Name: an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית בסיסית מחקר המדע באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1D1A3B03035662); הקרן לחקר האוניברסיטה, 2017 (HRF-201703-003).

1. ניתוח ביטוי מיקרו-מיקרוארנה (מירנא)
<ol><li>
בוגרת DNA משלימה (cDNA) סינתזה
	<ol>
<li>להוסיף 254 ng בסך הכל RNA ו 4.5 μl של deoxyribonuclease אני (dnase i) תערובות, ולאחר מכן להוסיף מים אלקטרופורזה ל-PCR רצועת צינורות לפצות עד 18 μl (איור 2a). הכן את התגובה עבור כל מדגם RNA הכולל מטוהרים ממספר קווי תאי?...

<ol>
	<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells.">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs-103/107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy.">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li><li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis.">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li><li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs,+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells.">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li><li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+miR-155/FOXO3a+and+miR-222/PTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line.">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3.">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li><li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+miR-107,+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+(pHGGs).">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li><li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunting+of+targets:+challenge+in+miRNA+research.">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li><li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis:+not+all+kits+are+created+equal.">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents,+5-Aza-CdR+and+FK228,+in+Human+Gastric+Cancer+Cells.">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN.">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer.">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li><li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+(MTT)+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays.">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47 (2015).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202 (2010).</li><li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+me+count+the+ways:+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs.">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li><li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay.">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation.">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li><li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways.">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li><li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches.">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer.">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li><li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets.">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li><li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression.">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li><li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+B+(SRB)+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation.">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li><li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+hematological+malignancies.">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+anticancer+drugs.">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li><li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide.">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method.">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li><li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing.">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li></ol>

אסטרטגיות לקביעת מטרות miRNA בתום ובלבד עם פונקציות של מירנה של עניין הם חיוניים להבנת תפקידים מרובים של Mirna. זיהוי של גנים היעד miRNA יכול להיות מנחה לפענוח התא איתות אירועים מאופנן על ידי Mirna בתא. החשיפה של גנים מטרה חשובה מבחינה פונקציונלית של miRNAs יכול לספק את הידע הבסיסי לפתח טיפול מבוססי Mirna...

MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs הרגולציה קטן כי בעיקר לווסת את תהליך התרגום והשפלה של RNAs שליח (mRNAs) על ידי התגובה ל 3 ' אזורים לא מתורגם (3 ' UTR) בתום היעד לאחד גנים1. ביטוי של miRNAs יכול להיות מוסדר על ידי מנגנונים שלאחר ההמרה. חוסר האיזון של מנגנונים כגון מביא בלתי מבוקרת וייחודית רמות הביטוי miRNAs במחלות רבות כולל סרטן2. ל-miRNA אחת יכול להיות מספר אינטראקציות עם mRNAs מגוונות. בהתאמה, mRNA הפרט יכול להיות נשלט על ידי miRNAs שונים. לכן, רשתות איתות תאיים מושפע באופן מסובכת על ידי ביטוי באופן מתבטא על ידי הפרעות פיסיולוגיים ומחלות ניתן ליזום והידרדר2,3,4, מיכל 5 , 6. למרות הביטוי השונה של mirnas נצפתה סוגים שונים של סרטן, המנגנונים המולקולריים לווסת את הנימוסים של תאים סרטניים בשילוב עם mirnas עדיין לא ידוע ברובו.
צבירת ראיות הראה כי התפקידים אונגניים או מדכאים הגידול של miRNAs תלוי בסוגי סרטן. לדוגמה, על-ידי פילוח forkhead box o3 (FOXO3), מיר-155 מקדם את התפשטות התא, גרורות, ו-cheמורשת של סרטן המעי הגס7,8. לעומת זאת, ההגבלה של הפלישה התאים glioma נגרמת על ידי מיר-107 באמצעות התקנה של חלבון מקור נוירוגניים הומולוג 2 (NOTCH2) ביטוי9. הערכה של האינטראקציות miRNA-target בקשר עם פונקציות miRNA הוא חלק הכרחי כדי להבין טוב יותר כיצד Mirna לווסת תהליכים ביולוגיים שונים במדינות בריאות וחולה10. בנוסף, הגילוי של היעד בתום האדם (s) של miRNAs יכול עוד לספק אסטרטגיה מכוון עדין עבור טיפול מבוסס Mirnas עם תרופות נגד סרטן שונים. עם זאת, האתגר העיקרי בתחום של miRNAs הוא זיהוי של יעדים ישירים של miRNAs. כאן, שיטות מפורטות מוצגים כגישות ניסיוני לצורך הגדרה גנטית היעד miRNA. תכנון ניסיוני מוצלח עבור זיהוי יעד miRNA כרוך בשלבים שונים ושיקולים (איור 1). השוואה של רמות miRNA בוגרת בתאי הגידול תאים נורמליים יכול להיות אחד ההליכים השכיחים כדי לבחור miRNA עניין (איור 1A). המחקר הפונקציונלי של miRNA שנבחרו כדי לזהות את ההשפעות של miRNA על התפשטות התא חשוב לצמצם את רשימת המטרות המועמדים הפוטנציאליים הטובים ביותר של miRNA עניין (איור 1B). מבוסס על פונקציות מאומת הניסויים של miRNAs, סקירה שיטתית של ספרות ומסד נתונים בחברה עם תוכנית חיזוי יעד Mirnas נדרש כדי לחפש את המידע הרלוונטי ביותר על פונקציות גן (איור 1C). הזיהוי של גנים היעד האמיתי של mirna העניין יכול להיות מושגת על ידי יישום ניסויים כגון שיטת ללוציפראז יחד עם שיבוט של 3 ' utr של גן, PCR בזמן אמת, ו בלוק מערבי (איור 1d). המטרה של הפרוטוקול הנוכחי היא לספק שיטות מקיפות של ניסויים מרכזיים, את תגובת שרשרת פולימראז מבוסס בזמן אמת (PCR), sulforhodamine B (SRB) שיטה בעקבות מחקים miRNA מחקה, מינון תגובה הדור עקומת, ו שיטת לוציפראז יחד עם שיבוט של 3 UTR של גן. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות שימושי להבנה טובה יותר של הפונקציות של miRNAs בודדים ואת המשמעות של Mirnas בטיפול בסרטן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading dye</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>RD006</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-cap strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010535</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010580</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-1L</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose A</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bio basic Canada Inc</td>
			<td>AB0028</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx 96 tube strips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401493</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx real-time PCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G8830A</td>
			<td>qPCR amplification, detection, and data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsiSI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0630</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPAN-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LCB-1203B-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chambers with V-slash</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>650010</td>
			<td>Cells counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>10X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN30200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NIPPON Genetics EUROPE</td>
			<td>MWD1</td>
			<td>1 Kb ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>100 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>100 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIT competent cells</td>
			<td>Real Biotech Corporation(RBC)</td>
			<td>RH617</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPNE cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar broth</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD7003</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>Model: E5311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Infinite F50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA control mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464058</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-107 mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464066</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>50 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus (electrophoresis system)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td></td>
			<td>Model: AD110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo explorer program</td>
			<td>GeneLink</td>
			<td></td>
			<td>For primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8X Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>500 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040117</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA miniprep S&#38; V kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN10200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R050A</td>
			<td>250 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Shaking platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LSI-3016A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 14 software</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td></td>
			<td>For dose-response curve generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine B powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1402-5G</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green master mix</td>
			<td>Smobio</td>
			<td>TQ12001805401-3</td>
			<td>Binding fluorescent dye for dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td>25,000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>200 reactions, no AmpErase UNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan miR RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C and 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>For amplification of DNA (or cDNA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells

MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs הרגולציה קטנים אשר מזוהים לווסת מסלולים מסוימים של איתות תאיים במספר מחלות כולל סרטן. אלה RNAs הרגולציה קטנים בעיקר אינטראקציה עם 3 ' אזורים לא מתורגם (3 ' UTR) של שליח היעד שלהם RNAs (mRNAs) בסופו של דבר וכתוצאה מכך עיכוב תהליכי פענוח של mRNAs ואת הגדלת Mrnas היעד degradations. בהתבסס על רמות הביטוי ופונקציות תאיים, miRNAs מסוגלים לשמש גורמי רגולציה של mRNAs ומדכאים הגידול המדכא. זיהוי של גנים היעד בתום המטרה של miRNA בין מאות או אפילו אלפי מטרות חזוי מבחינה חישובית הוא צעד מכריע כדי להבחין את התפקידים ומנגנונים מולקולאריים בסיסיים של מירנה של עניין. תוכניות מסוימות לחיזוי היעד miRNA זמינים כדי לחפש אינטראקציות miRNA-mRNA אפשרי. עם זאת, השאלה המאתגרים ביותר היא כיצד לאמת גנים מטרה ישירה של miRNA עניין. פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה הניתן לפונקציה של שיטות מפתח כיצד לזהות יעדי miRNA הקשורים לפונקציה miRNA. פרוטוקול זה מציג מדריך מעשי על הליכים צעד אחר צעד כדי לחשוף רמות miRNA, פונקציות, ו-mRNAs הקשורות היעד באמצעות הבדיקה מבוסס בזמן אמת התגובה שרשרת פולימראז (PCR), sulforhodamine B (SRB) שיטת בעקבות מחקה מחקים העברה , מינון התגובה עקומת הדור, ושיטת לוציפראז יחד עם שיבוט של 3 ' UTR של גן, אשר הכרחי להבנה נכונה של התפקידים של miRNAs בודדים.

אישור מוצלח ומדויק של רמות miRNA חשוב לפרשנות של הנתונים שבהם הסיווג של Mirna אפשרי מבוסס על התפקידים הצפויים של Mirna בפיתוח והתקדמות של מחלה. רמות של miRNA-107 ו miRNA-301 נמדדו שלושה קווי התא הלבלב באמצעות ה-PCR כמותי המבוסס על בדיקה. סינתזה של cDNAs הן של miRNA ספציפית ו גן התייחסות באותה תגובה יכולה להגביר את...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ' אזורים לא מתורגמים (3 ' UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

כדי לגשת אינטראקציות יעד microRNA עצבי עם פונקציות MicroRNA הוא קריטי כדי להבין כיצד MicroRNAs לווסת תהליכים ביולוגיים שונים במצבים בריאים וחלים. פרוטוקול זה מתאר את ההתרבות באמצעות אסטרטגיה לזיהוי מטרות microRNA ואת microRNAs פונקציונלי כמו אימות של יעד ישיר של microRNAs הוא מאתגר. הפרוטוקול שלנו יכול לספק תובנות על הפונקציה של microRNAs בודדים ואת המשמעות של microRNA בטיפול בסרטן.חישוב הריכוז המעכב החצי-מקסימלי הוא שיטה חשובה, לא רק למחקרי microRNA אלא להערכה יעילה של תרופות אחרות נגד סרטן. הפרוטוקול שלנו יהיה מועיל לחוקרים חדשים מאז שתיארנו את השיטה הבסיסית כדי להבין את רמת microRNAs בתא. כדי להתחיל את הפרוטוקול, ספור את התאים באמצעות מונה התאים.צלחת התאים בצלחת 96 היטב. למחרת, להכין קבוצה של תערובות transfection כדי לשנות את התאים בכמה ריכוזים סופיים של חיקוי בקרת microRNA, ו microRNA-107 לחקות. מתוך מלאי של חיקוי בקרת מיקרו-רנ"א של 25 מיקרומולריים, או מיקרו-רנ"א-107 מחקים, מדללים ומוסיפים חיקוי בקרה או מיקרו-רנ"א-107 במדיה המופחתת בסרום יחד עם הריג'נט השקוף בצינורות מיקרוצנטריפוגה.מערבבים בעדינות את תערובות האוליגו המכילות באמצעות מיקרופיגט. לאחר דגירה של 10 דקות במכסה המנוע של תא התרבות, מערבבים בעדינות את תערובות המכילות אוליגו שוב, ולאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובות לתוך כל באר. שמור את התאים המרובים באינקובטור של תרבות התאים.בזהירות שאפו את מדיית תרבות התאים בכל באר של הצלחת ומלאו מיד 100 מיקרוליטרים של 10% חומצה טריכלורואצטית, או TCA, בכל באר. שמור את הצלחת המכילה 10% TCA בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת מספר פעמים על ידי שקוע אותו לתוך אמבטיה עם מי ברז.הסר מים עודפים מתוך בארות על ידי הקשה על הצלחת עד שלא נשארו מים, וייבש את הצלחת. פיפטה 50 מיקרוליטרים של 0.4% פתרון SRB לתוך כל באר כולל בארות ריקות. מנערים בעדינות את הצלחת עד שפתרון ה-SRB של 0.4% מכסה באופן שווה את תחתית בארות.לאחר מכן, לה הדגירה את הצלחת במשך 40 עד 60 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת עם 1% חומצה אצטית עד הצבע מאוגד נשטף לחלוטין. פיפטה 100 microliters של 10 מילימולר טריס בסיס פתרון לתוך בארות המתאימות, כולל בארות ריקות.שמור את הצלחת על שייקר במשך 10 דקות. למדוד את הספיגה ב 492 ננומטר. חשב את אחוז הספיגה הממוצעת ואת סטיית התקן של כל קבוצה באמצעות ערכי ספיגה של מקשה SRB.יבא את הנתונים הגולמיים כולל ריכוזי טיפול, ספיגה ממוצעת וסטיית תקן לתוכנה על-ידי יישור אנכי של הנתונים. לחצו על הכרטיסייה 'יצירת תרשים' ובחרו בפסי שגיאה פשוטים של פיזור. בחר עמודות גליון עבודה כערכי סימנים ולחץ על הבא.בחלונית 'תבנית נתונים', בחרו זוגות X-Y ולחצו על הלחצן 'הבא'. בחרו בעמודות נתונים תואמות בחלונית 'בחירת נתונים'. לחץ על סיום כדי ליצור את ההתוויה.לחץ פעמיים על ציר ה- X כדי לשנות את סוג קנה המידה בשינוי קנה המידה של הציר. שנה את סוג קנה המידה מליניארי ליומן רישום. שנה את מספר טווח ההתחלה והסיום ל- 0.01 ו- 200, בהתאמה.לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על חלקת פיזור כלשהי, בחר התאמה לעקומה ולעבור אל קטגוריית המשנה המוגדרת על-ידי המשתמש. בחר עקומת תגובת מינון. לחץ על הלחצנים הבאים ולאחר מכן לחץ על סיום.עבור אל כרטיסיית הדוח ולאחר מכן בדוק את הערכים n, k ו- R. הפעל את ה- PCR כמפורט בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן לעבור לעיכול כפול על ידי שילוב תערובות התגובה, כולל אנזימי ההגבלה Exo1 ו Not1 אחד בצינור.הדגירה את תערובות במשך שלוש עד ארבע שעות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הפעל את המוצרים המתעכלים הכפולים על ג'ל 1%agarose. ואז לחתוך את הרצועות תחת אור UV.לטהר את מוצרי PCR מתעכל פעמיים וקטורים luciferase מן הרצועות excised. המשך עם קשירה של מוצרי PCR לתוך וקטורים luciferase על ידי הכנת 20 microliters של תערובות תגובת קשירה כולל קשירה DNA. בקצרה צנטריפוגה הצינור במשך 10 עד 15 שניות.הדגירה את הרצועה ב 16 מעלות צלזיוס לילה באמצעות מחזור תרמי. למחרת, לבצע טרנספורמציה על ידי הוספת תערובות קשירה לתוך הצינור המכיל תאים מוסמכים. יש להקיש בעדינות על הצינור ולשמור אותו על קרח למשך 20 דקות.מעבירים במהירות ובעדינות את הצינור לבלוק חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד דקה. לאחר הלם חום, מניחים את הצינור על קרח במשך 20 דקות. להפיץ תאים מוכשרים על צלחת אגר LB.לגדל תאים מוכשרים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, בחר מושבה בודדת והחזר את E.coli באחד מצינורות 8 הרצועות המכילים מים אולטרה-חמים, וחזור על צעד זה כדי למחזר את E.coli מארבע עד שמונה מושבות שנבחרו באקראי. העבר 25 מיקרוליטרים של השעיית E.coli לקבוצה אחרת של צינורות 8 רצועות.בצע את PCR המושבה באמצעות ההשעיה E.coli. הכינו את התדהים של לוציפראז בצלחת של 24 בארות. הוסף אחד עד פעמיים עשר לארבעת התאים במדיה של 500 מיקרוליטר לתרבות תאים עבור כל באר.לאחר הדגירה במהלך הלילה, יש להעיף 50 ננוגרם של וקטורים של לוציפראז לתאים עם חיקוי בקרה או חיקוי מיקרו-רנ"א ספציפי באמצעות רגנט טרנספרקט. למחרת, לשטוף את החלק הפנימי של הבאר פעמיים באמצעות מלוחים אגף פוספט. החל 200 microliters של ריאגנט תזה לתוך הבארים מספיק לבצע תזה התא לפני מדידת פעילות לוציפראז.שמור על הצלחת רועדת לפחות 15 דקות. מעבירים חמישה עד 10 מיקרוליטרים של lysate התא לתוך הצינור החדש, ולהוסיף 100 microliters של reagent אחד ומיד לערבב את הפתרון על ידי צינור. לאחר מכן לקרוא את פעילות לוציפראז גחלילית באמצעות אילומינומטר במשך 10 עד 15 שניות.מוסיפים 100 מיקרוליטרים של רגנט 2 באותו צינור ואז מערבבים על ידי צינור פעמיים. לבסוף, לקרוא את פעילות רנילה לוציפראז במשך 10 עד 15 שניות באמצעות illuminometer. RTPCR מציג הפחתה משמעותית של תאי מיקרו-רנ"א-107 ו-PANC-1 ו-CAPAN-1 בהשוואה לתאי HPNE.רמות המיקרו-רנ"א-301 עלו באופן משמעותי בתאי PANC-1 ו-CAPAN-1, בהשוואה לתאי HPNE. בדיקה SRB במחקר זה מראה בבירור כי התפשטות של תאים PANC-1 ירד בעקבות microRNA-107 לחקות transfection. ההקרנה של 11 יעדים חזויים פוטנציאליים של microRNA-107 מראה בבירור כי רק גמא סינוקלין, או SNCG, וסת חיובי של צמיחת תאים סרטניים אינטראקציה ישירה עם microRNA-107 ו PANC-1 תאים, המציין כי microRNA-107 יכול לווסת לרעה את התפשטות תאי PANC-1 על ידי ויסות הביטוי SNCG.בדיקות התפשטות תאים למבוגרים המשתמשות בישות המבוססת על טטרה הידרוליאום ו- CFSE ישימות כדי לסנן את ההשפעה של כגון חיקויי microRNA, בהתאם לסוגי התאים. בהתבסס על הפונקציה המותאמת באופן ניסיוני של microRNAs, נדרשת סקירה שיטתית של מסדי נתונים ותוכנית חיזוי יעדים כדי לצמצם את רשימת היעדים המועמדים לפני בדיקות Luciferase. להערכת יעילות שילוב של microRNAs עם תרופות נגד סרטן, זה יתרון לחשב ערכי IC מותאמים המבוססים על הפרוטוקול שלנו להערכת מדד שילוב.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

משלוח מערכתית של MicroRNA באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-הקשורים Serotype 9 לטיפול מחלות נוירומוסקולריות אצל מכרסמים

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...