandırılan Poli(A)kuyruk.Reaksiyonu ayarlamak için, bir PCR tüpüne aşağıdaki sırayla reaktifler ekleyin:DNase serbest su, 2Kat yüksek sadakatli DNA polimeraz, astar lar ve dizi onaylı luciferase şablonu DNA'sına. Bir DNA şablonu oluşturmak için standart bir üç adımpcr döngüsünden sonra, pcr reaksiyonunun %5-10'unu moleküler ağırlık standardı ile birlikte %1 agarose TAE jel elektroforezinde çalıştırarak PCR ürününü tespit edin. PCR ürününün boyutunu belirlemek için jeli uv aydınlatıcının altında görselleştirin.PCR ürünün doğru boyutunu belirledikten sonra, DNA'yı eleştirmek için 100 mikrolitre nükleaz içermeyen su kullanarak ticari olarak kullanılabilen PCR arıtma kitini kullanarak arındırın. Saflaştırılmış DNA konsantrasyonuna bir spektrofotometre kullanarak kontrol edin ve in vitro transkripsiyon için hemen kullanılmak üzere eksi 20 santigrat derecede saklayın. PCR ürününden RNA sentezlemek için aşağıdaki reaktifleri mikrosantrifüj tüpüne ekleyin:DNase-RNase serbest su, NTP tampon karışımı, kapak analogu, PCR ürün şablonu ve in vitro transkripsiyon kitinden T7-RNA polimeraz karışımı.Iyice karıştırın. İki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatve sonra bir RNA arıtma kiti kullanarak sentezlenen RNA'nın saflaştırılmasına devam edin. Saflaştırılmış RNA kontrol etmek için, ısı RNA beş dakika ikincil yapısı kaldırmak ve 1.5 agarose TBE jel üzerinde çalıştırmak için.Sonra bir UV aydınlatıcı altında jel görselleştirin. Bir spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış RNA konsantrasyonu kontrol edin. Aliquot ve eksi 80 santigrat derece de saklayın.Tohum HeLa hücreleri 24 iyi plaka içinde% 80-90 birleştiği gün elde etmek ve bir gece boyunca bir kuvöz de 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile kuluçka. Beş enfeksiyon çokluğu ile Vaccinia virüsü ile HeLa hücreleri enfekte ve karşılaştırma için enfekte olmayan HeLa hücreleri tutun. Sonra 10 ila 12 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece plaka kuluçka.Enfeksiyon sonrası istenilen saatlerden sonra, Firefly Luciferase mRNA taşıyan 12A dizisinin 480 nanogramını ve Renilla Luciferase mRNA'yı taşıyan 20 nanogram Kozak dizisini bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın. Başka bir mikrosantrifüj tüpünde, katyonik lipid transfeksiyon reaktifi 1.1 mikrolitre ekleyin. Her iki tüpe de 55 mikrolitre azaltılmış serum media ekleyin, oda sıcaklığında beş dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.Daha sonra 55 mikrolitre katyonik lipid transfeksiyon reaktifi içeren azaltılmış serum media içeren mRNA içeren tüp ekleyin. Hafifçe ama iyice bir pipet ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka ile karıştırın. Kuluçka sırasında, hücrelerden hücre kültürü ortamı kaldırmak ve iyi başına azaltılmış serum orta 400 mikrolitre ekleyin.Kuluçka tamamlandığında, karışım damla akıllıca ve 24 iyi plaka kuyu başına eşit 100 mikrolitre ekleyin. 12A Fluc ve Kozak Rluc mRNA ile beş saat sonra co-transfection, hücrelerden azaltılmış serum ortamı kaldırmak ve iki muhabir tahlilleri gerçekleştirme yeteneğine sahip Luciferase tahlil kiti 150 mikrolitre 1X lysis tampon ekleyerek hücreleri lyse. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkadan sonra, kauçuk ve steril şırınga kullanarak hücreleri kazıyın ve mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Hücre enkazını püskürtmek için, 12,000 kez g'de 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca lysat'ı santrifüj edin. Opak duvarlı 96 iyi beyaz bir deneme plakası ve sağlam bir alt ile kuyu başına supernatant 30 mikrolitre aktarın. El yazmasında açıklandığı gibi kinetik işlevini kullanarak çift Parlaklığı ölçmek için Luciferase tsay kitini ve çok modlu plaka okuyucu luminometresini kullanın.Luminescence okuma verilerini istenilen dosya biçimine dışa aktardıktan sonra, enfekte olmamış ve VACV enfekte HeLA hücrelerinde 12A Fluc mRNA'dan gelen göreli çeviri oranını, Fluc değerini iç kontrol Rluc değerine bölerek belirleyin. Bu test, enfekte olmayan ve VACV enfekte hücrelerde 5'Poly(A)litre içeren bir Fluc mRNA'nın çeviri verimliliğini test etmek için kullanılmıştır. Hem enfekte olmayan hem de VACV enfekte hücreler Fluc ve Rluc mRNA ile başarılı bir şekilde transfeced edildi.Fluc'un Rluc tarafından bölünmesi, hücrelerdeki RNA stabilitede transfeksiyon verimliliğini normalleştirdi. 5'Poly(A)litre mRNA içeren enfekte olmayan hücrelere göre VACV enfeksiyonu sırasında çevirisel bir avantaja sahiptir. RNA düzeyi enfekte olmayan ve VACV enfekte hücrelerde mRNA transfeksiyonundan beş saat sonra benzer olduğu için bu durum diferansiyel transfeksiyon verimi veya mRNA stabilitesine bağlı değildi.Bu sadece PCR reaksiyon verimliliğini değil, aynı zamanda güçlendirilmiş DNA gerektiren tüm downstream süreçleri etkileyebilir gibi astar tasarlarken özel dikkat edin. Bu yöntem, cis elemanları tarafından çeviri düzenlemesini hızlı bir şekilde test etmek için önemli bir testtir. Mümkünse, bu yöntem diğer tamamlayıcı deneyler le doğrulanmalıdır.Vaccinia virüsü kullanılırken önlem alınmalı ve ethidium bromür ve fenol gibi kimyasallara maruz kalmaktan kaçınılmalıdır.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...