Name: an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

Denne studien ble støttet av Basic Science Research program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av utdanningsdepartementet (2017R1D1A3B03035662); og Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).

1. modne MicroRNA (miRNA) Expression analyse
<ol><li>
Modne miRNA komplementære DNA (cDNA) syntese
	<ol>
<li>Tilsett 254 i totalt RNA og 4,5 μL av deoxyribonuclease I (DNase I) blandinger, og tilsett deretter ultrarent vann i PCR-rør for å ta opp til 18 μL (fig. 2a). Forbered reaksjonen for hver total RNA-prøve renset fra flere cellelinjer med nok mengde DNase I blandinger basert på det totale antall reaksjoner. Merk: DNase I blandinger består a...

<ol>
	<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells.">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs-103/107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy.">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li><li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis.">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li><li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs,+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells.">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li><li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+miR-155/FOXO3a+and+miR-222/PTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line.">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3.">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li><li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+miR-107,+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+(pHGGs).">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li><li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunting+of+targets:+challenge+in+miRNA+research.">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li><li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis:+not+all+kits+are+created+equal.">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents,+5-Aza-CdR+and+FK228,+in+Human+Gastric+Cancer+Cells.">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN.">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer.">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li><li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+(MTT)+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays.">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47 (2015).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202 (2010).</li><li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+me+count+the+ways:+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs.">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li><li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay.">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation.">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li><li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways.">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li><li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches.">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer.">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li><li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets.">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li><li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression.">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li><li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+B+(SRB)+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation.">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li><li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+hematological+malignancies.">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+anticancer+drugs.">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li><li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide.">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method.">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li><li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing.">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li></ol>

Strategier for fastsettelse av bona fide miRNA mål med funksjonene til en miRNA av interesse er uunnværlig for forståelsen av flere roller miRNAs. Identifisering av miRNA mål gener kan være en retningslinje for å tolke celle signalering hendelsene modulert av miRNAs i en celle. En avsløring av funksjonelt viktige mål gener av miRNAs kan gi den grunnleggende kunnskapen til å utvikle en miRNA-basert terapi i kreft.
Flere metoder som Microarrays, små RNA biblioteket sekvensering, dype s...

MicroRNAs (miRNAs) er de små regulatoriske RNAs som i hovedsak modulere prosessen med oversettelse og degradering av Messenger RNAs (mRNAs) ved å reagere på de 3 ' uoversatt regioner (3 ' UTR) i bona fide mål gener1. Uttrykk for miRNAs kan reguleres av transcriptional og post-transcriptional mekanismer. Ubalansen av slike regulatoriske mekanismer bringer ukontrollert og karakteristiske miRNAs uttrykks nivåer i mange sykdommer, inkludert kreft2. En enkelt miRNA kan ha flere interaksjoner med ulike mRNAs. Tilsvarende kan en individuell mRNA styres av ulike miRNAs. Derfor er intracellulære signalering nettverk intrikat påvirket av utpreget uttrykt miRNAs der fysiologiske lidelser og sykdommer kan initieres og forverret2,3,4, 5 andre priser , 6. selv om den endrede uttrykk for miRNAs har blitt observert i ulike typer kreft, den molekylære mekanismer som modulere oppførsel av kreftceller i forbindelse med miRNAs er fortsatt i stor grad ukjent.
Akkumulere bevis har vist at kreftfremkallende eller tumor-undertrykkende roller miRNAs avhenge av hvilke typer kreft. For eksempel, ved å målrette stallgreip boksen O3 (FOXO3), miR-155 fremmer celle spredning, metastasering, og chemoresistance av tykktarmskreft7,8. I kontrast er begrensningen av glioma celle invasjon indusert av miR-107 via regulering av neurogenic geometriske hakk homologe protein 2 (NOTCH2) uttrykk9. Vurderingen av miRNA-Target interaksjoner i forbindelse med miRNA funksjoner er en uunnværlig del for å bedre forstå hvordan miRNAs regulere ulike biologiske prosesser i både sunne og syke stater10. I tillegg kan oppdagelsen av bona fide mål (er) av miRNAs ytterligere gi en finjustert strategi for en miRNA-basert terapi med ulike anti-kreft narkotika. Den største utfordringen innen miRNAs er imidlertid identifikasjonen av direkte mål for miRNAs. Her er detaljerte metoder presentert som reproduserbar eksperimentelle tilnærminger for miRNA målet genet besluttsomhet. Vellykket eksperimentell design for miRNA målet identifikasjon innebærer ulike trinn og betraktninger (figur 1). Sammenligning av modne miRNA nivåer i tumorceller og normale celler kan være en av de vanligste prosedyrene for å velge en miRNA av interesse (figur 1a). Den funksjonelle studien av en utvalgt miRNA å oppdage virkningene av en miRNA på celle spredning er viktig å innskrenke listen over beste potensielle kandidat mål av en miRNA av interesse (figur 1B). Basert på eksperimentelt validerte funksjoner av miRNAs, en systematisk gjennomgang av litteratur og database i selskap med en miRNA mål prediksjon programmet er nødvendig for å søke den mest relevante informasjonen om gen funksjoner (figur 1C). Identifisering av virkelige målet gener av en miRNA av interesse kan oppnås ved å implementere eksperimenter som luciferase analysen sammen med kloning av 3 ' UTR av et gen, sanntids PCR, og vestlige blotting (figur 1d). Målet med den nåværende protokollen er å gi omfattende metoder for viktige eksperimenter, sonden-baserte sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR), sulforhodamine B (SRB) analysen etter en miRNA etterligne transfeksjoner, dose-respons kurve generasjon, og luciferase analysen sammen med kloning av 3 ' UTR av et gen. Den nåværende protokollen kan være nyttig for en bedre forståelse av funksjonene til individuelle miRNAs og konsekvensen av en miRNA i kreft terapi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading dye</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>RD006</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-cap strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010535</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010580</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-1L</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose A</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bio basic Canada Inc</td>
			<td>AB0028</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx 96 tube strips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401493</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx real-time PCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G8830A</td>
			<td>qPCR amplification, detection, and data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsiSI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0630</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPAN-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LCB-1203B-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chambers with V-slash</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>650010</td>
			<td>Cells counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>10X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN30200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NIPPON Genetics EUROPE</td>
			<td>MWD1</td>
			<td>1 Kb ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>100 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>100 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIT competent cells</td>
			<td>Real Biotech Corporation(RBC)</td>
			<td>RH617</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPNE cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar broth</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD7003</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>Model: E5311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Infinite F50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA control mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464058</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-107 mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464066</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>50 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus (electrophoresis system)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td></td>
			<td>Model: AD110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo explorer program</td>
			<td>GeneLink</td>
			<td></td>
			<td>For primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8X Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>500 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040117</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA miniprep S&#38; V kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN10200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R050A</td>
			<td>250 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Shaking platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LSI-3016A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 14 software</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td></td>
			<td>For dose-response curve generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine B powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1402-5G</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green master mix</td>
			<td>Smobio</td>
			<td>TQ12001805401-3</td>
			<td>Binding fluorescent dye for dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td>25,000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>200 reactions, no AmpErase UNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan miR RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C and 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>For amplification of DNA (or cDNA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells

MicroRNAs (miRNAs) er små regulatoriske RNAs som er anerkjent for å modulere en rekke intracellulære signalering trasé i flere sykdommer, inkludert kreft. Disse små regulatoriske RNAs hovedsakelig samhandle med 3 ' uoversatt regioner (3 ' UTR) av deres mål Messenger RNAs (mRNAs) til slutt resulterer i Hemming av dekoding prosesser av mRNAs og styrking av målet mRNA degradations. Basert på uttrykks nivåer og intracellulære funksjoner, miRNAs er i stand til å tjene som regulatoriske faktorer av kreftfremkallende og tumor-undertrykkende mRNAs. Identifisering av bona fide mål gener av en miRNA blant hundrevis eller kanskje tusenvis av beregningsmessig spådd mål er et avgjørende skritt for å skjelne rollene og grunnleggende molekylære mekanismer av en miRNA av interesse. Ulike miRNA mål prediksjon programmer er tilgjengelig for å søke mulig miRNA-mRNA interaksjoner. Men det mest utfordrende spørsmålet er hvordan man skal validere direkte mål gener av en miRNA av interesse. Denne protokollen beskriver en reproduserbar strategi for viktige metoder for hvordan å identifisere miRNA mål knyttet til funksjonen til en miRNA. Denne protokollen presenterer en praktisk guide på trinn-for-trinn-prosedyrer for å avdekke miRNA nivåer, funksjoner og relaterte mål mRNAs ved hjelp av sonde-basert sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR), sulforhodamine B (SRB) analysen etter en miRNA etterligne transfeksjoner , dose respons kurve generasjon, og luciferase analysen sammen med kloning av 3 ' UTR av et gen, som er nødvendig for riktig forståelse av rollene til individuelle miRNAs.

Vellykket og nøyaktig bekreftelse på miRNA nivåer er viktig for tolkningen av data som klassifisering av miRNAs er mulig basert på den forventede roller miRNAs i utvikling og progresjon av en sykdom. Nivåene av miRNA-107 og miRNA-301 ble målt i tre bukspyttkjertel cellelinjer ved hjelp av sonde-baserte kvantitative PCR. Syntesen av cDNAs av både en bestemt miRNA og et referanse gen i samme reaksjon kan øke reproduserbarheten av data. PANC-1 og CAPAN-1 er menneskelige bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom celleli...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Denne protokollen bruker en sonde-basert sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR), en sulforhodamine B (SRB)-analysen, 3 ' uoversatt regioner (3 ' UTR) kloning, og en luciferase analysen for å verifisere målet gener av en miRNA av interesse og å forstå funksjonene til miRNAs.

En in vitro-protokoll for evaluering av MicroRNA nivåer, funksjoner og assosierte mål gener i tumor celler

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

For å få tilgang til neural microRNA mål interaksjoner med MicroRNA funksjoner er avgjørende for å forstå hvordan MicroRNAs regulere ulike biologiske prosesser i både sunne og syke tilstander. Denne protokollen beskriver reprodusere gjennom strategi for å identifisere microRNA mål og funksjonelle microRNAs som validering av direkte mål for microRNAs er utfordrende. Vår protokoll kan gi innsikt i funksjonen til individuelle microRNAs og implikasjonen av en microRNA i kreftbehandling.Beregning av halvmaksimal hemmende konsentrasjon er en viktig metode, ikke bare for microRNA-studier, men for effektiv evaluering av andre kreftmedisiner. Vår protokoll vil være nyttig for nye forskere siden vi beskrev den grunnleggende metoden for å forstå nivået av microRNAs i en celle. For å starte protokollen, telle cellene med celletelleren.Plate cellene i en 96 brønnplate. Neste dag, forberede et sett med transfection blandinger for å transfisere cellene i flere endelige konsentrasjoner av microRNA kontroll etterligne, og microRNA-107 etterligne. Fra et lager av 25 mikromolar microRNA kontroll etterligne, eller microRNA-107 etterligne, fortynne og legge kontroll etterligne eller microRNA-107 etterligne i redusert serum media sammen med transfection reagens i mikrocentrifuge rør.Bland forsiktig de oligoholdige blandingene ved hjelp av en mikropipette. Etter en 10 minutters inkubasjon i cellekulturhetten, bland forsiktig de oligoholdige blandingene igjen, og tilsett deretter 50 mikroliter av blandingene i hver brønn. Hold de trans infiserte cellene i en cellekultur inkubator.Aspirer forsiktig cellekulturmediet i hver brønn av platen og fyll straks 100 mikroliter med 10% trikloreddiksyre, eller TCA, inn i hver brønn. Hold platen som inneholder 10% TCA ved fire grader Celsius i en time. Vask deretter platen flere ganger ved å senke den ned i et badekar med vann fra springen.Fjern overflødig vann fra innsiden av brønnene ved å tappe platen til det ikke er vann igjen, og tørk platen. Pipette 50 mikroliter med 0,4 % SRB-løsning i hver brønn, inkludert de tomme brønnene. Rist platen forsiktig til 0,4% SRB-oppløsningen dekker jevnt bunnen av brønnene.Deretter inkuber platen i 40 til 60 minutter. Etter inkubasjon, vask platen med 1% eddiksyre til det ubundet fargestoffet er helt vasket bort. Pipette 100 mikroliter på 10 millimolar Tris baseløsning i de tilsvarende brønnene, inkludert tomme brønner.Hold platen på en shaker i 10 minutter. Mål absorbansen ved 492 nanometer. Beregn prosentandelen av gjennomsnittlig absorbans og standardavviket for hver gruppe ved hjelp av absorbansverdier for SRB-analysen.Importer rådataene, inkludert behandlingskonsentrasjoner, gjennomsnittlig absorbans og standardavvik i programvaren ved å justere dataene vertikalt. Klikk kategorien Opprett graf, og velg feilfeltene for enkel punktdiagram. Velg regnearkkolonner som symbolverdier, og klikk neste.Velg X-Y-par i Dataformat-panelet, og klikk neste. Velg tilsvarende datakolonner i Velg data-panelet. Klikk fullfør for å opprette plottet.Dobbeltklikk på X-aksen for å endre skalatypen i skaleringen av aksen. Endre skalatypen fra lineær til logg. Endre start- og sluttområdenummeret til henholdsvis 0,01 og 200.Høyreklikk på et punktdiagram, velg Kurvepass, og gå til underkategorien Brukerdefinert. Velg doseresponskurve. Klikk de neste knappene, og klikk deretter Fullfør.Gå til rapportfanen, og kontroller deretter verdiene n, k og R. Kjør PCR som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Deretter går du videre til dobbel fordøyelse ved å kombinere reaksjonsblandingene, inkludert restriksjonsenzymene Exo1 og Not1 en i et rør.Inkuber blandingene i tre til fire timer i et 37 graders Celsius vannbad. Kjør de dobbeltfordøyde produktene på en 1% agarose gel. Klipp deretter båndene under UV-lys.Rens de dobbeltfordøyde PCR-produktene og luciferasevektorene fra de utskårete båndene. Fortsett med ligation av PCR-produktene i luciferase vektorer ved å forberede 20 mikroliter ligation reaksjon blandinger inkludert DNA ligase. Sentrifuger røret i 10 til 15 sekunder.Inkuber ligationen ved 16 grader Celsius over natten ved hjelp av en termisk cycler. Neste dag, utføre transformasjon ved å legge ligation blandinger i røret som inneholder kompetente celler. Bank forsiktig på røret og hold det på is i 20 minutter.Raskt og forsiktig overføre røret til en varmeblokk ved 42 grader Celsius i 30 sekunder til ett minutt. Etter varmesjokk, legg røret på is i 20 minutter. Spre kompetente celler på en LB agar plate.Vokse kompetente celler i en inkubator ved 37 grader Celsius over natten. Dagen etter, velg en individuell koloni og gjenoppliv E.coli i en av de 8-strip rørene som inneholder ultrapure vann, og gjenta dette trinnet for å gjenopplive E.coli fra fire til åtte tilfeldig utvalgte kolonier. Overfør 25 mikroliter E.coli-suspensjon til et annet sett med 8-stavers rør.Utfør kolonien PCR ved hjelp av E.coli suspensjon. Forbered luciferase analysen i en 24 brønnplate. Legg til en til to ganger ti til de fire cellene i en 500 mikroliter celle kultur media for hver brønn.Etter inkubasjon over natten, transfect 50 nanograms luciferase vektorer inn i cellene med kontroll etterligne eller en bestemt microRNA etterligne ved hjelp av en transfection reagens. Neste dag, vask innsiden av brønnene to ganger ved hjelp av fosfat bufret saltvann. Påfør 200 mikroliter lysisreagens i brønnene og utfør tilstrekkelig cellelys før du måler luciferaseaktiviteten.Hold platen risting i minst 15 minutter. Overfør fem til 10 mikroliter cellelylat til det nye røret, og tilsett 100 mikroliter reagens en og bland umiddelbart løsningen ved pipettering. Les deretter firefly luciferase aktivitet ved hjelp av illuminometer i 10 til 15 sekunder.Tilsett 100 mikroliter reagens to i samme rør og bland deretter ved å pipettering to ganger. Til slutt, les renilla luciferase aktivitet i 10 til 15 sekunder ved hjelp av illuminometer. RTPCR viser en signifikant reduksjon av microRNA-107- og PANC-1- og CAPAN-1-celler sammenlignet med HPNE-celler.Nivåene av microRNA-301 ble betydelig oppregulert i PANC-1- og CAPAN-1-celler, sammenlignet med HPNE-celler. SRB-analysen i denne studien viser tydelig at spredningen av PANC-1-celler ble redusert etter en microRNA-107 etterligne transfection. Screeningen av 11 potensielle forventede mål for microRNA-107 viser tydelig at bare synuclein gamma, eller SNCG, en positiv regulator av tumorcellevekst direkte samhandler med microRNA-107 og PANC-1-celler, noe som indikerer at microRNA-107 kan regulere spredningen av PANC-1-celler negativt ved å modulere SNCG-uttrykket.Voksen celle spredning analyser som bruker tetra hydroleum-basert enhet og CFSE gjelder for å screene effekten av slike microRNA etterligner, avhengig av celletyper. Basert på den eksperimentelt validerte funksjonen til microRNAs, er det nødvendig med en systematisk gjennomgang av database- og målforutsigelsesprogrammet for å begrense listen over kandidatmål før luciferase-analyser. For evaluering av kombinasjonseffektivitet av microRNAer med kreftmedisiner, er det en fordel å beregne justerte IC-verdier basert på vår protokoll for vurdering av kombinasjonsindeks.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse av Ambient Svevestøv-indusert kromosomavvik ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptide-avledet Metode for å transportere gener og proteiner Across Cellular og Organellar Barrierer i Plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemisk levering av MicroRNA ved hjelp av rekombinant Adeno-assosiert Virus Serotype 9 til å behandle Neuromuscular sykdommen i gnagere

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescens analysen som karakteriserer døgnrytmen i Mammary epitelceller

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokollen for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Forbigående uttrykk av utenlandske gener i insekt celler (sf9) for Protein funksjonelle analysen

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv MicroRNA sekvensering: Komplementære DNA biblioteket forberedelse protokollen bruker Formalin-fast parafin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering og karakterisering MicroRNA-baserte genetisk modifisering av menneskelig Dental hårsekken stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funksjonell studie av sykdom-Associated sjeldne Human varianter bruke Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Bruk av mus melke tumor celler i en in vitro Invasion analysen som et mål på kreftfremkallende Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...