Name: an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования (2017R1D1A3B03035662); и Исследовательский фонд Галлимского университета, 2017 (HRF-201703-003).

1. Зрелый анализ экспрессии микроРНК (miRNA)
<ol><li>
Зрелый синтез комплементарной ДНК (кДНК) miRNA
	<ol>
<li>Добавить 254 нг общей РНК и 4,5 л дезоксирибонулеi I (DNase I) смеси, а затем добавить ультрачистую воду в ПЦР полос-труб, чтобы сделать до 18 qL(Рисунок 2A). Подготовьте реакцию ?...

<ol>
	<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells.">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs-103/107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy.">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li><li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis.">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li><li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs,+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells.">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li><li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+miR-155/FOXO3a+and+miR-222/PTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line.">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3.">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li><li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+miR-107,+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+(pHGGs).">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li><li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunting+of+targets:+challenge+in+miRNA+research.">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li><li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis:+not+all+kits+are+created+equal.">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents,+5-Aza-CdR+and+FK228,+in+Human+Gastric+Cancer+Cells.">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN.">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer.">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li><li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+(MTT)+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays.">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47 (2015).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202 (2010).</li><li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+me+count+the+ways:+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs.">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li><li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay.">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation.">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li><li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways.">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li><li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches.">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer.">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li><li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets.">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li><li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression.">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li><li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+B+(SRB)+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation.">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li><li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+hematological+malignancies.">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+anticancer+drugs.">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li><li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide.">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method.">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li><li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing.">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li></ol>

Стратегии определения добросовестных целей miRNA с функциями miRNA интересов необходимы для понимания нескольких ролей miRNA. Идентификация генов миРНК может быть ориентиром для интерпретации событий сигнализации клеток, модулируемых миРНК в клетке. Открытие функционально важных целевых г...

МикроРНК (miRNAs) являются небольшие нормативные РНК, которые в основном модулировать процесс перевода и деградации посланникРН (мРНК) реагируя на 3''непереведенных регионов (3' UTR) в добросовестных целевых генов1. Выражение миРНК может регулироваться транскрипционными и посттранскрипционными механизмами. Дисбаланс таких механизмов регулирования приносит неконтролируемые и отличительные уровни выражения miRNAs во многих заболеваниях, включая рак2. Одна miRNA может иметь несколько взаимодействий с различными мРНК. Соответственно, индивидуальная мРНК может контролироваться различными миРНК. Таким образом, внутриклеточные сигнальные сети замысловато влияют на четко выраженные миРНКи, с помощью которых физиологические расстройства и заболевания могут быть инициированы и ухудшились2,3,4, 5 , 6. Хотя измененное выражение miRNAs наблюдалось в различных типах рака, молекулярные механизмы которые модулируют образы раковых клеток в сочетании с miRNAs все еще больш неизвестны.
Накопление доказательств показывает, что онкогенные или опухолевые роли миРНК зависят от видов рака. Например, таргетинг вилочного ящика o3 (FOXO3), miR-155 способствует пролиферации клеток, метастазам и химиорезу колоректального рака7,8. В отличие от этого, ограничение вторжения клеток глиомы индуцируется miR-107 через регуляцию нейрогенного локуса выемки омологического белка 2 (NOTCH2) выражение9. Оценка miRNA-целевых взаимодействий в связи с функциями miRNA является неотъемлемой частью для лучшего понимания того, как miRNAs регулировать различные биологические процессы как в здоровых, так и в больных государствах10. Кроме того, открытие добросовестных целей (ы) miRNAs может дополнительно обеспечить доработанную стратегию для miRNA основе терапии с различными противораковыми препаратами. Однако основной проблемой в области миРНК является выявление прямых целей миРНК. Здесь подробные методы представлены в качестве воспроизводимых экспериментальных подходов к определению гена миРНК. Успешный экспериментальный дизайн для идентификации цели miRNA включает в себя различные шаги и соображения(рисунок 1). Сравнение зрелых уровней миРНК в опухолевых клетках и нормальных клетках может быть одной из распространенных процедур для выбора миРНК интереса(рисунок 1A). Функциональное исследование выбранной miRNA для обнаружения влияния miRNA на пролиферацию клеток важно сузить список лучших потенциальных целей кандидата на miRNA интереса(рисунок 1B). На основе экспериментально подтвержденных функций miRNAs, систематический обзор литературы и базы данных в компании с miRNA целевой программы прогнозирования требуется для поиска наиболее релевантной информации о функциях генов(рисунок 1C). Идентификация реальных генов цели miRNA интереса может быть достигнута путем осуществления экспериментов, таких как luciferase асссе наряду с клонированием 3' UTR гена, в режиме реального времени ПЦР, и западной blotting(Рисунок 1D). Целью текущего протокола является обеспечение комплексных методов ключевых экспериментов, зонд на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), сульфорходамин B (SRB) после мирны имитировать трансфекции, доза-реакция кривой поколения, и люцифераза асссис вместе с клонированием 3' UTR гена. Нынешний протокол может быть полезен для лучшего понимания функций отдельных miRNAs и последствия miRNA в терапии рака.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading dye</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>RD006</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-cap strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010535</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010580</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-1L</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose A</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bio basic Canada Inc</td>
			<td>AB0028</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx 96 tube strips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401493</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx real-time PCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G8830A</td>
			<td>qPCR amplification, detection, and data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsiSI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0630</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPAN-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LCB-1203B-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chambers with V-slash</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>650010</td>
			<td>Cells counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>10X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN30200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NIPPON Genetics EUROPE</td>
			<td>MWD1</td>
			<td>1 Kb ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>100 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>100 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIT competent cells</td>
			<td>Real Biotech Corporation(RBC)</td>
			<td>RH617</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPNE cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar broth</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD7003</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>Model: E5311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Infinite F50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA control mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464058</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-107 mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464066</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>50 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus (electrophoresis system)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td></td>
			<td>Model: AD110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo explorer program</td>
			<td>GeneLink</td>
			<td></td>
			<td>For primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8X Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>500 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040117</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA miniprep S&#38; V kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN10200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R050A</td>
			<td>250 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Shaking platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LSI-3016A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 14 software</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td></td>
			<td>For dose-response curve generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine B powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1402-5G</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green master mix</td>
			<td>Smobio</td>
			<td>TQ12001805401-3</td>
			<td>Binding fluorescent dye for dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td>25,000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>200 reactions, no AmpErase UNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan miR RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C and 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>For amplification of DNA (or cDNA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells

МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие регулятивные РНК, которые, как признается, модулируют многочисленные внутриклеточные сигнальные пути при нескольких заболеваниях, включая рак. Эти небольшие регулятивные РНК в основном взаимодействуют с 3''e'e'e'd (3' UTR) их целевых РНК-мессенджера (mRNAs), что в конечном итоге приводит к ингибированию процессов декодирования мРНК и увеличению целевых деградаций мРНК. Основываясь на уровнях экспрессии и внутриклеточных функциях, миРНК могут служить регуляторными факторами онкогенных и опухолевых мРНК. Выявление добросовестных целевых генов miRNA среди сотен или даже тысяч вычислительно прогнозируемых целей является важным шагом для определения роли и основных молекулярных механизмов miRNA интереса. Для поиска возможных взаимодействий miRNA-mRNA доступны различные целевые программы miRNA. Однако, самый сложный вопрос заключается в том, как проверить прямые гены цели miRNA интереса. Этот протокол описывает воспроизводимую стратегию ключевых методов по определению целей miRNA, связанных с функцией miRNA. Этот протокол представляет практическое руководство по пошаговым процедурам, чтобы раскрыть уровни miRNA, функции, и связанные с ними целевые мРНК с использованием зонда на основе полимеразной цепной реакции (PCR), сульфорходамин B (SRB) обзор после miRNA имитировать трансфекции , генерация кривой дозы-реакции, и luciferase асссее наряду с клонированием 3' UTR гена, который необходим для правильного понимания ролей отдельных miRNAs.

Успешное и точное подтверждение уровней миРНК имеет важное значение для интерпретации данных, с помощью которых можно классифицировать миРНК на основе ожидаемой роли миРНК в развитии и прогрессировании заболевания. Уровни miRNA-107 и miRNA-301 были измерены в трех линиях клеток поджелудочной...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Этот протокол использует зонд на основе в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (PCR), сульфорходамин B (SRB) обзор, 3'непереведенных регионов (3' UTR) клонирования, и luciferase обзор для проверки целевых генов miRNA интереса и понять функции miRNAs.

Протокол In Vitro для оценки уровней, функций и связанных с ними целевых генов в опухолевых клетках

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Для доступа к нейронной микроРНК целевых взаимодействий с функциями MicroRNA имеет решающее значение для понимания того, как микроРНК регулируют различные биологические процессы как в здоровых, так и в больных состояниях. Этот протокол описывает воспроизведение с помощью стратегии определения целей микроРНК и функциональных микроРНК, поскольку проверка прямой цели микроРНК является сложной задачей. Наш протокол может дать представление о функции отдельных микроРНК и последствиях микроРНК в терапии рака.Расчет полу максималлионной ингибирующей концентрации является важным методом не только для исследований микроРНК, но и для эффективной оценки других противоопухолевых препаратов. Наш протокол будет полезен для новых исследователей, так как мы описали фундаментальный метод, чтобы понять уровень микроРНК в клетке. Чтобы начать протокол, подсчитайте ячейки с счетчиком ячейки.Плита клеток в 96 хорошо пластины. На следующий день, подготовить набор трансфекции смесей для трансфекции клеток в нескольких окончательных концентрациях микроРНК контроля имитировать, и микроРНК-107 имитировать. Из запаса 25 микромолярной микроРНК контроль имитирует, или микроРНК-107 имитировать, разбавлять и добавлять контроль имитировать или микроРНК-107 имитировать в уменьшенных средств сыворотки вместе с трансфекции реагент в микроцентрифуг труб.Аккуратно смешайте олигосодержащие смеси с помощью микропипетта. После 10-минутной инкубации в капюшоне клеточной культуры, аккуратно смешайте олигосодержащие смеси снова, а затем добавьте 50 микролитров смесей в каждый колодец. Храните трансфицированные клетки в инкубаторе клеточной культуры.Тщательно аспирировать клеточной культуры средств массовой информации в каждом хорошо пластины и быстро заполнить 100 микролитров 10% трихлороацетической кислоты, или TCA, в каждый колодец. Держите пластину, содержащую 10%TCA при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем несколько раз вымойте тарелку, погрузив ее в ванну с водопроводной водой.Удалите излишки воды изнутри колодцев, постукивая пластины, пока не осталось воды, и высушить пластину. Pipette 50 микролитров 0,4% SRB раствор в каждой скважине, включая пустые скважины. Аккуратно встряхните пластину до тех пор, пока раствор 0.4%SRB равномерно не покрывает дно скважин.Затем инкубировать пластину в течение 40 до 60 минут. После инкубации вымойте тарелку 1%-ацетической кислотой до тех пор, пока не будет полностью смыт неприсохленный краситель. Pipette 100 микролитров 10 миллимолярный tris базовый раствор в соответствующие скважины, в том числе пустые скважины.Держите тарелку на шейкере в течение 10 минут. Измерьте абсорбанс на 492 нанометров. Рассчитайте процент среднего абсорбанса и стандартное отклонение каждой группы с использованием значений абсорбтности анализа SRB.Импорт необработанных данных, включая концентрацию обработки, среднее поглощение и стандартное отклонение в программное обеспечение путем вертикального выравнивания данных. Нажмите на вкладку «Создать график» и выберите простые бары ошибок рассеяния. Выберите столбцы листа в качестве значений символов и нажмите далее.В панели формата данных выберите пары X-Y и нажмите далее. Выберите соответствующие столбцы данных в панели Select Data. Нажмите закончить, чтобы создать сюжет.Дважды нажмите на X-ось, чтобы изменить тип шкалы в масштабировании оси. Измените тип шкалы от линейного к журналу. Измените число стартовых и конечных диапазонов до 0,01 и 200 соответственно.Нажмите правой кнопкой мыши на любой участок рассеяния, выберите Curve Fit и перейдите в подкатегорию Пользователь Defined. Выберите кривую реакции дозы. Нажмите на следующие кнопки, а затем нажмите закончить.Перейдите на вкладку отчета, а затем проверьте значения n, k и R. Запустите ПЦР, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем перейти к двойному пищеварению путем объединения реакционных смесей, в том числе ограничения ферментов Exo1 и Not1 один в трубке.Инкубировать смеси в течение трех-четырех часов в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Вы запустите двух перевариваемые продукты на 1%agarose гель. Затем вырежьте полосы под ультрафиолетовым светом.Очистить двухразовые продукты ПЦР и люциферазы из выкакциоровок. Продолжить перевязку продуктов ПЦР в векторы люциферазы, подготовив 20 микролитров перевязонной реакционной смеси, включая ДНК-лигазу. Кратко центрифуга трубки в течение 10 до 15 секунд.Инкубировать перевязку при 16 градусах по Цельсию на ночь с помощью теплового цикла. На следующий день, выполнить преобразование путем добавления перевязочные смеси в трубку, содержащую компетентные клетки. Аккуратно коснитесь трубки и держите ее на льду в течение 20 минут.Быстро и осторожно перенесите трубку в тепловой блок при температуре 42 градуса по Цельсию в течение 30 секунд до одной минуты. После теплового удара поместите трубку на лед на 20 минут. Распространение компетентных клеток на пластине LB агар.Выращиваем компетентные клетки в инкубаторе при 37 градусах Цельсия за одну ночь. На следующий день, выбрать индивидуальную колонию и повторно E.coli в одной из 8-полосных труб, содержащих ультрапурную воду, и повторить этот шаг, чтобы повторно E.coli от четырех до восьми случайно выбранных колоний. Перенесите 25 микролитров подвески E.coli в другой набор 8-полосных трубок.Выполните колонию PCR с помощью подвески E.coli. Подготовка анализа люциферазы в 24 хорошо пластины. Добавьте один-два раза десять к четырем клеткам в 500 микролитровых клеточных средствах массовой информации для каждого хорошо.После ночной инкубации, трансфект 50 нанограммов векторов люциферазы в клетки с контролем имитировать или конкретной микроРНК имитировать с помощью трансфектного реагента. На следующий день, мыть внутри скважин в два раза с помощью фосфата буфера солевого раствора. Нанесите 200 микролитров реагента лиза в скважины и достаточно провести клеточный лиз перед измерением активности люциферазы.Держите тарелку встряхивания, по крайней мере 15 минут. Перенесите от пяти до 10 микролитров лизайта клетки в новую трубку, добавьте 100 микролитров реагента один и сразу же смешайте раствор с помощью труб. Затем прочитайте активность светлячка люциферазы с помощью иллюминометра в течение 10-15 секунд.Добавьте 100 микролитров реагента два в одной трубке, а затем смешайте трубчатые дважды. Наконец, прочитайте активность renilla luciferase в течение 10-15 секунд с помощью иллюминометра. RTPCR показывает значительное сокращение микроРНК-107 и PANC-1 и CAPAN-1 клеток по сравнению с клетками HPNE.Уровни микроРНК-301 были значительно выше регулируется в клетках PANC-1 и CAPAN-1, по сравнению с клетками HPNE. Анализ SRB в этом исследовании ясно показывает, что пролиферация клеток PANC-1 снизилась после микроРНК-107 имитировать трансфекцию. Скрининг 11 потенциальных прогнозируемых целей микроРНК-107 ясно показывает, что только синуклеин гамма, или SNCG, положительный регулятор роста опухолевых клеток непосредственно взаимодействует с микроРНК-107 и клетками PANC-1, что указывает на то, что микроРНК-107 может негативно регулировать распространение клеток PANC-1, модулируя экспрессию SNCG.Взрослые клетки пролиферации анализы, которые используют тетра гидролея основе лица и CFSE применимы для проверки эффекта, такие как микроРНК имитирует, в зависимости от типов клеток. На основе экспериментально проверенной функции микроРНК требуется систематический обзор базы данных и программы целевого прогнозирования для сужения списка целей кандидатов до анализа люциферазы. Для оценки комбинированной эффективности микроРНК с противооскитными препаратами выгодно рассчитать скорректированные значения ИК на основе нашего протокола оценки комбинированного индекса.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Анализ окружающей среды твердые частицы-индуцированных хромосомных аберраций Использование номера<em&gt; In Vitro</em&gt; система

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Пептид происхождения Метод к транспорту генов и белков через клеточные и органелл барьеры в растений

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Системные поставки микроРНК с использованием рекомбинантного аденоассоциированный вирус серотипа 9 для лечения нервно-мышечных заболеваний у грызунов

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

В пробирке Assay биолюминесценции характеризовать Циркадный ритм в эпителиальных клеток молочной железы

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Протокол иммунопреципитации (чип) Chromatin для Low изобилие эмбриональных образцов

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Переходных выражение иностранных генов в клетках насекомых (sf9) для функциональных Assay протеина

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием дрозофилы

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Использование мыши молочных опухолевых клеток в in vitro Вторжение анализа в качестве меры онкогенной клеточной поведения

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...