Name: an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af grundlæggende videnskabelige forsknings program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2017R1D1A3B03035662); og Hallym Universitets forskningsfond, 2017 (HRF-201703-003).

1. moden MicroRNA (miRNA) ekspressions analyse
<ol><li>
Ældre miRNA komplementær DNA (cDNA) syntese
	<ol>
<li>Tilsæt 254 ng af total RNA og 4,5 μl deoxyribonuclease i (DNase i) blandinger, og tilsæt derefter ultrarent vand til PCR Strip-rør for at gøre op til 18 μl (figur 2a). Forbered reaktionen for hver total RNA prøve renset fra flere cellelinjer ved hjælp af nok mængde DNase I blandinger baseret på det samlede antal reaktioner. Bemærk: ...

<ol>
	<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells.">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs-103/107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy.">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li><li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis.">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li><li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs,+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells.">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li><li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+miR-155/FOXO3a+and+miR-222/PTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line.">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3.">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li><li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+miR-107,+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+(pHGGs).">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li><li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunting+of+targets:+challenge+in+miRNA+research.">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li><li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis:+not+all+kits+are+created+equal.">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents,+5-Aza-CdR+and+FK228,+in+Human+Gastric+Cancer+Cells.">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN.">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer.">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li><li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+(MTT)+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays.">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47 (2015).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202 (2010).</li><li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+me+count+the+ways:+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs.">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li><li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay.">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation.">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li><li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways.">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li><li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches.">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer.">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li><li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets.">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li><li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression.">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li><li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+B+(SRB)+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation.">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li><li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+hematological+malignancies.">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+anticancer+drugs.">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li><li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide.">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method.">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li><li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing.">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li></ol>

Strategier til bestemmelse af bona fide miRNA mål med funktionerne i en miRNA af interesse er uundværlige for forståelsen af flere roller miRNAs. Identifikation af miRNA Target gener kan være en retningslinje for fortolkning af celle signalering hændelser moduleret af miRNAs i en celle. En afsløring af funktionelt vigtige mål gener af miRNAs kan give den grundlæggende viden til at udvikle en miRNA-baseret terapi i kræft.
Flere metoder såsom mikroarrays, lille RNA-Biblioteks sekvenser...

MicroRNAs (miRNAs) er de små regulerende RNAs, der primært moduter processen med oversættelse og nedbrydning af Messenger RNAs (mRNAs) ved at reagere på de 3 ' ikke-oversatte regioner (3 ' UTR) i bona fide Target gener1. Udtryk for miRNAs kan reguleres af transkriptionelle og post-transkriptionelle mekanismer. Ubalance i sådanne reguleringsmekanismer medfører ukontrollerede og karakteristiske miRNAs-udtryks niveauer i talrige sygdomme, herunder kræft2. En enkelt miRNA kan have flere interaktioner med forskellige mRNAs. Tilsvarende kan en individuel mRNA styres af forskellige miRNAs. Derfor er intracellulære signalerings netværk indviklet påvirket af karakteristisk udtrykte Mirnas, hvormed fysiologiske lidelser og sygdomme kan initieres og forværres2,3,4, 5 , 6. selv om det ændrede udtryk for Mirnas er blevet observeret i forskellige typer af kræft, de molekylære mekanismer, der modunere manerer af kræftceller i forbindelse med Mirnas er stadig stort set ukendte.
Akkumulerende beviser har vist, at de onkogene eller tumor-suppressiv roller miRNAs afhænger af de typer af kræft. For eksempel, ved at målrette forkhead box O3 (FOXO3), miR-155 fremmer celle proliferation, metastase, og chemoresistance af kolorektal cancer7,8. I modsætning hertil er begrænsningen af gliom celle invasion induceret af miR-107 via reguleringen af neurogen locus notch ligner protein 2 (NOTCH2) udtryk9. Vurderingen af miRNA-Target-interaktioner i forbindelse med miRNA-funktioner er en uundværlig del for bedre at forstå, hvordan miRNAs regulerer forskellige biologiske processer i både raske og syge stater10. Desuden kan opdagelsen af bona fide mål (r) af miRNAs yderligere give en finjusteret strategi for en miRNA-baseret terapi med forskellige anti-cancer narkotika. Den største udfordring i miRNAs-området er imidlertid at identificere de direkte mål for miRNAs. Her præsenteres detaljerede metoder som reproducerbare eksperimentelle tilgange til miRNA Target gen bestemmelse. Vellykket eksperimentel design for miRNA Target identifikation involverer forskellige trin og overvejelser (figur 1). Sammenligning af modne miRNA niveauer i tumorceller og normale celler kan være en af de fælles procedurer for at vælge en miRNA af interesse (figur 1a). Den funktionelle undersøgelse af en udvalgt miRNA til at påvise virkningerne af en miRNA på celle spredning er vigtigt at indsnævre listen over de bedste potentielle kandidat mål for en miRNA af interesse (figur 1b). Baseret på miRNAs eksperimentelt validerede funktioner kræves der en systematisk gennemgang af litteratur og database i selskab med et miRNA Target-forudsigelses program for at søge de mest relevante oplysninger om genfunktioner (figur 1c). Identifikationen af reelle mål gener af en Mirna af interesse kan opnås ved at gennemføre eksperimenter såsom der assay sammen med kloning af 3 ' UTR af et gen, real-time PCR, og Western blotting (figur 1d). Formålet med den nuværende protokol er at tilvejebringe omfattende metoder til nøgle eksperimenter, den sonde baserede realtids polymerasekæde reaktion (PCR), sulforhodamin B (SRB) assay efter en Mirna efterligne transfection, dosis-respons kurve generering og der assay sammen med kloning af 3 ' UTR af et gen. Den nuværende protokol kan være nyttig for en bedre forståelse af de enkelte miRNAs funktioner og konsekvenserne af en miRNA i kræftbehandling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading dye</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>RD006</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-cap strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010535</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010580</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-1L</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose A</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bio basic Canada Inc</td>
			<td>AB0028</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx 96 tube strips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401493</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx real-time PCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G8830A</td>
			<td>qPCR amplification, detection, and data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsiSI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0630</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPAN-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LCB-1203B-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chambers with V-slash</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>650010</td>
			<td>Cells counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>10X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN30200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NIPPON Genetics EUROPE</td>
			<td>MWD1</td>
			<td>1 Kb ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>100 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>100 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIT competent cells</td>
			<td>Real Biotech Corporation(RBC)</td>
			<td>RH617</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPNE cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar broth</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD7003</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>Model: E5311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Infinite F50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA control mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464058</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-107 mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464066</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>50 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus (electrophoresis system)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td></td>
			<td>Model: AD110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo explorer program</td>
			<td>GeneLink</td>
			<td></td>
			<td>For primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8X Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>500 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040117</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA miniprep S&#38; V kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN10200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R050A</td>
			<td>250 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Shaking platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LSI-3016A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 14 software</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td></td>
			<td>For dose-response curve generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine B powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1402-5G</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green master mix</td>
			<td>Smobio</td>
			<td>TQ12001805401-3</td>
			<td>Binding fluorescent dye for dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td>25,000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>200 reactions, no AmpErase UNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan miR RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C and 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>For amplification of DNA (or cDNA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells

MicroRNAs (miRNAs) er små regulerende RNAs, som er anerkendt for at modulere talrige intracellulære signalering veje i flere sygdomme, herunder kræft. Disse små regulerende RNAs interagerer primært med de 3 ' ikke-oversatte regioner (3 ' UTR) af deres Target Messenger RNAs (mRNAs) i sidste ende resulterer i hæmning af dekodning processer af mRNAs og augmentation af Target mRNA nedbrydelser. Baseret på udtryks niveauer og intracellulære funktioner, miRNAs er i stand til at fungere som regulerende faktorer af onkogen og tumor-suppressiv mRNAs. Identifikation af bona fide Target gener af en miRNA blandt hundredvis eller endda tusinder af beregningsmæssigt forudsagte mål er et afgørende skridt til at skelne mellem roller og grundlæggende molekylære mekanismer af en miRNA af interesse. Forskellige miRNA Target forudsigelse programmer er tilgængelige for at søge mulige miRNA-mRNA interaktioner. Men det mest udfordrende spørgsmål er, hvordan man validerer direkte Target gener af en miRNA af interesse. Denne protokol beskriver en reproducerbar strategi med nøgle metoder til, hvordan man identificerer miRNA-mål i forbindelse med en miRNA-funktion. Denne protokol indeholder en praktisk vejledning om trinvise procedurer til at afdække Mirna-niveauer, funktioner og relaterede mRNAs-mål ved hjælp af den Probe baserede realtids polymerasekædereaktion (PCR), sulforhodamin B (SRB) assay efter en Mirna efterligne transfektering , dosis-respons kurve generation, og der assay sammen med kloning af 3 ' UTR af et gen, som er nødvendig for korrekt forståelse af de enkelte Mirnas roller.

Vellykket og præcis bekræftelse af miRNA niveauer er vigtigt for fortolkningen af data, som klassificeringen af miRNAs er muligt baseret på de forventede roller miRNAs i udviklingen og progression af en sygdom. Niveauerne af miRNA-107 og miRNA-301 blev målt i tre bugspytkirtel cellelinjer ved hjælp af Probe-baserede kvantitative PCR. Syntesen af cDNAs af både en specifik miRNA og et reference gen i samme reaktion kan øge reproducerbarhed af data. Panc-1 og capan-1 er humane pancreas duktalt adenokarcinom cellelinj...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Denne protokol bruger en Probe-baseret real-time polymerase kædereaktion (PCR), en sulforhodamin B (SRB) assay, 3 ' ikke oversat regioner (3 ' UTR) kloning, og en der analyse for at verificere målgener af en Mirna af interesse og til at forstå funktionerne i Mirnas.

En in vitro-protokol til evaluering af MicroRNA-niveauer, funktioner og tilknyttede Målgener i tumor celler

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

For at få adgang til neurale microRNA mål interaktioner med MicroRNA funktioner er afgørende for at forstå, hvordan MicroRNAs regulere forskellige biologiske processer i både sunde og syge tilstande. Denne protokol beskriver reproducering gennem strategi til at identificere microRNA-mål og de funktionelle microRNA'er, da valideringen af direkte mål for microRNA'er er udfordrende. Vores protokol kan give indsigt i funktionen af individuelle microRNA'er og konsekvenserne af et mikroRNA i kræftbehandling.Beregning af den halvmaksimale hæmmende koncentration er en vigtig metode, ikke kun for microRNA-undersøgelser, men for effektiv evaluering af andre lægemidler mod kræft. Vores protokol vil være nyttigt at nye forskere, da vi beskrev den grundlæggende metode til at forstå niveauet af microRNA'er i en celle. Hvis du vil starte protokollen, skal du tælle cellerne med celletælleren.Plade cellerne i en 96 brøndplade. Den næste dag, forberede et sæt af transfektion blandinger til at transfect cellerne i flere endelige koncentrationer af microRNA kontrol efterligne, og microRNA-107 efterligne. Fra en bestand af 25 micromolar microRNA kontrol efterligne, eller microRNA-107 efterligne, fortyndet og tilføje kontrol efterligne eller microRNA-107 efterligne i den reducerede serum medier sammen med transfection reagens i mikrocentrifuge rør.Bland forsigtigt de oligoholdige blandinger ved hjælp af en mikropipette. Efter en 10 minutters inkubation i cellekulturhætten blandes de oligoholdige blandinger forsigtigt igen, og der tilsættes derefter 50 mikroliter af blandingerne i hver brønd. Hold de transfmittede celler i en cellekultur inkubator.Insug forsigtigt cellekulturmedierne i hver brønd på pladen og fyld straks 100 mikroliter af 10 % trichloreddikesyre eller TCA i hver brønd. Hold pladen indeholdende 10% TCA ved fire grader Celsius i en time. Vask derefter pladen flere gange ved at nedsænke den i et badekar med vand fra hanen.Fjern overskydende vand fra indersiden af brøndene ved at banke på pladen, indtil der ikke er vand tilbage, og tør pladen. Pipette 50 mikroliter af 0,4% SRB opløsning i hver brønd, herunder de tomme brønde. Ryst forsigtigt pladen, indtil 0,4%SRB-opløsningen dækker bunden af brøndene jævnt.Derefter inkuberes pladen i 40 til 60 minutter. Efter inkubationen vaskes pladen med 1%eddikesyre, indtil det ubundne farvestof er helt vasket væk. Pipette 100 mikroliter af 10 millimolar Tris basisopløsning i de tilsvarende brønde, herunder tomme brønde.Hold pladen på en shaker i 10 minutter. Absorbansen måles ved 492 nanometer. Procentdelen af gennemsnitlig absorbans og standardafvigelsen for hver gruppe beregnes ved hjælp af absorbansværdierne for SRB-analysen.Importér de rådata, herunder behandlingskoncentrationer, gennemsnitlig absorbans og standardafvigelse, i softwaren ved vertikalt at justere dataene. Klik på fanen Opret diagram, og vælg de simple punktfejllinjer. Vælg regnearkskolonner som symbolværdier, og klik derefter på næste.Vælg X-Y-par i panelet Dataformat, og klik på næste. Vælg tilsvarende datakolonner i panelet Vælg data. Klik på Udfør for at oprette plottet.Dobbeltklik på X-aksen for at ændre skalatypen i skaleringen af aksen. Rediger skalatypen fra lineær til log. Rediger start- og slutområdets tal til henholdsvis 0,01 og 200.Højreklik på et punktplot, vælg Kurvepasning, og gå til underkategorien Brugerdefineret. Vælg dosisresponskurve. Klik på de næste knapper, og klik derefter på Udfør.Gå til rapportfanen, og kontroller derefter værdierne n, k og R. Kør PCR som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Derefter gå videre til dobbelt-fordøjelse ved at kombinere reaktionen blandinger, herunder begrænsning enzymer Exo1 og Not1 en i et rør.Inkuber blandingerne i tre til fire timer i et 37 grader Celsius vandbad. Kør dobbeltfordøjede produkter på en 1% agarose gel. Skær derefter båndene under UV-lys.Rens de dobbeltfordøjede PCR-produkter og luciferasevektorer fra de punkterede bånd. Fortsæt med ligation af PCR-produkterne i luciferasevektorerne ved at forberede 20 mikroliter af ligationsreaktionsblandinger, herunder DNA-ligasen. Røret centrifugeres kortvarigt i 10 til 15 sekunder.Inkuber ligationen ved 16 grader Celsius natten over ved hjælp af en termisk cycler. Den næste dag, udføre transformation ved at tilføje ligation blandinger i røret, der indeholder kompetente celler. Bank forsigtigt på røret og hold det på is i 20 minutter.Hurtigt og forsigtigt overføre røret til en varmeblok ved 42 grader Celsius i 30 sekunder til et minut. Efter varmechok, placere røret på is i 20 minutter. Spred kompetente celler på en LB agar plade.Vokse kompetente celler i en kuvøse ved 37 grader Celsius natten over. Den følgende dag, vælge en individuel koloni og resuspend E.coli i en af de 8-bånds rør, der indeholder ultrapure vand, og gentag dette trin for at resuspend E.coli fra fire til otte tilfældigt udvalgte kolonier. Overfør 25 mikroliter af E.coli suspension i et andet sæt af 8-strip rør.Udfør kolonien PCR ved hjælp af E.coli suspensionen. Forbered luciferase assay i en 24 godt plade. Tilføj en til to gange ti til de fire celler i en 500 mikroliter cellekultur medier for hver brønd.Efter natten inkubation, transfect 50 nanogram luciferase vektorer i cellerne med kontrol efterligne eller en bestemt microRNA efterligne ved hjælp af en transfektion reagens. Den næste dag, vaske indersiden af brøndene to gange ved hjælp af fosfat buffered saltvand. Påfør 200 mikroliter lysis reagens i brøndene og udføre cellelysis tilstrækkeligt, før luciferaseaktiviteten måles.Hold pladen rystende i mindst 15 minutter. Overfør fem til 10 mikroliter cellelys i det nye rør, og tilsæt 100 mikroliter reagens et og bland straks opløsningen ved pipettering. Læs derefter firefly luciferase aktivitet ved hjælp af illuminometer i 10 til 15 sekunder.Tilsæt 100 mikroliter reagens to i samme rør og derefter blandes ved pipettering to gange. Endelig læse renilla luciferase aktivitet i 10 til 15 sekunder ved hjælp af illuminometer. RTPCR viser en signifikant reduktion af mikroRNA-107 og PANC-1 og CAPAN-1 celler sammenlignet med HPNE-celler.MikroRNA-301-niveauerne blev betydeligt opreguleret i PANC-1- og CAPAN-1-celler sammenlignet med HPNE-celler. SRB-analysen i denne undersøgelse viser tydeligt, at spredningen af PANC-1 celler faldt efter en microRNA-107 efterligne transfektion. Screeningen af 11 potentielle forudsagte mål for microRNA-107 viser tydeligt, at kun synuclein gamma, eller SNCG, en positiv regulator af tumorcellevækst direkte interagerer med microRNA-107 og PANC-1 celler, hvilket indikerer, at microRNA-107 kan negativt regulere udbredelsen af PANC-1 celler ved at modulere SNCG-udtrykket.Voksne celle proliferation assays, der bruger tetra hydroleum-baserede enhed og CFSE er gældende for at screene effekten af såsom microRNA efterligner, afhængigt af celletyper. Baseret på den eksperimentelt validerede funktion af microRNA'er, en systematisk gennemgang af database og mål forudsigelse program er nødvendig for at indsnævre listen over kandidatmål før luciferase assays. Til evaluering af kombinationseffektivitet af mikroRNA'er med lægemidler mod kræft er det en fordel at beregne justerede IC-værdier baseret på vores protokol til vurdering af kombinationsindeks.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse af partikler i luften-induceret kromosomafvigelser Brug af en<em&gt; In vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptid-afledt metode til Transport gener og proteiner Across Cellular og Organellar Barrierer i Planter

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemisk levering af mikroRNA ved hjælp af rekombinante Adeno-associeret Virus Serotype 9 til behandling af neuromuskulære sygdomme i gnavere

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescens Assay at karakterisere døgnrytme i Brystkirtlerne epitelceller

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokol for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Forbigående udtryk af fremmede gener i insekt celler (sf9) for Protein funktionel analyse

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekventering: Supplerende DNA bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af Formalin-fast Paraffin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funktionel undersøgelse af sygdoms associerede sjældne humane varianter ved hjælp af Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Brugen af mus mammary tumor celler i en in vitro invasion analyse som et mål for Oncogenic celle adfærd

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...