Name: an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par le Programme de recherche en sciences fondamentales par l'intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le ministère de l'Éducation (2017R1D1A3B03035662); et le Fonds de recherche universitaire Hallym, 2017 (HRF-201703-003).

1. Analyse d'expression de MicroRNA mature (miRNA)
<ol><li>
Synthèse d'ADN complémentaire de miRNA mûr (cDNA)
	<ol>
<li>Ajouter 254 ng d'ARN total et 4,5 l de mélanges de désoxyribonuclease I (DNase I), puis ajouter de l'eau ultrapure dans des tubes à bande PCR pour faire jusqu'à 18 l (Figure 2A). Préparer la réaction pour chaque échantillon total d'ARN purifié à partir de plusieurs lignées cellulaires en utilisant une quantité suffisante de mélanges DNase I...

<ol>
	<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells.">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs-103/107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy.">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li><li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis.">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li><li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs,+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells.">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li><li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+miR-155/FOXO3a+and+miR-222/PTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line.">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3.">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li><li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+miR-107,+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+(pHGGs).">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li><li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunting+of+targets:+challenge+in+miRNA+research.">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li><li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis:+not+all+kits+are+created+equal.">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer.">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li><li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+(MTT)+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays.">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47 (2015).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202 (2010).</li><li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+me+count+the+ways:+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs.">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li><li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay.">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation.">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li><li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways.">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li><li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches.">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer.">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li><li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets.">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li><li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression.">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li><li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+B+(SRB)+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation.">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li><li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+hematological+malignancies.">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+anticancer+drugs.">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li><li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide.">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method.">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li><li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing.">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li></ol>

Les stratégies pour la détermination des cibles de miRNA de bonne foi avec les fonctions d'un miRNA d'intérêt sont indispensables pour la compréhension des rôles multiples des miRNAs. L'identification des gènes cibles miRNA peut être une ligne directrice pour interpréter les événements de signalisation cellulaire modulées par des miARN dans une cellule. Un dévoilement des gènes cibles fonctionnellement importants des miARN peut fournir les connaissances fondamentales pour développer une thérapie miRNA-bas...

Les microARN (miARN) sont les petites ARN réglementaires qui modulent principalement le processus de traduction et de dégradation des ARN messagers (ARM) en réagissant aux 3' régions non traduites (3' UTR) dans les gènes cibles de bonne foi1. L'expression des miARN peut être réglée par des mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels. Le déséquilibre de ces mécanismes de réglementation apporte des niveaux d'expression miRNAs incontrôlés et distinctifs dans de nombreuses maladies, y compris les cancers2. Un seul miRNA peut avoir de multiples interactions avec divers ARNm. En conséquence, un ARNm individuel peut être contrôlé par divers miRNAs. Par conséquent, les réseaux de signalisation intracellulaire sont indirectement influencés par des miARN exprimés de façon distinctive par lesquels les troubles physiologiques et les maladies peuvent être initiés et détériorés2,3,4, 5 Annonces , 6. Bien que l'expression altérée des miARN ait été observée dans divers types de cancers, les mécanismes moléculaires qui modulent les manières des cellules cancéreuses en conjonction avec des miARN sont encore largement inconnus.
L'accumulation des preuves a montré que les rôles oncogènes ou tumorales-suppresseurs des miARN dépendent des types de cancers. Par exemple, en ciblant la boîte de tête de fourche o3 (FOXO3), miR-155 favorise la prolifération cellulaire, la métastasie et la chimiorésistance du cancer colorectal7,8. En revanche, la restriction de l'invasion de cellules de glioma est induite par miR-107 parl'intermédiaire de la régulation de la protéine d'homologaire neurogène d'entaille de locus 2 (NOTCH2) expression 9. L'évaluation des interactions miRNA-cible en relation avec les fonctions miRNA est une partie indispensable pour mieux comprendre comment les miARN régulent divers processus biologiques dans les états sains et malades10. En outre, la découverte de cibles de bonne foi (s) de miARN peut en outre fournir une stratégie affinée pour une thérapie miRNA-basée avec divers médicaments anticancéreux. Cependant, le principal défi dans le domaine des miRNAs est l'identification de cibles directes des miRNAs. Ici, des méthodes détaillées sont présentées comme des approches expérimentales reproductibles pour la détermination du gène cible miRNA. La conception expérimentale réussie de l'identification cible miRNA comporte diverses étapes et considérations (figure 1). La comparaison des niveaux mûrs de miRNA dans les cellules de tumeur et les cellules normales peut être l'une des procédures communes pour sélectionner un miRNA d'intérêt (Figure 1A). L'étude fonctionnelle d'un miRNA sélectionné pour détecter les effets d'un miRNA sur la prolifération cellulaire est importante pour réduire la liste des meilleures cibles candidates potentielles d'un miRNA d'intérêt (Figure 1B). Sur la base des fonctions expérimentalement validées des miARN, un examen systématique de la littérature et de la base de données en compagnie d'un programme de prédiction cible miRNA est nécessaire pour rechercher les informations les plus pertinentes sur les fonctions génétiques (figure 1C). L'identification de gènes cibles réels d'un miRNA d'intérêt peut être réalisée en mettant en œuvre des expériences telles que l'analyse de la luciferase avec le clonage de 3' UTR d'un gène, PCR en temps réel, et le ballonnement occidental (Figure 1D). L'objectif du protocole actuel est de fournir des méthodes complètes d'expériences clés, la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, l'analyse de sulforhodamine B (SRB) suivant un miRNA imitant la transfection, la génération de courbes dose-réponse, et luciferase avec le clonage de 3' UTR d'un gène. Le protocole actuel peut être utile pour une meilleure compréhension des fonctions des miARN individuels et de l'implication d'un miRNA dans la thérapie contre le cancer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading dye</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>RD006</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-cap strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010535</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010580</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-1L</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose A</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bio basic Canada Inc</td>
			<td>AB0028</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx 96 tube strips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401493</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx real-time PCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G8830A</td>
			<td>qPCR amplification, detection, and data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsiSI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0630</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPAN-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LCB-1203B-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chambers with V-slash</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>650010</td>
			<td>Cells counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>10X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN30200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NIPPON Genetics EUROPE</td>
			<td>MWD1</td>
			<td>1 Kb ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>100 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>100 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIT competent cells</td>
			<td>Real Biotech Corporation(RBC)</td>
			<td>RH617</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPNE cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar broth</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD7003</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>Model: E5311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Infinite F50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA control mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464058</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-107 mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464066</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>50 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus (electrophoresis system)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td></td>
			<td>Model: AD110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo explorer program</td>
			<td>GeneLink</td>
			<td></td>
			<td>For primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8X Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>500 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040117</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA miniprep S&#38; V kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN10200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R050A</td>
			<td>250 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Shaking platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LSI-3016A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 14 software</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td></td>
			<td>For dose-response curve generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine B powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1402-5G</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green master mix</td>
			<td>Smobio</td>
			<td>TQ12001805401-3</td>
			<td>Binding fluorescent dye for dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td>25,000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>200 reactions, no AmpErase UNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan miR RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C and 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>For amplification of DNA (or cDNA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells

Les microARN (miARN) sont de petits ARN régulateurs qui sont reconnus pour moduler de nombreuses voies de signalisation intracellulaire dans plusieurs maladies, y compris les cancers. Ces petits ARN régulateurs interagissent principalement avec les 3' régions non traduites (3' UTR) de leurs ARN messagers cibles (ARNM) aboutissant finalement à l'inhibition des processus de décodage des ARNm et à l'augmentation des dégradations de l'ARNm cible. Basé sur les niveaux d'expression et les fonctions intracellulaires, les miRNAs peuvent servir de facteurs régulateurs des ARNm oncogènes et suppresseurs de tumeurs. L'identification des gènes cibles de bonne foi d'un miRNA parmi des centaines, voire des milliers de cibles prédites par le calcul est une étape cruciale pour discerner les rôles et les mécanismes moléculaires de base d'un miRNA d'intérêt. Divers programmes de prédiction cible miRNA sont disponibles pour rechercher les interactions possibles miRNA-mRNA. Cependant, la question la plus difficile est de savoir comment valider les gènes cibles directs d'un miRNA d'intérêt. Ce protocole décrit une stratégie reproductible des méthodes clés sur la façon d'identifier les cibles miRNA liées à la fonction d'un miRNA. Ce protocole présente un guide pratique sur les procédures étape par étape pour découvrir les niveaux de miRNA, les fonctions et les ARNc cibles connexes à l'aide de la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) à base de sonde, d'un test de sulforhodamine B (SRB) à la suite d'une transfétion miRNA imitant la transfection , génération de courbe dose-réponse, et test de luciferase avec le clonage de 3' UTR d'un gène, qui est nécessaire pour une bonne compréhension des rôles des miRNAs individuels.

La confirmation réussie et précise des niveaux de miRNA est importante pour l'interprétation des données par lesquelles la classification des miARN est possible basée sur les rôles prévus des miRNAs dans le développement et la progression d'une maladie. Les niveaux de miRNA-107 et de miRNA-301 ont été mesurés dans trois lignes de cellules de pancréas utilisant le PCR quantitatif basé sur sonde. La synthèse des ADNC d'un miRNA spécifique et d'un gène de référence dans la même réaction peut augmenter la...

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An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Ce protocole utilise une réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, un prédisme de sulforhodamine B (SRB), 3' régions non traduites (3' UTR) et un résultat de luciferase pour vérifier les gènes cibles d'un miRNA d'intérêt et pour comprendre les fonctions des miRNAs.

Un protocole in vitro pour évaluer les niveaux de microARN, les fonctions et les gènes cibles associés dans les cellules tumorales

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Pour accéder aux interactions cibles neuronales de microARN avec les fonctions microARN est essentiel pour comprendre comment les MicroARN régulent divers processus biologiques dans les états sains et maladie. Ce protocole décrit la reproduction par stratégie visant à identifier les cibles de microARN et les microARN fonctionnels, car la validation de la cible directe des microARN est difficile. Notre protocole peut fournir un aperçu de la fonction des microARN individuels et de l’implication d’un microARN dans la thérapie contre le cancer.Le calcul de la concentration inhibitrice semi-maximale est une méthode importante, non seulement pour les études de microARN, mais aussi pour l’évaluation efficace d’autres médicaments anticancéreux. Notre protocole sera utile aux nouveaux chercheurs puisque nous avons décrit la méthode fondamentale pour comprendre le niveau de microARN dans une cellule. Pour commencer le protocole, comptez les cellules avec le compteur cellulaire.Plaquez les cellules dans une plaque de puits de 96. Le lendemain, préparez un ensemble de mélanges de transfection pour transfecter les cellules dans plusieurs concentrations finales de contrôle de microARN imiter, et microARN-107 imiter. À partir d’un stock de 25 micromolaires microARN contrôle imiter, ou microARN-107 imiter, diluer et ajouter le contrôle imiter ou microARN-107 imiter dans le média sérique réduit avec le réagent transfection dans les tubes de microcentrifugeuse.Mélanger délicatement les mélanges contenant de l’oligo à l’aide d’une micropipette. Après une incubation de 10 minutes dans le capot de culture cellulaire, mélanger délicatement les mélanges contenant de l’oligo à nouveau, puis ajouter 50 microlitres des mélanges dans chaque puits. Gardez les cellules transfectées dans un incubateur de culture cellulaire.Aspirez soigneusement le média de culture cellulaire dans chaque puits de la plaque et remplissez rapidement 100 microlitres d’acide trichloroacetic de 10%, ou TCA, dans chaque puits. Gardez la plaque contenant 10% de TCA à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, lavez la plaque plusieurs fois en la arrosant dans une baignoire avec de l’eau du robinet.Retirer l’excès d’eau de l’intérieur des puits en tapant sur la plaque jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’eau et sécher la plaque. Pipette 50 microlitres de solution SRB de 0,4 % dans chaque puits, y compris les puits vierges. Secouez doucement la plaque jusqu’à ce que la solution 0,4 % SRB recouvre uniformément le fond des puits.Ensuite, incuber la plaque pendant 40 à 60 minutes. Après l’incubation, laver la plaque avec 1% d’acide acétique jusqu’à ce que le colorant non lié soit totalement emporté. Pipette 100 microlitres de solution de base Tris de 10 millimolaires dans les puits correspondants, y compris les puits vierges.Garder l’assiette sur un shaker pendant 10 minutes. Mesurer l’absorption à 492 nanomètres. Calculer le pourcentage d’absorption moyenne et l’écart type de chaque groupe à l’aide des valeurs d’absorption de l’analyse SRB.Importer les données brutes, y compris les concentrations de traitement, l’absorption moyenne et l’écart type dans le logiciel en alignant verticalement les données. Cliquez sur l’onglet Créer un graphique et choisissez les barres d’erreur scatter simples. Sélectionnez les colonnes de feuille de travail sous forme de valeurs de symbole et cliquez ensuite.Dans le panneau Format de données, sélectionnez paires X-Y et cliquez ensuite. Sélectionnez les colonnes de données correspondantes dans le panneau Sélectionner les données. Cliquez sur la finition pour créer l’intrigue.Double-cliquez sur l’axe X pour modifier le type d’échelle dans l’échelle de l’axe. Modifiez le type d’échelle du linéaire au journal. Modifiez le numéro de plage de début et de fin à 0,01 et 200, respectivement.Cliquez à droite sur n’importe quelle parcelle scatter, choisissez Curve Fit et rendez-vous à la sous-catégorie Utilisateur Défini. Sélectionnez la courbe de réponse à la dose. Cliquez sur les boutons suivant, puis cliquez sur terminer.Allez à l’onglet rapport, puis vérifiez les valeurs n, k et R. Exécutez le PCR tel que détaillé dans le protocole texte qui l’accompagne. Passez ensuite à la double digestion en combinant les mélanges de réaction, y compris les enzymes de restriction Exo1 et Not1 dans un tube.Incuber les mélanges pendant trois à quatre heures dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Exécutez les produits à double digestion sur un gel agarose de 1 %. Ensuite, coupez les bandes sous la lumière UV.Purifiez les produits PCR à double digestion et les vecteurs de luciferase des bandes excisées. Continuer avec la ligature des produits PCR dans les vecteurs de luciferase en préparant 20 microlitres de mélanges de réaction de ligature, y compris la ligase d’ADN. Centrifuger brièvement le tube pendant 10 à 15 secondes.Incuber la ligature à 16 degrés Celsius pendant la nuit à l’aide d’un cycleur thermique. Le lendemain, effectuer la transformation en ajoutant les mélanges de ligature dans le tube contenant des cellules compétentes. Appuyez doucement sur le tube et gardez-le sur la glace pendant 20 minutes.Transférer rapidement et doucement le tube dans un bloc thermique à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes à une minute. Après le choc thermique, placer le tube sur la glace pendant 20 minutes. Étendre les cellules compétentes sur une plaque d’agar LB.Cultiver des cellules compétentes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, choisissez une colonie individuelle et réutilisez E.coli dans l’un des tubes à huit bandes contenant de l’eau ultrapure, et répétez cette étape pour résuspendre E.coli de quatre à huit colonies choisies au hasard. Transférer 25 microlitres de suspension E.coli dans un autre ensemble de tubes à 8 bandes.Effectuez le PCR de la colonie à l’aide de la suspension E.coli. Préparer l’essai de luciferase dans une assiette de 24 puits. Ajouter une à deux fois dix aux quatre cellules dans un média de culture cellulaire de 500 microlitres pour chaque puits.Après l’incubation pendant la nuit, transfect 50 nanogrammes de vecteurs de luciferase dans les cellules avec imitation de contrôle ou un microARN spécifique imiter à l’aide d’un réaccente de transfection. Le lendemain, lavez l’intérieur des puits deux fois à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate. Appliquer 200 microlitres de réagenisseur de lyse dans les puits et effectuer suffisamment de lyse cellulaire avant de mesurer l’activité de la luciferase.Garder la plaque en secouant pendant au moins 15 minutes. Transférer de cinq à 10 microlitres de lysate cellulaire dans le nouveau tube, et ajouter 100 microlitres de réaccent et mélanger immédiatement la solution par pipetting. Ensuite, lisez l’activité luciferase firefly à l’aide d’illuminomètre pendant 10 à 15 secondes.Ajouter 100 microlitres de réaccente deux dans le même tube, puis mélanger par pipetting deux fois. Enfin, lisez l’activité renilla luciferase pendant 10 à 15 secondes à l’aide d’un illuminomètre. RTPCR montre une réduction significative des cellules microARN-107 et PANC-1 et CAPAN-1 par rapport aux cellules HPNE.Les niveaux de microARN-301 ont été significativement augmentés dans les cellules PANC-1 et CAPAN-1, comparées aux cellules HPNE. L’analyse de SRB dans cette étude démontre clairement que la prolifération des cellules PANC-1 a diminué suivant une transfection d’imitation de microRNA-107. Le criblage de 11 cibles potentielles prévues du microARN-107 montre clairement que seulement le gamma de synucléine, ou SNCG, un régulateur positif de la croissance de cellules de tumeur interagit directement avec des cellules de microARN-107 et de PANC-1, indiquant que le microARN-107 peut régler négativement la prolifération des cellules PANC-1 en modulant l’expression de SNCG.Les analyses de prolifération cellulaire pour adultes qui utilisent l’entité à base d’hydroléum tetra et le CFSE sont applicables pour filtrer l’effet de tels que les imitations de microARN, selon les types de cellules. Sur la base de la fonction validée expérimentalement des microARN, un examen systématique de la base de données et du programme de prévision cible est nécessaire pour affiner la liste des cibles des candidats avant les essais de luciferase. Pour l’évaluation de l’efficacité combinée des microARN avec des médicaments anticancéreux, il est avantageux de calculer les valeurs ic ajustées en fonction de notre protocole pour l’évaluation de l’indice combiné.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse de la Aberrations chromosomiques Ambient particules induite par l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; système

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Recherche

Génétique

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptide dérivé Méthode du transport des gènes et des protéines Across cellulaire et obstacles organites dans les plantes

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Délivrance systémique des micro-ARN, à l’aide de Recombinant Adeno-associated Virus sérotype 9 pour traiter des maladies neuromusculaires chez les rongeurs

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Expression transitoire de gènes étrangers dans des cellules d’insecte (sf9) pour l’analyse fonctionnelle de la protéine

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

MicroARN rétrospective séquençage : L’ADN complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’ARN de paraffine fixés au formol

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Étude fonctionnelle In Vivo des variantes humaines rares associées à la maladie utilisant la drosophile

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

L'utilisation de cellules de tumeur mammaire de souris dans un analyse d'invasion in vitro comme mesure du comportement cellulaire oncogène

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...