Name: an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

इस अध्ययन कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) शिक्षा मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित के माध्यम से बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (2017R1D1A3B03035662); और हालिम विश्वविद्यालय अनुसंधान कोष, 2017 (एचआरएफ-201703-003)।

1. परिपक्व MicroRNA (miRNA) अभिव्यक्ति विश्लेषण
<ol><li>
परिपक्व miRNA पूरक डीएनए (cDNA) संश्लेषण
	<ol>
<li>कुल आरएनए के 254 एनजी और deoxyribonuclease I (DNase I) मिश्रण के 254 एनजी जोड़ें, और फिर पीसीआर स्ट्रिप-ट्यूब में अल्ट्राप्यूरे पानी जोड़?...

<ol>
	<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells.">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs-103/107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy.">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li><li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis.">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li><li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs,+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells.">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li><li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+miR-155/FOXO3a+and+miR-222/PTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line.">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3.">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li><li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+miR-107,+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+(pHGGs).">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li><li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunting+of+targets:+challenge+in+miRNA+research.">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li><li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis:+not+all+kits+are+created+equal.">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents,+5-Aza-CdR+and+FK228,+in+Human+Gastric+Cancer+Cells.">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN.">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer.">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li><li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+(MTT)+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays.">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47 (2015).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202 (2010).</li><li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+me+count+the+ways:+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs.">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li><li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay.">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation.">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li><li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways.">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li><li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches.">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer.">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li><li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets.">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li><li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression.">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li><li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+B+(SRB)+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation.">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li><li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+hematological+malignancies.">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+anticancer+drugs.">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li><li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide.">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method.">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li><li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing.">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li></ol>

ब्याज की एक miRNA के कार्यों के साथ सदाशयी miRNA लक्ष्यों के निर्धारण के लिए रणनीतियाँ miRNAs की कई भूमिकाओं की समझ के लिए अपरिहार्य हैं. miRNA लक्ष्य जीन की पहचान एक सेल में miRNAs द्वारा संग्राहक सेल संकेतन घटनाओं की व्?...

MicroRNAs (miRNAs) छोटे नियामक RNAs है कि मुख्य रूप से अनुवाद और दूत RNAs (mRNAs) की गिरावट की प्रक्रिया को संजोना कर रहे हैं 3' untranslated क्षेत्रों (3' UTR) सदाशयी लक्ष्य जीन1में प्रतिक्रिया द्वारा. miRNAs की अभिव्यक्ति प्रतिलेखन और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र द्वारा विनियमित किया जा सकता है। इस तरह के विनियामक तंत्रों के असंतुलन से कैंसर2सहित अनेक रोगों में अनियंत्रित और विशिष्ट मिराना अभिव्यक्ति का स्तर उत्पन्न होता है . एक एकल miRNA विविध mRNAs के साथ कई बातचीत हो सकती है. संगत, एक व्यक्ति MRNA विभिन्न mirnaद्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. अतः इंट्रासेल्यूलर संकेतन नेटवर्क विशिष्ट रूप से व्यक्त मिराना से जटिल रूप से प्रभावित होते हैं जिसके द्वारा शारीरिक विकारों और रोगों को आरंभ किया जा सकता है और2,3,4, 5 , 6.यद्यपि मिरानए की परिवर्तित अभिव्यक्ति विभिन्न प्रकार के कैंसरों में देखी गई है, फिर भी मिर्नेस के साथ संयोजन के रूप में कैंसर कोशिकाओं के शिष्टाचार को परिवर्तित करने वाले आणविक तंत्र अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं।
एकत्र सबूत दिखा रहा है कि miRNAs के oncogenic या ट्यूमर-संपीड़ित भूमिकाओं कैंसर के प्रकार पर निर्भर करते हैं. उदाहरण के लिए, फोर्कहेड बॉक्स ओ 3 (FOXO3) को लक्षित करके, miR-155 कोशिका प्रसार,मेटास्टेसिस, और कोलोरेक्टल कैंसर 7,8के chemoresistance को बढ़ावा देता है। इसके विपरीत, ग्लियोमा सेल आक्रमण के प्रतिबंध neurogenic टिड्डी पायदान homolog प्रोटीन 2 (NOTCH2) अभिव्यक्ति9के विनियमन के माध्यम से miR-107 द्वारा प्रेरित है। miRNA कार्यों के संबंध में miRNA-लक्ष्य बातचीत का मूल्यांकन बेहतर समझने के लिए एक अनिवार्य हिस्सा है कि कैसे miRNAs दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित10. इसके अलावा, miRNAs के सदाशयी लक्ष्य (ओं) की खोज आगे विभिन्न विरोधी कैंसर दवाओं के साथ एक miRNA आधारित चिकित्सा के लिए एक ठीक tuned रणनीति प्रदान कर सकते हैं. तथापि, मिरानए के क्षेत्र में मुख्य चुनौती मिरानए के प्रत्यक्ष लक्ष्यों की पहचान है। यहाँ, विस्तृत तरीकों miRNA लक्ष्य जीन निर्धारण के लिए reproduible प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. मिर्ना लक्ष्य पहचान के लिए सफल प्रायोगिक डिजाइन में विभिन्न चरण और विचार शामिल हैं (चित्र 1)। ट्यूमर कोशिकाओं और सामान्य कोशिकाओं में परिपक्व miRNA स्तर की तुलना ब्याज की एक miRNA का चयन करने के लिए आम प्रक्रियाओं में से एक हो सकता है (चित्र 1A) . सेल प्रसार पर एक miRNA के प्रभाव का पता लगाने के लिए एक चयनित miRNA के कार्यात्मक अध्ययन के लिए ब्याज की एक miRNA के सर्वश्रेष्ठ संभावित उम्मीदवार लक्ष्यों की सूची को संकीर्ण करने के लिए महत्वपूर्ण है (चित्र 1B) . miRNAs के प्रायोगिक रूप से मान्य कार्यों के आधार पर, एक miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी कार्यक्रम के साथ कंपनी में साहित्य और डेटाबेस की एक व्यवस्थित समीक्षा जीन कार्यों पर सबसे अधिक प्रासंगिक जानकारी खोज करने के लिए आवश्यक है (चित्र 1C)। ब्याज की एक miRNA के वास्तविक लक्ष्य जीन की पहचान इस तरह के एक जीन की 3 'UTR की क्लोनिंग के साथ luciferase परख के रूप में प्रयोगों को लागू करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, वास्तविक समय पीसीआर, और पश्चिमी सोख्ता (चित्र 1D)। वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य प्रमुख प्रयोगों के व्यापक तरीकों प्रदान करने के लिए है, जांच आधारित वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर), sulforhodamine बी (एसआरबी) परख एक miRNA नकल transfection के बाद, खुराक प्रतिक्रिया वक्र पीढ़ी, और एक जीन के 3 ' UTR की क्लोनिंग के साथ luciferase परख. वर्तमान प्रोटोकॉल व्यक्तिगत miRNAs के कार्यों की एक बेहतर समझ और कैंसर चिकित्सा में एक miRNA के निहितार्थ के लिए उपयोगी हो सकता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading dye</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>RD006</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-cap strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010535</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010580</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-1L</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose A</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bio basic Canada Inc</td>
			<td>AB0028</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx 96 tube strips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401493</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx real-time PCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G8830A</td>
			<td>qPCR amplification, detection, and data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsiSI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0630</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPAN-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LCB-1203B-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chambers with V-slash</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>650010</td>
			<td>Cells counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>10X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN30200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NIPPON Genetics EUROPE</td>
			<td>MWD1</td>
			<td>1 Kb ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>100 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>100 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIT competent cells</td>
			<td>Real Biotech Corporation(RBC)</td>
			<td>RH617</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPNE cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar broth</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD7003</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>Model: E5311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Infinite F50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA control mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464058</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-107 mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464066</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>50 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus (electrophoresis system)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td></td>
			<td>Model: AD110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo explorer program</td>
			<td>GeneLink</td>
			<td></td>
			<td>For primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8X Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>500 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040117</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA miniprep S&#38; V kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN10200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R050A</td>
			<td>250 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Shaking platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LSI-3016A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 14 software</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td></td>
			<td>For dose-response curve generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine B powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1402-5G</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green master mix</td>
			<td>Smobio</td>
			<td>TQ12001805401-3</td>
			<td>Binding fluorescent dye for dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td>25,000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>200 reactions, no AmpErase UNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan miR RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C and 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>For amplification of DNA (or cDNA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells

MicroRNAs (miRNAs) छोटे नियामक आरएनए जो कैंसर सहित कई रोगों में कई intracellular संकेतन रास्ते मोड्यूल करने के लिए मान्यता प्राप्त कर रहे हैं. इन छोटे विनियामक आरएनए मुख्य रूप से अपने लक्ष्य दूत आरएनए (एमआरएनए) के 3' untranslated क्षेत्रों (3' UTR) के साथ बातचीत अंततः MRNAs की डिकोडिंग प्रक्रियाओं के अवरोध और लक्ष्य MRNA अवक्रमण के संवर्धन में जिसके परिणामस्वरूप. अभिव्यक्ति के स्तर और intracellular कार्यों के आधार पर, miRNAs oncogenic और ट्यूमर-suppressive mRNAs के नियामक कारकों के रूप में सेवा करने में सक्षम हैं. सैकड़ों या यहां तक कि गणना की भविष्यवाणी लक्ष्य के हजारों के बीच एक miRNA के सदाशयी लक्ष्य जीन की पहचान भूमिकाओं और ब्याज की एक miRNA के बुनियादी आणविक तंत्र विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. विभिन्न miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी कार्यक्रम संभव miRNA-mrNA बातचीत खोज करने के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, सबसे चुनौतीपूर्ण सवाल यह है कि कैसे ब्याज की एक miRNA के प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन को मान्य करने के लिए. यह प्रोटोकॉल miRNA के कार्य से संबंधित miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के तरीके पर महत्वपूर्ण विधियों की एक पुन: उत्पादनीय रणनीति का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल जांच आधारित वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर), sulforhodamine बी (एसआरबी) एक miRNA नकल transfection के बाद का उपयोग कर miRNA स्तर, कार्यों, और संबंधित लक्ष्य mRNAs को उजागर करने के लिए कदम दर कदम प्रक्रियाओं पर एक व्यावहारिक गाइड प्रस्तुत करता है , खुराक प्रतिक्रिया वक्र पीढ़ी, और luciferase परख एक जीन के 3 ' UTR की क्लोनिंग के साथ, जो व्यक्तिगत miRNAs की भूमिकाओं की उचित समझ के लिए आवश्यक है.

miRNA स्तर के सफल और सटीक पुष्टि डेटा जिसके द्वारा miRNAs का वर्गीकरण विकास और एक रोग की प्रगति में miRNAs की प्रत्याशित भूमिकाओं के आधार पर संभव है की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है. MIRNA-107 और miRNA-301 के स्तर जांच आधारित म?...

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An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

इस प्रोटोकॉल एक जांच आधारित वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर), एक sulforhodamine बी (एसआरबी) परख, 3' untranslated क्षेत्रों (3' UTR) क्लोनिंग का उपयोग करता है, और एक luciferase परख ब्याज की एक miRNA के लक्ष्य जीन को सत्यापित करने के लिए और mirnas के कार्यों को समझने के लिए.

ट्यूमर कोशिकाओं में MicroRNA स्तर, कार्यों, और एसोसिएटेड लक्ष्य जीन का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो प्रोटोकॉल

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

माइक्रोआरएनए कार्यों के साथ तंत्रिका माइक्रोआरएनए लक्ष्य बातचीत तक पहुंचने के लिए यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि माइक्रोआरएनए स्वस्थ और रोगग्रस्त दोनों राज्यों में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को कैसे विनियमित करता है। यह प्रोटोकॉल माइक्रोआरएनए लक्ष्यों और कार्यात्मक माइक्रोआरएनए की पहचान करने के लिए रणनीति के माध्यम से पुन: पेश करने का वर्णन करता है क्योंकि माइक्रोआरएनए के प्रत्यक्ष लक्ष्य का सत्यापन चुनौतीपूर्ण है। हमारा प्रोटोकॉल व्यक्तिगत माइक्रोआरएनए के कार्य और कैंसर थेरेपी में माइक्रोआरएनए के निहितार्थ पर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।आधा अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता की गणना एक महत्वपूर्ण तरीका है, न केवल माइक्रोआरएनए अध्ययन के लिए बल्कि अन्य कैंसर विरोधी दवाओं के प्रभावोत्पादक मूल्यांकन के लिए । हमारा प्रोटोकॉल नए शोधकर्ताओं के लिए मददगार होगा क्योंकि हमने एक कोशिका में माइक्रोआरएनए के स्तर को समझने के लिए मौलिक विधि का वर्णन किया है। प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए, कोशिका काउंटर के साथ कोशिकाओं की गिनती करें।एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को प्लेट। अगले दिन, माइक्रोआरएनए नियंत्रण की नकल, और माइक्रोआरएनए-107 की नकल के कई अंतिम सांद्रता में कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए ट्रांसफेक्शन मिश्रण का एक सेट तैयार करें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के साथ-साथ कम सीरम मीडिया में 25 माइक्रोमोलर माइक्रोआरएनए कंट्रोल नकल, या माइक्रोआरएनए-107 की नकल को पतला और जोड़ें।माइक्रोपिपेट का उपयोग करके ओलिगो युक्त मिश्रण को धीरे-धीरे मिलाएं। सेल कल्चर हुड में 10 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, धीरे-धीरे ओलिगो युक्त मिश्रण को फिर से मिलाएं, और फिर प्रत्येक कुएं में मिश्रण के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। संक्रमित कोशिकाओं को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।ध्यान से प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल संस्कृति मीडिया को एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं में 10% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड या टीसीए के 100 माइक्रोलीटर को तुरंत भरें। प्लेट को एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 10% टीसीए युक्त रखें। इसके बाद, प्लेट को नल के पानी के साथ एक टब में डुबोकर कई बार धोएं।जब तक पानी न बचा हो तब तक प्लेट को टैप करके कुओं के अंदर से अतिरिक्त पानी निकालें, और प्लेट को सुखा लें। पिपेट खाली कुओं सहित प्रत्येक कुएं में 0.4% एसआरबी समाधान के 50 माइक्रोलीटर। धीरे से 0.4% एसआरबी समाधान समान रूप से कुओं के नीचे शामिल है जब तक थाली हिला।इसके बाद थाली को 40 से 60 मिनट तक इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, थाली को 1% एसिटिक एसिड से धोएं जब तक कि अनबाउंड डाई पूरी तरह से बह न जाए। पिपेट 10 मिलिमोलर ट्रिस बेस सॉल्यूशन के 100 माइक्रोलीटर को खाली कुओं सहित संबंधित कुओं में।थाली को 10 मिनट के लिए शेकर पर रखें। 492 नैनोमीटर पर अवशोषण को मापें। एसआरबी परख के अवशोषण मूल्यों का उपयोग करके प्रत्येक समूह के औसत अवशोषण और मानक विचलन के प्रतिशत की गणना करें।डेटा को लंबवत रूप से संरेखित करके सॉफ्टवेयर में उपचार सांद्रता, औसत अवशोषण और मानक विचलन सहित कच्चे डेटा का आयात करें। बनाएं ग्राफ टैब पर क्लिक करें और सिंपल स्कैटर एरर बार्स चुनें। प्रतीक मूल्यों के रूप में वर्कशीट कॉलम का चयन करें, और आगे क्लिक करें।डेटा फॉर्मेट पैनल में एक्स-वाई जोड़े चुनें और आगे क्लिक करें। चुनिंदा डेटा पैनल में संबंधित डेटा कॉलम चुनें। प्लॉट बनाने के लिए फिनिश पर क्लिक करें।धुरी के स्केलिंग में पैमाने के प्रकार को संशोधित करने के लिए एक्स-एक्सिस पर डबल-क्लिक करें। रैखिक से लॉग करने के लिए पैमाने के प्रकार बदलें। प्रारंभ और अंत सीमा संख्या को क्रमशः 0.01 और 200 तक संशोधित करें।किसी भी स्कैटर प्लॉट पर राइट-क्लिक करें, कर्व फिट चुनें, और परिभाषित उपश्रेणी उपयोगकर्ता पर जाएं। खुराक प्रतिक्रिया वक्र का चयन करें। अगले बटन पर क्लिक करें, और फिर खत्म क्लिक करें।रिपोर्ट टैब पर जाएं, और फिर एन, कश्मीर और आर मानों की जांच करें। साथ में विस्तृत पाठ प्रोटोकॉल के रूप में पीसीआर चलाते हैं। फिर एक ट्यूब में प्रतिबंध एंजाइम Exo1 और Not1 एक सहित प्रतिक्रिया मिश्रण के संयोजन से डबल पाचन पर चलते हैं।37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में तीन से चार घंटे के लिए मिश्रण इनक्यूबेट। डबल-डाइजेस्ट उत्पादों को 1% एगर उठे हुए जेल पर चलाएं। इसके बाद यूवी लाइट के नीचे बैंड काटें।एक्साइज्ड बैंड से डबल-डाइजेस्ट पीसीआर उत्पादों और लूसिफ़ेरेस वैक्टर को शुद्ध करें। डीएनए लिगाज़ सहित लिगेशन रिएक्शन मिश्रण के 20 माइक्रोलीटर तैयार करके पीसीआर उत्पादों को लूसिफ़ेरेस वैक्टर में लिसेफेंस वैक्टर में लिगेशन जारी रखें। संक्षेप में 10 से 15 सेकंड के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र।थर्मल साइकिल का उपयोग करके रात भर 16 डिग्री सेल्सियस पर लिगेशन को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, सक्षम कोशिकाओं वाली ट्यूब में लिगेशन मिश्रण जोड़कर परिवर्तन करें। धीरे-धीरे ट्यूब पर टैप करें और इसे 20 मिनट तक बर्फ पर रखें।जल्दी और धीरे से 30 सेकंड के लिए एक मिनट के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर एक हीट ब्लॉक के लिए ट्यूब हस्तांतरण । हीट शॉक के बाद, ट्यूब को 20 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। एक पौंड आगर प्लेट पर सक्षम कोशिकाओं को फैलाएं।रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में सक्षम कोशिकाओं को विकसित करें। अगले दिन, अल्ट्रापुरे पानी युक्त 8-स्ट्रिप ट्यूबों में से एक में एक व्यक्तिगत कॉलोनी और रीसुस्पेंड ई.कोलाई चुनें, और ई कोलाई को चार से आठ बेतरतीब ढंग से चयनित कॉलोनियों से फिर से ढिंढा करने के लिए इस कदम को दोहराएं। 8-स्ट्रिप ट्यूब के एक और सेट में ई. कोलाई निलंबन के 25 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें।ई.कोलाई निलंबन का उपयोग कर कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करें। एक 24 अच्छी तरह से थाली में लूसिफ़ेरेस परख तैयार करें। प्रत्येक अच्छी तरह से एक 500 माइक्रोलीटर सेल संस्कृति मीडिया में चार कोशिकाओं में एक से दो बार दस जोड़ें।रात भर इनक्यूबेशन के बाद, नियंत्रण की नकल या ट्रांसफेक्शन रीएजेंट का उपयोग करके एक विशिष्ट माइक्रोआरएनए की नकल के साथ कोशिकाओं में ल्यूसिफ़ेरेस वैक्टर के 50 नैनोग्राम को ट्रांसफेक्ट करें। अगले दिन, फॉस्फेट बफर नमकीन का उपयोग करके दो बार कुओं के अंदर धोएं। कुओं में लाइसिस रिएजेंट के 200 माइक्रोलीटर लगाएं और लूसिफ़ेरेस गतिविधि को मापने से पहले पर्याप्त रूप से सेल लाइसिस करें।थाली को कम से कम 15 मिनट तक हिलाते रहें। सेल के पांच से 10 माइक्रोलीटर को नई ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 100 माइक्रोलीटर रीएजेंट एक जोड़ें और तुरंत पिपटिंग द्वारा समाधान मिलाएं। फिर 10 से 15 सेकंड के लिए इलुमिनोमीटर का उपयोग करके जुगनू लूसिफ़ेरेस गतिविधि पढ़ें।एक ही ट्यूब में रिएजेंट टू के 100 माइक्रोलीटर डालें और फिर दो बार पाइपिंग करके मिलाएं। अंत में, इलुमिनोमीटर का उपयोग करके 10 से 15 सेकंड के लिए रेनिला लूसिफ़ेरेस गतिविधि पढ़ें। आरटीपीसीआर एचपीएनई कोशिकाओं की तुलना में माइक्रोआरएनए-107 और पैनी-1 और सीएपीएन-1 कोशिकाओं में उल्लेखनीय कमी दिखाता है।एचपीएनई कोशिकाओं की तुलना में पैन-1 और सीएपीएन-1 कोशिकाओं में माइक्रोआरएनए-301 के स्तर को काफी हद तक बढ़ाया गया था। इस अध्ययन में एसआरबी परख स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि एक माइक्रोआरएनए-107 नकल ट्रांसफैक्शन के बाद PANC-1 कोशिकाओं के प्रसार में कमी आई। माइक्रोआरएनए-107 के 11 संभावित अनुमानित लक्ष्यों की स्क्रीनिंग से स्पष्ट रूप से पता चलता है कि केवल सिन्यूक्लिन गामा, या एसएनसीजी, ट्यूमर सेल विकास का एक सकारात्मक नियामक सीधे माइक्रोआरएनए-107 और पैनी-1 कोशिकाओं के साथ बातचीत करता है, यह दर्शाता है कि माइक्रोआरएनए-107 एसएनसीजी अभिव्यक्ति को मोल्ड करके पैनी-1 कोशिकाओं के प्रसार को नकारात्मक रूप से विनियमित कर सकता है।वयस्क सेल प्रसार परख है कि टेट्रा हाइड्रोलियम आधारित इकाई और CFSE का उपयोग करने के लिए इस तरह के microRNA नकल के रूप में प्रभाव स्क्रीन लागू होते हैं, सेल प्रकार के आधार पर । माइक्रोआरएनए के प्रायोगिक रूप से मान्य कार्य के आधार पर, लूसिफ़ेरेस परख से पहले उम्मीदवार लक्ष्यों की सूची को कम करने के लिए डेटाबेस और लक्ष्य भविष्यवाणी कार्यक्रम की व्यवस्थित समीक्षा की आवश्यकता होती है। कैंसर रोधी दवाओं के साथ माइक्रोआरएनए की संयोजन दक्षता के मूल्यांकन के लिए, संयोजन सूचकांक के मूल्यांकन के लिए हमारे प्रोटोकॉल के आधार पर समायोजित आईसी मूल्यों की गणना करना लाभप्रद है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

परिवेश पार्टिकुलेट मैटर प्रेरित गुणसूत्र aberrations के विश्लेषण से एक का उपयोग<em&gt; इन विट्रो</em&gt; सिस्टम

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

पेप्टाइड व्युत्पन्न विधि पौधों में सेलुलर के उस पार जीन और प्रोटीन और Organellar बाधाओं को परिवहन करने के लिए

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

रिकॉमबिनेंट Adeno-एसोसिएटेड वायरस सीरोटाइप 9 का उपयोग कर MicroRNA की प्रणालीगत डिलिवरी कुतर में Neuromuscular रोगों का इलाज

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

इन विट्रो Bioluminescence परख स्तन उपकला कोशिकाओं में Circadian ताल की विशेषता के लिए

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप) कम बहुतायत भ्रूण के नमूनों के लिए प्रोटोकॉल

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

प्रोटीन कार्यात्मक परख के लिए कीट कोशिकाओं (sf9) में विदेशी जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

पूर्वव्यापी MicroRNA अनुक्रमण: पूरक डीएनए लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग Formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड आरएनए नमूनों

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

अलगाव, लक्षण वर्णन और मानव दंत कूप स्टेम सेल के MicroRNA आधारित आनुवंशिक संशोधन

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

रोग से जुड़े दुर्लभ मानव वेरिएंट Drosophila का उपयोग कर के Vivo कार्यात्मक अध्ययन में

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

एक इन विट्रो आक्रमण परख में माउस मैमरी ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग Oncogenic सेल व्यवहार के एक उपाय के रूप में

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...