Name: an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (2017R1D1A3B03035662); e fundo de pesquisa da Universidade Hallym, 2017 (HRF-201703-003).

1. maduro MicroRNA (miRNA) análise de expressão
<ol><li>
Síntese de DNA complementar maduro de miRNA (cDNA)
	<ol>
<li>Adicionar 254 ng de RNA total e 4,5 μL de misturas de desoxirribonuclease I (DNase I) e, em seguida, adicionar água ultrapura em tubos de tiras de PCR para fazer até 18 μL (Figura 2a). Prepare a reação para cada amostra de RNA total purificada de várias linhas celulares usando quantidade suficiente de misturas de DNase I com base no número total ...

<ol>
	<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells.">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs-103/107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy.">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li><li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis.">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li><li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs,+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells.">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li><li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+miR-155/FOXO3a+and+miR-222/PTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line.">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3.">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li><li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+miR-107,+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+(pHGGs).">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li><li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunting+of+targets:+challenge+in+miRNA+research.">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li><li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis:+not+all+kits+are+created+equal.">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents,+5-Aza-CdR+and+FK228,+in+Human+Gastric+Cancer+Cells.">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN.">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer.">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li><li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+(MTT)+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays.">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47 (2015).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202 (2010).</li><li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+me+count+the+ways:+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs.">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li><li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay.">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation.">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li><li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways.">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li><li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches.">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer.">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li><li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets.">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li><li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression.">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li><li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+B+(SRB)+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation.">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li><li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+hematological+malignancies.">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+anticancer+drugs.">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li><li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide.">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method.">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li><li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing.">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li></ol>

Estratégias para a determinação de alvos de miRNA de bona fide com as funções de um miRNA de interesse são indispensáveis para a compreensão de múltiplos papéis de miRNAs. A identificação de genes alvo de miRNA pode ser uma diretriz para interpretar os eventos de sinalização celular modulados por miRNAs em uma célula. Um desvelamento de genes-alvo funcionalmente importantes de miRNAs pode fornecer o conhecimento fundamental para desenvolver uma terapia baseada em miRNA no câncer.
<p class="jove_conten...

MicroRNAs (miRNAs) são os pequenos RNAs regulatórios que modulam principalmente o processo de tradução e degradação de RNAs mensageiro (mRNAs), reagindo às 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) em genes alvo de boa-fé1. A expressão de miRNAs pode ser regulada por mecanismos transcricional e pós-transcricional. O desequilíbrio desses mecanismos reguladores traz níveis de expressão miRNAs descontrolados e distintos em inúmeras doenças, incluindo os cânceres2. Um único miRNA pode ter interações múltiplas com mRNAs diversos. Correspondentemente, um mRNA individual pode ser controlado por vários miRNAs. Portanto, as redes de sinalização intracelular são intrinsecamente influenciadas por miRNAs distintivamente expressas pelas quais distúrbios fisiológicos e doenças podem ser iniciados e deteriorados2,3,4 , 5. º , 6. embora a expressão alterada de miRNAs tenha sido observada em vários tipos de cânceres, os mecanismos moleculares que modulam os modos de células cancerosas em conjunto com miRNAs ainda são largamente desconhecidos.
A acumulação de evidências tem sido evidenciando que os papéis oncogênicos ou supressores de tumores de miRNAs dependem dos tipos de cânceres. Por exemplo, ao segmentar a caixa de os O3 (FOXO3), o miR-155 promove a proliferação celular, metástase e quimiorresistência do câncer colorretal7,8. Ao contrário, a limitação da invasão da pilha do glioma é induzida por miR-107 através da regulação da expressão9da proteína 2 do homólogo do entalhe do locus neurogênica (NOTCH2). A avaliação das interações de miRNA-Target em conexão com as funções de miRNA é uma parte indispensável para entender melhor como os miRNAs regulam vários processos biológicos em Estados saudáveis e doentes10. Além disso, a descoberta de alvo (s) de bona fide de miRNAs pode ainda fornecer uma estratégia aperfeiçoada para uma terapia baseada em miRNA com vários medicamentos anticancerígenos. No entanto, o principal desafio no campo dos miRNAs é a identificação de alvos diretos de miRNAs. Aqui, métodos detalhados são apresentados como abordagens experimentais reprodutíveis para a determinação do gene alvo de miRNA. O projeto experimental bem-sucedido para a identificação do alvo de miRNA envolve várias etapas e considerações (Figura 1). A comparação dos níveis de miRNA maduros nas células tumorais e nas células normais pode ser um dos procedimentos comuns para selecionar um miRNA de interesse (Figura 1a). O estudo funcional de um miRNA selecionado para detectar os efeitos de um miRNA na proliferação celular é importante para estreitar a lista dos melhores alvos potenciais candidatos de um miRNA de interesse (Figura 1b). Com base nas funções experimentalmente validadas de miRNAs, é necessária uma revisão sistemática da literatura e da base de dados em empresa com um programa de predição de alvo de miRNA para pesquisar as informações mais relevantes sobre as funções genéticas (Figura 1C). A identificação de genes alvo reais de um miRNA do interesse pode ser conseguida implementando experiências tais como o ensaio do luciferase junto com a clonagem de 3 ' UTR de um gene, PCR do tempo real, e mancha ocidental (Figura 1D). O objetivo do protocolo atual é fornecer métodos abrangentes de experimentos principais, a reação em cadeia da polimerase em tempo real baseada em sonda (PCR), o ensaio de sulforhodamina B (SRB) após uma transfecção mímica de miRNA, geração de curva de dose-resposta e o ensaio de luciferase juntamente com a clonagem de 3 ' UTR de um gene. O protocolo atual pode ser útil para uma compreensão melhor das funções de miRNAs individuais e da implicação de um miRNA na terapia de cancro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading dye</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>RD006</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-cap strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010535</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010580</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-1L</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose A</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bio basic Canada Inc</td>
			<td>AB0028</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx 96 tube strips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401493</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx real-time PCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G8830A</td>
			<td>qPCR amplification, detection, and data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsiSI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0630</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPAN-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LCB-1203B-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chambers with V-slash</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>650010</td>
			<td>Cells counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>10X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN30200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NIPPON Genetics EUROPE</td>
			<td>MWD1</td>
			<td>1 Kb ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>100 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>100 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIT competent cells</td>
			<td>Real Biotech Corporation(RBC)</td>
			<td>RH617</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPNE cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar broth</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD7003</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>Model: E5311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Infinite F50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA control mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464058</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-107 mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464066</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>50 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus (electrophoresis system)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td></td>
			<td>Model: AD110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo explorer program</td>
			<td>GeneLink</td>
			<td></td>
			<td>For primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8X Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>500 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040117</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA miniprep S&#38; V kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN10200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R050A</td>
			<td>250 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Shaking platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LSI-3016A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 14 software</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td></td>
			<td>For dose-response curve generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine B powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1402-5G</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green master mix</td>
			<td>Smobio</td>
			<td>TQ12001805401-3</td>
			<td>Binding fluorescent dye for dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td>25,000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>200 reactions, no AmpErase UNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan miR RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C and 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>For amplification of DNA (or cDNA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells

MicroRNAs (miRNAs) são pequenas RNAs regulatórias que são reconhecidas para modular inúmeras vias de sinalização intracelular em várias doenças, incluindo cânceres. Esses pequenos RNAs regulatórios interagem principalmente com as 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) de seus RNAs de mensageiro alvo (mRNAs), resultando na inibição dos processos de decodificação de mRNAs e no aumento das degradações de mRNA alvo. Com base nos níveis de expressão e nas funções intracelulares, os miRNAs são capazes de servir como fatores regulatórios de mRNAs oncogênicas e supressoras de tumores. A identificação de genes-alvo de boa-fé de um miRNA entre centenas ou mesmo milhares de alvos computacionalmente previstos é um passo crucial para discernir os papéis e os mecanismos moleculares básicos de um miRNA de interesse. Vários programas de predição de alvo de miRNA estão disponíveis para pesquisar possíveis interações de miRNA-mRNA. No entanto, a questão mais desafiadora é como validar genes alvo diretos de um miRNA de interesse. Este protocolo descreve uma estratégia reprodutível de métodos chaves em como identificar alvos de miRNA relativos à função de um miRNA. Este protocolo apresenta um guia prático em procedimentos passo a passo para descobrir níveis de miRNA, funções e mRNAs alvo relacionados usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real baseada em sonda (PCR), o ensaio de sulforhodamina B (SRB) após uma transfecção mímica de miRNA , geração da curva da dose-resposta, e ensaio do luciferase junto com a clonagem de 3 ' UTR de um gene, que seja necessário para a compreensão apropriada dos papéis de miRNAs individuais.

A confirmação bem-sucedida e precisa dos níveis de miRNA é importante para a interpretação dos dados pelos quais a classificação de miRNAs é possível com base nos papéis esperados de miRNAs no desenvolvimento e progressão de uma doença. Os níveis de miRNA-107 e miRNA-301 foram medidos em três linhagens de células pancreáticas utilizando a PCR quantitativa baseada em sonda. A síntese de cDNAs de ambos um miRNA específico e um gene de referência na mesma reação pode aumentar a reprodutibilidade dos da...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Este protocolo utiliza uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), um ensaio de sulforhodamina B (SRB), 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) clonagem e um ensaio de luciferase para verificar os genes alvo de um miRNA de interesse e para compreender as funções de miRNAs.

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Acessar interações de alvo de microRNA neural com funções de MicroRNA é fundamental para entender como as MicroRNAs regulam vários processos biológicos em estados saudáveis e doentes. Este protocolo descreve a reprodução através da estratégia para identificar alvos de microRNA e as microRNAs funcionais como a validação do alvo direto das microRNAs é desafiadora. Nosso protocolo pode fornecer insights sobre a função das microRNAs individuais e a implicação de um microRNA na terapia do câncer.O cálculo da concentração inibitória semi-máxima é um método importante, não apenas para estudos de microRNA, mas para a avaliação eficaz de outras drogas anticâncer. Nosso protocolo será útil para novos pesquisadores, uma vez que descrevemos o método fundamental para entender o nível de microRNAs em uma célula. Para começar o protocolo, conte as células com o contador de células.Coloque as células em uma placa de 96 poços. No dia seguinte, prepare um conjunto de misturas de transfecção para transfetar as células em várias concentrações finais de mímica de controle de microRNA, e imitação de microRNA-107. A partir de um estoque de 25 micromolars de controle microRNA mimic, ou microRNA-107 imitar, diluir e adicionar controle imitar ou microRNA-107 imitar na mídia soro reduzida, juntamente com o reagente de transfecção em tubos de microcentrifuuge.Misture delicadamente as misturas que contêm oligo usando uma micropipette. Após uma incubação de 10 minutos na capa de cultura celular, misture suavemente as misturas contendo oligo novamente e, em seguida, adicione 50 microliters das misturas em cada poço. Mantenha as células transfeinadas em uma incubadora de cultura celular.Aspire cuidadosamente a mídia de cultura celular em cada poço da placa e preencha prontamente 100 microliters de ácido 10% tricloroacético, ou TCA, em cada poço. Mantenha a placa contendo 10% TCA a quatro graus Celsius por uma hora. Em seguida, lave a placa várias vezes submergindo-a em uma banheira com água da torneira.Retire o excesso de água de dentro dos poços tocando na placa até que não haja mais água e seque a placa. Pipette 50 microliters de solução 0,4% SRB em cada poço, incluindo os poços em branco. Agite suavemente a placa até que a solução de 0,4% SRB cubra uniformemente a parte inferior dos poços.Em seguida, incubar a placa por 40 a 60 minutos. Após a incubação, lave a placa com ácido 1%acético até que o corante não ligado seja totalmente lavado. Pipette 100 microliters de 10 mililitros de solução base Tris nos poços correspondentes, incluindo poços em branco.Mantenha a placa em um shaker por 10 minutos. Meça a absorvância em 492 nanômetros. Calcule a porcentagem de absorção média e o desvio padrão de cada grupo utilizando valores de absorção do ensaio SRB.Importe os dados brutos, incluindo concentrações de tratamento, absorvância média e desvio padrão no software, alinhando verticalmente os dados. Clique na guia Criar gráficos e escolha as barras de erro de dispersão simples. Selecione colunas de planilhas como valores de símbolo e clique em seguida.No painel Formato de dados, selecione pares X-Y e clique em seguida. Selecione as colunas de dados correspondentes no painel Selecionar dados. Clique em terminar para criar o plot.Clique duas vezes no eixo X para modificar o tipo de escala na escala do eixo. Altere o tipo de escala de linear para log. Modifique o número da faixa inicial e final para 0,01 e 200, respectivamente.Clique com o botão direito do mouse em qualquer plot de dispersão, escolha Curve Fit e vá para a subcategoria Definida pelo usuário. Selecione a curva de resposta da dose. Clique nos próximos botões e clique em terminar.Vá para a guia de relatório e, em seguida, verifique os valores n, k e R. Execute o PCR conforme detalhado no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, passe para a digestão dupla combinando as misturas de reação, incluindo as enzimas de restrição Exo1 e Not1 em um tubo.Incubar as misturas por três a quatro horas em um banho de água de 37 graus Celsius. Execute os produtos duplamente digeridos em um gel de 1% de agarose. Em seguida, corte as bandas sob luz UV.Purificar os produtos PCR duplamente digeridos e vetores de luciferase das bandas excisadas. Continue com a ligadura dos produtos PCR nos vetores da luciferase, preparando 20 microliters de misturas de reação de ligadura, incluindo a liga ligadura de DNA. Centrifufique brevemente o tubo por 10 a 15 segundos.Incubar a ligadura a 16 graus Celsius durante a noite usando um cicloviário térmico. No dia seguinte, realize a transformação adicionando as misturas de ligadura no tubo contendo células competentes. Bata suavemente no tubo e mantenha-o no gelo por 20 minutos.Transfira o tubo de forma rápida e suave para um bloco de calor a 42 graus Celsius por 30 segundos a um minuto. Após o choque térmico, coloque o tubo no gelo por 20 minutos. Espalhe células competentes em uma placa de ágar LB.Cresça células competentes em uma incubadora a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, escolha uma colônia individual e resuspenja E.coli em um dos tubos de 8 tiras contendo água ultrauso, e repita este passo para resuspengar E.coli de quatro a oito colônias selecionadas aleatoriamente. Transfira 25 microliters de suspensão E.coli para outro conjunto de tubos de 8 tiras.Realize a colônia PCR usando a suspensão E.coli. Prepare o ensaio de luciferase em uma placa de 24 poços. Adicione uma a duas vezes dez às quatro células em uma mídia de cultura de células de 500 microliter para cada poço.Após a incubação durante a noite, transfete 50 nanogramas de vetores de luciferase nas células com mímica de controle ou uma imitação de microRNA específica usando um reagente de transfecção. No dia seguinte, lave o interior dos poços duas vezes usando soro fisco tamponado fosfato. Aplique 200 microliters de reagente de lise nos poços e realize suficientemente a lise celular antes de medir a atividade da luciferase.Mantenha a placa tremendo por pelo menos 15 minutos. Transfira de 5 a 10 microlitadores de lise celular para o novo tubo, e adicione 100 microliters de reagente um e misture imediatamente a solução por pipetação. Em seguida, leia a atividade de luciferase de vagalume usando illuminômetro por 10 a 15 segundos.Adicione 100 microliters de reagente dois no mesmo tubo e misture por pipetar duas vezes. Por fim, leia a atividade de renilla luciferase por 10 a 15 segundos usando illuminômetro. O RTPCR mostra uma redução significativa das células microRNA-107 e PANC-1 e CAPAN-1 em comparação com as células HPNE.Os níveis de microRNA-301 foram significativamente elevados nas células PANC-1 e CAPAN-1, em comparação com as células HPNE. O ensaio SRB neste estudo demonstra claramente que a proliferação de células PANC-1 diminuiu após uma transfecção de imitação de microRNA-107. A triagem de 11 potenciais alvos previstos de microRNA-107 mostra claramente que apenas a gama de sinucleína, ou SNCG, um regulador positivo do crescimento das células tumorais interage diretamente com células microRNA-107 e PANC-1, indicando que o microRNA-107 pode regular negativamente a proliferação de células PANC-1 modulando a expressão SNCG.Ensaios de proliferação de células adultas que usam a entidade baseada em tetra hidroleum e CFSE são aplicáveis para rastrear o efeito de como imitações de microRNA, dependendo dos tipos de células. Com base na função validada experimentalmente das microRNAs, é necessária uma revisão sistemática do banco de dados e do programa de previsão de alvos para reduzir a lista de alvos dos candidatos antes dos ensaios da luciferase. Para a avaliação da eficiência combinada das microRNAs com medicamentos anticâncer, é vantajoso calcular valores ajustados de IC com base em nosso protocolo para avaliação do índice de combinação.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Genética

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Entrega sistêmica de MicroRNA utilizando vírus Adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...