Name: an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

Diese Studie wurde vom Basic Science Research Program von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die vom Bildungsministerium (2017R1D1A3B03035662) gefördert wurde. und Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).

1. Reife MicroRNA (miRNA) Expressionsanalyse
<ol><li>
Reife miRNA-Komplementär-DNA-Synthese (cDNA)
	<ol>
<li>Fügen Sie 254 ng der gesamten RNA und 4,5 l Desoxyribonuklease I (DNase I) Gemische hinzu, und fügen Sie dann Reinstwasser in PCR-Streifenröhren ein, um bis zu 18 l zu bilden (Abbildung 2A). Bereiten Sie die Reaktion für jede gesamte RNA-Probe vor, die aus mehreren Zelllinien mit genügend DNase-I-Mischungen gereinigt wird, basierend auf der Gesamtzahl der Reak...

<ol>
	<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells.">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs-103/107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy.">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li><li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+miR-155/FOXO3a+and+miR-222/PTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line.">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3.">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li><li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+miR-107,+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+(pHGGs).">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li><li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. 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M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202 (2010).</li><li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+me+count+the+ways:+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs.">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li><li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay.">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation.">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li><li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways.">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li><li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches.">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer.">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li><li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets.">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li><li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression.">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li><li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+B+(SRB)+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation.">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li><li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+hematological+malignancies.">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+anticancer+drugs.">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li><li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide.">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method.">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li><li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing.">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li></ol>

Strategien zur Bestimmung von gutgläubigen miRNA-Zielen mit den Funktionen einer miRNA von Interesse sind für das Verständnis mehrerer Rollen von miRNAs unverzichtbar. Die Identifizierung von miRNA-Zielgenen kann eine Richtschnur für die Interpretation der von miRNAs in einer Zelle modulierten Zellsignalereignisse sein. Eine Enthüllung funktionell wichtiger Zielgene von miRNAs kann das grundlegende Wissen zur Entwicklung einer miRNA-basierten Therapie bei Krebs liefern.
Mehrere Methoden w...

MicroRNAs (miRNAs) sind die kleinen regulatorischen RNAs, die hauptsächlich den Prozess der Übersetzung und des Abbaus von Messenger RNAs (mRNAs) modulieren, indem sie auf die 3' unübersetzten Regionen (3' UTR) in gutgläubigen Zielgenen1reagieren. Die Expression von miRNAs kann durch transkriptionelle und posttranskriptionelle Mechanismen reguliert werden. Das Ungleichgewicht solcher Regulierungsmechanismen führt zu unkontrollierten und ausgeprägten miRNAs Expressionsniveaus bei zahlreichen Krankheiten, einschließlich Krebsarten2. Eine einzelne miRNA kann mehrere Wechselwirkungen mit verschiedenen mRNAs haben. Entsprechend kann eine einzelne mRNA durch verschiedene miRNAs gesteuert werden. Daher werden intrazelluläre Signalnetze aufwendig durch markant exprimierte miRNAs beeinflusst, durch die physiologische Störungen und Krankheiten initiiert und verschlechtert werden können2,3,4, 5 , 6. Obwohl die veränderte Expression von miRNAs bei verschiedenen Krebsarten beobachtet wurde, sind die molekularen Mechanismen, die die Manieren von Krebszellen in Verbindung mit miRNAs modulieren, noch weitgehend unbekannt.
Die Akkumulierenden Beweise zeigen, dass die onkogenen oder tumorsuppressiven Rollen von miRNAs von den Krebsarten abhängen. Zum Beispiel, indem for targeting Gabelkopf-Box o3 (FOXO3), miR-155 fördert die Zellproliferation, Metastasierung, und Chemoresistenz von Dickdarmkrebs7,8. Im Gegensatz dazu wird die Restriktion der Gliomzellinvasion durch miR-107 durch die Regulation der neurogenen Locus Kerch Homolog Protein 2 (NOTCH2) Expression9induziert. Die Bewertung von miRNA-Ziel-Wechselwirkungen im Zusammenhang mit miRNA-Funktionen ist ein unverzichtbarer Bestandteil, um besser zu verstehen, wie miRNAs verschiedene biologische Prozesse sowohl in gesunden als auch in kranken Zuständen regulieren10. Darüber hinaus kann die Entdeckung von gutgläubigen Zielen von miRNAs eine fein abgestimmte Strategie für eine miRNA-basierte Therapie mit verschiedenen Krebsmedikamenten bieten. Die größte Herausforderung im Bereich der miRNAs ist jedoch die Identifizierung direkter Ziele von miRNAs. Hier werden detaillierte Methoden als reproduzierbare experimentelle Ansätze für die miRNA-Zielgenbestimmung präsentiert. Erfolgreiches experimentelles Design für die miRNA-Zielidentifikation umfasst verschiedene Schritte und Überlegungen (Abbildung 1). Der Vergleich der reifen miRNA-Spiegel in Tumorzellen und normalen Zellen kann eine der üblichen Verfahren zur Auswahl einer miRNA von Interesse sein (Abbildung 1A). Die funktionelle Studie einer ausgewählten miRNA zum Nachweis der Auswirkungen einer miRNA auf die Zellproliferation ist wichtig, um die Liste der besten potenziellen Kandidatenziele einer miRNA von Interesse einzugrenzen (Abbildung 1B). Basierend auf den experimentell validierten Funktionen von miRNAs ist eine systematische Überprüfung von Literatur und Datenbank in Unternehmen mit einem miRNA-Zielvorhersageprogramm erforderlich, um die relevantesten Informationen über Genfunktionen zu durchsuchen (Abbildung 1C). Die Identifizierung von realen Zielgenen einer miRNA von Interesse kann durch die Durchführung von Experimenten wie dem Luziferase-Assay zusammen mit dem Klonen von 3' UTR eines Gens, Echtzeit-PCR und Western Blotting (Abbildung 1D) erreicht werden. Ziel des aktuellen Protokolls ist es, umfassende Methoden für Schlüsselexperimente, die sonsonbasierte Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Sulforhodamin B (SRB) nach einer miRNA-Mimiktransfektion, Dosis-Wirkungs-Kurvengenerierung und luziferase-Assay zusammen mit dem Klonen von 3' UTR eines Gens. Das aktuelle Protokoll kann für ein besseres Verständnis der Funktionen einzelner miRNAs und die Implikation einer miRNA in der Krebstherapie nützlich sein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading dye</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>RD006</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-cap strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010535</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010580</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-1L</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose A</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bio basic Canada Inc</td>
			<td>AB0028</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx 96 tube strips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401493</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx real-time PCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G8830A</td>
			<td>qPCR amplification, detection, and data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsiSI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0630</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPAN-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LCB-1203B-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chambers with V-slash</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>650010</td>
			<td>Cells counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>10X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN30200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NIPPON Genetics EUROPE</td>
			<td>MWD1</td>
			<td>1 Kb ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>100 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>100 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIT competent cells</td>
			<td>Real Biotech Corporation(RBC)</td>
			<td>RH617</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPNE cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar broth</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD7003</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>Model: E5311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Infinite F50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA control mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464058</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-107 mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464066</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>50 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus (electrophoresis system)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td></td>
			<td>Model: AD110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo explorer program</td>
			<td>GeneLink</td>
			<td></td>
			<td>For primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8X Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>500 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040117</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA miniprep S&#38; V kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN10200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R050A</td>
			<td>250 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Shaking platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LSI-3016A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 14 software</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td></td>
			<td>For dose-response curve generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine B powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1402-5G</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green master mix</td>
			<td>Smobio</td>
			<td>TQ12001805401-3</td>
			<td>Binding fluorescent dye for dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td>25,000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>200 reactions, no AmpErase UNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan miR RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C and 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>For amplification of DNA (or cDNA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine regulatorische RNAs, die anerkannt sind, um zahlreiche intrazelluläre Signalwege bei mehreren Krankheiten, einschließlich Krebserkrankungen, zu modulieren. Diese kleinen regulatorischen RNAs interagieren hauptsächlich mit den 3' unübersetzten Regionen (3' UTR) ihrer Zielboten-RNAs (mRNAs), was letztlich zur Hemmung von Dekodierungsprozessen von mRNAs und zur Erweiterung von Ziel-mRNA-Abbauarten führt. Basierend auf den Expressionsniveaus und intrazellulären Funktionen sind miRNAs in der Lage, als regulatorische Faktoren für onkogene und tumorsuppressive mRNAs zu dienen. Die Identifizierung von gutgläubigen Zielgenen einer miRNA unter Hunderten oder sogar Tausenden von rechnerisch vorhergesagten Zielen ist ein entscheidender Schritt, um die Rollen und grundlegenden molekularen Mechanismen einer miRNA von Interesse zu erkennen. Verschiedene miRNA-Zielvorhersageprogramme stehen zur Verfügung, um mögliche miRNA-mRNA-Interaktionen zu suchen. Die schwierigste Frage ist jedoch, wie direkte Zielgene einer miRNA von Interesse validiert werden können. Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Strategie von Schlüsselmethoden zur Identifizierung von miRNA-Zielen im Zusammenhang mit der Funktion einer miRNA. Dieses Protokoll enthält eine praktische Anleitung zu Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Aufdeckung von miRNA-Spiegeln, -Funktionen und zugehörigen Ziel-mRNAs unter Verwendung der sondenbasierten Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Sulforhodamin B (SRB)-Assay nach einer miRNA-Mimiktransfektion , Dosis-Wirkungs-Kurvengenerierung und Luziferase-Assay zusammen mit dem Klonen von 3' UTR eines Gens, das für ein richtiges Verständnis der Rollen einzelner miRNAs notwendig ist.

Eine erfolgreiche und genaue Bestätigung des miRNA-Spiegels ist wichtig für die Interpretation von Daten, durch die die Klassifizierung von miRNAs auf der Grundlage der erwarteten Rolle von miRNAs bei der Entwicklung und dem Fortschreiten einer Krankheit möglich ist. Die Konzentrationen von miRNA-107 und miRNA-301 wurden in drei Pankreaszelllinien mit der sondenbasierten quantitativen PCR gemessen. Die Synthese von cDNAs sowohl einer spezifischen miRNA als auch eines Referenzgens in derselben Reaktion kann die Reprodu...

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An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Dieses Protokoll verwendet eine sondenbasierte Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einen Sulforhodamin-B-Assay (SRB), 3' unübersetztes Klonen (3' UTR) und einen Luziferase-Assay, um die Zielgene einer miRNA von Interesse zu verifizieren und die Funktionen von miRNAs zu verstehen.

Ein In-Vitro-Protokoll zur Bewertung von MicroRNA-Spiegeln, -Funktionen und assoziierten Zielgenen in Tumorzellen

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Der Zugriff auf neuronale microRNA-Zielinteraktionen mit MicroRNA-Funktionen ist entscheidend, um zu verstehen, wie MicroRNAs verschiedene biologische Prozesse sowohl in gesunden als auch in krankheitserlichen Zuständen regulieren. Dieses Protokoll beschreibt die Reproduktion durch Strategie zur Identifizierung von microRNA-Zielen und der funktionalen microRNAs als die Validierung des direkten Ziels von microRNAs ist eine Herausforderung. Unser Protokoll kann Einblicke in die Funktion einzelner microRNAs und die Implikation einer microRNA in der Krebstherapie geben.Die Berechnung der halbmaximalen hemmenden Konzentration ist eine wichtige Methode, nicht nur für microRNA-Studien, sondern auch für die wirksame Bewertung anderer Krebsmedikamente. Unser Protokoll wird für neue Forscher hilfreich sein, da wir die grundlegende Methode beschrieben haben, um den Grad der microRNAs in einer Zelle zu verstehen. Um das Protokoll zu beginnen, zählen Sie die Zellen mit dem Zellenzähler.Die Zellen in einer 96-Well-Platte verkleben. Am nächsten Tag bereiten Sie eine Reihe von Transfektionsmischungen vor, um die Zellen in mehreren endklichen Konzentrationen von microRNA-Kontrollmimik und microRNA-107-Mimik zu transfekieren. Aus einem Bestand von 25 mikromolaren microRNA-Kontrollmimik, oder microRNA-107 mimik, verdünnen und fügen Sie Kontrollmimik oder microRNA-107 Mimik in den reduzierten Serummedien zusammen mit der Transfektion Reagenz in Mikrozentrifugenröhren.Mischen Sie die oligohaltigen Mischungen vorsichtig mit einer Mikropipette. Nach einer 10-minütigen Inkubation in der Zellkulturhaube die oligohaltigen Mischungen vorsichtig wieder mischen und dann 50 Mikroliter der Mischungen in jeden Brunnen geben. Bewahren Sie die transfizierten Zellen in einem Zellkultur-Inkubator auf.Saugen Sie vorsichtig die Zellkulturmedien in jedem Brunnen der Platte und füllen Sie sofort 100 Mikroliter 10%trichloresessäure, oder TCA, in jeden Brunnen. Halten Sie die Platte mit 10% TCA bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Als nächstes waschen Sie die Platte mehrmals, indem Sie sie in eine Wanne mit Leitungswasser tauchen.Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Inneren der Brunnen, indem Sie die Platte anzapfen, bis kein Wasser mehr vorhanden ist, und trocknen Sie die Platte. Pipette 50 Mikroliter 0,4%SRB Lösung in jeden Brunnen einschließlich der leeren Brunnen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, bis die 0,4%SRB-Lösung den Boden der Brunnen gleichmäßig abdeckt.Dann inkubieren Sie die Platte für 40 bis 60 Minuten. Nach der Inkubation die Platte mit 1%essigsäure waschen, bis der ungebundene Farbstoff vollständig weggespült wird. Pipette 100 Mikroliter 10 Millimolar Tris Basislösung in die entsprechenden Brunnen, einschließlich Leerbrunnen.Halten Sie die Platte 10 Minuten auf einem Shaker. Messen Sie die Absorption bei 492 Nanometern. Berechnen Sie den Prozentsatz der durchschnittlichen Absorption und die Standardabweichung jeder Gruppe unter Verwendung der Absorptionswerte des SRB-Assays.Importieren Sie die Rohdaten einschließlich Behandlungskonzentrationen, durchschnittlicher Absorption und Standardabweichung in die Software, indem Sie die Daten vertikal ausrichten. Klicken Sie auf die Registerkarte Diagramm erstellen, und wählen Sie die einfachen Streuungsfehlerleisten aus. Wählen Sie Arbeitsblattspalten als Symbolwerte aus, und klicken Sie auf Weiter.Wählen Sie im Datenformat-Bedienfeld X-Y-Paare aus, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie entsprechende Datenspalten im Bedienfeld Daten auswählen aus. Klicken Sie auf Fertigteil, um das Diagramm zu erstellen.Doppelklicken Sie auf die X-Achse, um den Maßstabstyp in der Skalierung der Achse zu ändern. Ändern Sie den Maßstabstyp von linear in protokollieren. Ändern Sie die Start- und Endbereichsnummer auf 0,01 bzw. 200.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein beliebiges Streudiagramm, wählen Sie Kurvenanpassung aus, und wechseln Sie zur Unterkategorie Benutzerdefiniert. Wählen Sie die Dosis-Antwort-Kurve aus. Klicken Sie auf die nächsten Schaltflächen, und klicken Sie dann auf Fertig stellen.Wechseln Sie zur Registerkarte Bericht, und überprüfen Sie dann die N-, K- und R-Werte. Führen Sie die PCR wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben aus. Dann gehen Sie zur Doppeltenverdauung durch die Kombination der Reaktionsmischungen, einschließlich der Restriktionsenzyme Exo1 und Not1 eins in einer Röhre.Inkubieren Sie die Mischungen für drei bis vier Stunden in einem 37 Grad Celsius Wasserbad. Führen Sie die doppelt verdaulichen Produkte auf einem 1%Agarose-Gel aus. Dann schneiden Sie die Bänder unter UV-Licht.Reinigen Sie die doppelt verdaulichen PCR-Produkte und Luziferase-Vektoren aus den ausgeschnittenen Bändern. Fahren Sie mit der Ligation der PCR-Produkte in die Luziferase-Vektoren fort, indem Sie 20 Mikroliter Ligationsreaktionsmischungen einschließlich der DNA-Ligase vorbereiten. Das Rohr 10 bis 15 Sekunden lang kurz zentrieren.Inkubieren Sie die Ligation bei 16 Grad Celsius über Nacht mit einem thermischen Cycler. Führen Sie am nächsten Tag die Transformation durch, indem Sie die Ligationsmischungen in das Rohr mit kompetenten Zellen einfügen. Tippen Sie vorsichtig auf die Röhre und halten Sie sie 20 Minuten auf Eis.Übertragen Sie das Rohr schnell und vorsichtig auf einen Wärmeblock bei 42 Grad Celsius für 30 Sekunden bis eine Minute. Nach einem Hitzeschock 20 Minuten lang die Röhre auf Eis legen. Verteilen Sie kompetente Zellen auf einer LB-Agarplatte.Wachsen Sie kompetente Zellen in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag wählen Sie eine einzelne Kolonie und setzen E.coli in einem der 8-Streifen-Rohre mit Reinstwasser wieder aus, und wiederholen Sie diesen Schritt, um E.coli von vier auf acht zufällig ausgewählte Kolonien zu suspendieren. 25 Mikroliter E.coli Suspension in einen anderen Satz 8-Band-Röhren übertragen.Führen Sie die Kolonie PCR mit der E.coli Suspension durch. Bereiten Sie die luziferase Assay in einem 24 Brunnen Platte. Fügen Sie ein bis zwei mal zehn zu den vier Zellen in einem 500 Mikroliter-Zellkulturmedium für jeden Brunnen hinzu.Nach der nächtlichen Inkubation transfezieren Sie 50 Nanogramm Luziferase-Vektoren mit Kontrollmimik oder einer spezifischen microRNA-Mimik mit einem Transfektionsreagenz in die Zellen. Am nächsten Tag das Innere der Brunnen zweimal mit Phosphat gepufferter Saline waschen. Tragen Sie 200 Mikroliter Lysereagenz in die Brunnen auf und führen Sie die Zelllyse ausreichend durch, bevor Sie die Luziferaseaktivität messen.Halten Sie die Platte mindestens 15 Minuten schütteln. Fünf bis zehn Mikroliter Zelllysat in das neue Rohr geben, 100 Mikroliter Reagenz eins hinzufügen und die Lösung sofort durch Pipettieren mischen. Dann lesen Sie die Galleife-Aktivität mit Illuminometer für 10 bis 15 Sekunden.Fügen Sie 100 Mikroliter Reagenz zwei in der gleichen Röhre und dann mischen durch Pipettieren zweimal. Schließlich lesen Sie die Renilla-Luziferase-Aktivität für 10 bis 15 Sekunden mit Deminometer. RTPCR zeigt eine signifikante Reduktion von microRNA-107 und PANC-1 und CAPAN-1 Zellen im Vergleich zu HPNE-Zellen.Die Konzentrationen von microRNA-301 wurden in PANC-1- und CAPAN-1-Zellen im Vergleich zu HPNE-Zellen signifikant hochreguliert. Der SRB-Assay in dieser Studie zeigt deutlich, dass die Proliferation von PANC-1-Zellen nach einer mikroRNA-107-Mimiktransfektion abnahm. Das Screening von 11 potentiellen vorhergesagten Zielen von microRNA-107 zeigt deutlich, dass nur Synuclein-Gamma oder SNCG, ein positiver Regulator des Tumorzellwachstums, direkt mit microRNA-107- und PANC-1-Zellen interagiert, was darauf hindeutet, dass microRNA-107 die Proliferation von PANC-1-Zellen negativ regulieren kann, indem die SNCG-Expression moduliert wird.Adult cell proliferation assays, die die Tetrahydroleum-basierte Einheit und CFSE verwenden, sind anwendbar, um die Wirkung von wie microRNA Mimiks zu überprüfen, abhängig von den Zelltypen. Basierend auf der experimentell validierten Funktion von microRNAs ist eine systematische Überprüfung des Datenbank- und Zielvorhersageprogramms erforderlich, um die Liste der Kandidatenziele vor Luziferase-Assays einzugrenzen. Für die Bewertung der Kombinationseffizienz von microRNAs mit Krebsmedikamenten ist es vorteilhaft, angepasste IC-Werte auf Basis unseres Protokolls zur Bewertung des Kombinationsindex zu berechnen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Forschung

Genetik

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Transiente Expression von Fremdgenen in Insekt Zellen (sf9) für funktionelle Protein Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...