Name: an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación de Ciencia Sacial A través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2017R1D1A3B03035662); y el Fondo de Investigación de la Universidad de Hallym, 2017 (HRF-201703-003).

1. Análisis de expresión de microARN maduro (miRNA)
<ol><li>
Síntesis madura de ADN complementario de miRNA (ADNc)
	<ol>
<li>Añadir 254 ng de ARN total y 4,5 l de mezclas de desoxirribonucleasa I (DNase I), y luego añadir agua ultrapura en tubos de tiras PCR para hacer hasta 18 l (Figura2A). Preparar la reacción para cada muestra total de ARN purificada a partir de varias líneas celulares utilizando la cantidad suficiente de mezclas DNase I basadas en el número tot...

<ol>
	<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells.">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs-103/107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy.">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li><li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis.">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li><li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs,+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells.">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li><li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+miR-155/FOXO3a+and+miR-222/PTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line.">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3.">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li><li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+miR-107,+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+(pHGGs).">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li><li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunting+of+targets:+challenge+in+miRNA+research.">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li><li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis:+not+all+kits+are+created+equal.">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents,+5-Aza-CdR+and+FK228,+in+Human+Gastric+Cancer+Cells.">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN.">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer.">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li><li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+(MTT)+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays.">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47 (2015).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202 (2010).</li><li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+me+count+the+ways:+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs.">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li><li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay.">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation.">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li><li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways.">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li><li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches.">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer.">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li><li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets.">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li><li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression.">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li><li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+B+(SRB)+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation.">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li><li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+hematological+malignancies.">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+anticancer+drugs.">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li><li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide.">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method.">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li><li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing.">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li></ol>

Las estrategias para la determinación de objetivos de miRNA de buena fe con las funciones de un miRNA de interés son indispensables para la comprensión de múltiples funciones de los miRNAs. La identificación de genes diana de miRNA puede ser una guía para interpretar los eventos de señalización celular modulados por los miRNAs en una célula. Una revelación de genes diana funcionalmente importantes de los miRNAs puede proporcionar el conocimiento fundamental para desarrollar una terapia basada en miRNA en el cá...

Los MicroARN (miRNAs) son los pequeños ARN reguladores que modulan principalmente el proceso de traducción y degradación de los ARN mensajeros (ARN) reaccionando a las 3' regiones no traducidas (3' UTR) en genes diana de buena fe1. La expresión de los miRNAs puede ser regulada por mecanismos transcripcionales y post-transcripcionales. El desequilibrio de estos mecanismos reglamentarios aporta niveles de expresión de miRNAs no controlados y distintivos en numerosas enfermedades, incluidos los cánceres2. Un solo miRNA puede tener múltiples interacciones con diversos ARNm. En consecuencia, un ARNm individual puede ser controlado por varios miRNAs. Por lo tanto, las redes de señalización intracelular están intrincadamente influenciadas por miRNA distintivamente expresadas por las cuales se pueden iniciar y deteriorar trastornos fisiológicos y enfermedades2,3,4, 5 , 6. Aunque la expresión alterada de los miRNAs se ha observado en varios tipos de cánceres, los mecanismos moleculares que modulan las formas de las células cancerosas en conjunto con los miRNAs son todavía en gran medida desconocidos.
La acumulación de evidencia ha estado demostrando que los roles oncogénicos o supresores de tumores de los miRNAs dependen de los tipos de cáncer. Por ejemplo, al apuntar a la caja de cabezal de horquilla o3 (FOXO3), miR-155 promueve la proliferación celular, metástasis y quimiorresistencia del cáncer colorrectal7,8. Por el contrario, la restricción de la invasión de células de glioma es inducida por miR-107 a través de la regulación de la locus de locus homolog proteína 2 (NOTCH2) expresión9. La evaluación de las interacciones miRNA-objetivo en relación con las funciones de miRNA es una parte indispensable para entender mejor cómo los miRNAs regulan varios procesos biológicos tanto en estados sanos como enfermos10. Además, el descubrimiento de objetivos de buena fe de los miRNAs puede proporcionar aún más una estrategia ajustada para una terapia basada en miRNA con varios medicamentos contra el cáncer. Sin embargo, el principal desafío en el campo de los miRNAs es la identificación de objetivos directos de los miRNAs. Aquí, los métodos detallados se presentan como enfoques experimentales reproducibles para la determinación del gen objetivo del miRNA. El diseño experimental exitoso para la identificación del objetivo miRNA implica varios pasos y consideraciones (Figura1). La comparación de los niveles de miRNA maduros en células tumorales y células normales puede ser uno de los procedimientos comunes para seleccionar un miRNA de interés (Figura1A). El estudio funcional de un miRNA seleccionado para detectar los efectos de un miRNA en la proliferación celular es importante para reducir la lista de los mejores objetivos candidatos potenciales de un miRNA de interés (Figura1B). Sobre la base de las funciones validadas experimentalmente de los miRNAs, se requiere una revisión sistemática de la literatura y la base de datos en compañía con un programa de predicción de objetivos de miRNA para buscar la información más relevante sobre las funciones genéticas (Figura1C). La identificación de genes diana reales de un miRNA de interés se puede lograr mediante la implementación de experimentos como el ensayo de luciferasa junto con la clonación de 3' UTR de un gen, PCR en tiempo real, y la hincha occidental (Figura1D). El objetivo del protocolo actual es proporcionar métodos integrales de experimentos clave, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real basada en sondas (PCR), el ensayo de sulforhodamine B (SRB) después de una transfección mimimetial, la generación de curvas de dosis-respuesta y un ensayo de imitación de miRNA, la generación de curvas de dosis-respuesta y ensayo de luciferasa junto con la clonación de 3' UTR de un gen. El protocolo actual puede ser útil para una mejor comprensión de las funciones de los miRNAs individuales y la implicación de un miRNA en la terapia contra el cáncer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading dye</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>RD006</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-cap strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010535</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010580</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-1L</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose A</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bio basic Canada Inc</td>
			<td>AB0028</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx 96 tube strips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401493</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx real-time PCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G8830A</td>
			<td>qPCR amplification, detection, and data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsiSI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0630</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPAN-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LCB-1203B-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chambers with V-slash</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>650010</td>
			<td>Cells counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>10X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN30200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NIPPON Genetics EUROPE</td>
			<td>MWD1</td>
			<td>1 Kb ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>100 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>100 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIT competent cells</td>
			<td>Real Biotech Corporation(RBC)</td>
			<td>RH617</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPNE cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar broth</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD7003</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>Model: E5311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Infinite F50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA control mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464058</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-107 mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464066</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>50 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus (electrophoresis system)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td></td>
			<td>Model: AD110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo explorer program</td>
			<td>GeneLink</td>
			<td></td>
			<td>For primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8X Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>500 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040117</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA miniprep S&#38; V kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN10200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R050A</td>
			<td>250 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Shaking platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LSI-3016A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 14 software</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td></td>
			<td>For dose-response curve generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine B powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1402-5G</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green master mix</td>
			<td>Smobio</td>
			<td>TQ12001805401-3</td>
			<td>Binding fluorescent dye for dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td>25,000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>200 reactions, no AmpErase UNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan miR RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C and 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>For amplification of DNA (or cDNA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells

Los MicroRNAs (miRNAs) son pequeños ARN reguladores que se reconocen para modular numerosas vías de señalización intracelular en varias enfermedades, incluidos los cánceres. Estos pequeños ARN reguladores interactúan principalmente con las 3' regiones no traducidas (3' UTR) de sus ARN mensajeros objetivo (RNN) lo que en última instancia resulta en la inhibición de los procesos de decodificación de ARNM y el aumento de las degradaciones de ARNm objetivo. Basados en los niveles de expresión y las funciones intracelulares, los miRNAs son capaces de servir como factores reguladores de los ARNM oncogénicos y supresores tumorales. La identificación de genes diana de buena fe de un miRNA entre cientos o incluso miles de objetivos predicados computacionalmente es un paso crucial para discernir las funciones y los mecanismos moleculares básicos de un miRNA de interés. Varios programas de predicción de objetivos de miRNA están disponibles para buscar posibles interacciones miRNA-mRNA. Sin embargo, la pregunta más difícil es cómo validar los genes diana directos de un miRNA de interés. Este protocolo describe una estrategia reproducible de métodos clave sobre cómo identificar objetivos de miRNA relacionados con la función de un miRNA. Este protocolo presenta una guía práctica sobre los procedimientos paso a paso para descubrir los niveles de miRNA, funciones y ARNM objetivo relacionados utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la sonda, el ensayo de sulforhodamine B (SRB) después de una imitación de miRNA en la transfección , la generación de curvas de dosis-respuesta y el ensayo de luciferasa junto con la clonación de 3' UTR de un gen, que es necesario para una comprensión adecuada de las funciones de los miRNAs individuales.

La confirmación exitosa y precisa de los niveles de miRNA es importante para la interpretación de los datos mediante los cuales la clasificación de los miRNAs es posible sobre la base de las funciones previstas de los miRNAs en el desarrollo y progresión de una enfermedad. Los niveles de miRNA-107 y miRNA-301 se midieron en tres líneas celulares de páncreas utilizando el PCR cuantitativo basado en sondas. La síntesis de cDNAs de un miRNA específico y un gen de referencia en la misma reacción puede aumentar la re...

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An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Este protocolo utiliza una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en sondas en tiempo real, un ensayo de sulforhodamine B (SRB), 3' regiones no traducidas (3' UTR) clonación, y un ensayo de luciferasa para verificar los genes diana de un miRNA de interés y para entender las funciones de los miRNAs.

Un protocolo in vitro para evaluar los niveles, funciones y genes objetivo asociados de MicroRNA en células tumorales

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Acceder a las interacciones de los objetivos de microARN neuronal con las funciones de MicroRNA es fundamental para entender cómo los MicroRN reguladas regulan diversos procesos biológicos tanto en estados sanos como enfermos. Este protocolo describe la reproducción a través de la estrategia para identificar los objetivos de microARN y los microARN funcionales, ya que la validación del objetivo directo de los microARN es un desafío. Nuestro protocolo puede proporcionar información sobre la función de los microRNAs individuales y la implicación de un microARN en la terapia oncológica.El cálculo de la concentración inhibitoria media máxima es un método importante, no sólo para los estudios de microARN, sino para la evaluación eficaz de otros fármacos contra el cáncer. Nuestro protocolo será útil para los nuevos investigadores ya que describimos el método fundamental para entender el nivel de microRNAs en una célula. Para comenzar el protocolo, cuente las celdas con el contador de celdas.Placar las células en una placa de 96 pozos. Al día siguiente, preparar un conjunto de mezclas de transfección para transfecar las células en varias concentraciones finales de imitación de control de microARN, y microRNA-107 imitar. A partir de un stock de 25 micromolares microRNA control mímico, o microRNA-107 imitar, diluir y añadir control imitar o microRNA-107 imitar en los medios séricos reducidos junto con el reactivo de transfección en tubos de microcentrífuga.Mezcle suavemente las mezclas que contienen oligoconsúceos con una micropipeta. Después de una incubación de 10 minutos en la capucha de cultivo celular, mezcle suavemente las mezclas que contienen oligoconteniendo de nuevo, y luego agregue 50 microlitros de las mezclas en cada pocóyo. Mantener las células trans infectadas en una incubadora de cultivo celular.Aspirar cuidadosamente el medio de cultivo celular en cada pozo de la placa y llenar rápidamente 100 microlitros de 10%ácido tricloroacético, o TCA, en cada pozo. Mantenga la placa que contiene 10%TCA a cuatro grados Celsius durante una hora. A continuación, lave la placa varias veces sumergiéndola en una bañera con agua del grifo.Retire el exceso de agua del interior de los pozos tocando la placa hasta que no quede agua y seque la placa. Pipetear 50 microlitros de solución de 0,4% SRB en cada pozo, incluidos los pozos en blanco. Agitar suavemente la placa hasta que la solución 0.4%SRB cubra uniformemente la parte inferior de los pozos.Luego, incubar el plato durante 40 a 60 minutos. Después de la incubación, lave el plato con 1%ácido acético hasta que el tinte sin ataduras se lave totalmente. Pipetear 100 microlitros de 10 mililitros de solución base Tris en los pozos correspondientes, incluyendo pozos en blanco.Mantenga el plato en una coctelera durante 10 minutos. Mida la absorbancia a 492 nanómetros. Calcular el porcentaje de absorbancia media y la desviación estándar de cada grupo utilizando los valores de absorbancia del ensayo SRB.Importe los datos sin procesar, incluidas las concentraciones de tratamiento, la absorbancia media y la desviación estándar en el software alineando verticalmente los datos. Haga clic en la pestaña Crear gráfico y elija las barras de error de dispersión simple. Seleccione columnas de hoja de cálculo como Valores de símbolo y haga clic en Siguiente.En el panel Formato de datos, seleccione Pares X-Y y haga clic en Siguiente. Seleccione las columnas de datos correspondientes en el panel Seleccionar datos. Haga clic en Finalizar para crear el trazado.Haga doble clic en el eje X para modificar el tipo de escala en la escala del eje. Cambie el tipo de escala de lineal a log. Modifique el número de rango inicial y final a 0.01 y 200, respectivamente.Haga clic con el botón derecho en cualquier gráfico de dispersión, elija Ajuste de curva y vaya a la subcategoría Definido por el usuario. Seleccione la curva de respuesta a la dosis. Haga clic en los botones siguientes y, a continuación, haga clic en Finalizar.Vaya a la pestaña Informe y, a continuación, compruebe los valores n, k y R. Ejecute el PCR como se detalla en el protocolo de texto adjunto. A continuación, pasar a la doble digestión mediante la combinación de las mezclas de reacción, incluyendo las enzimas de restricción Exo1 y Not1 uno en un tubo.Incubar las mezclas durante tres a cuatro horas en un baño de agua Celsius de 37 grados. Ejecuta los productos de doble digestión con un gel de 1% de agarosa. A continuación, corte las bandas bajo la luz UV.Purificar los productos de PCR de doble digestión y los vectores de luciferasa de las bandas extirpadas. Continuar con la ligadura de los productos PCR en los vectores de luciferasa mediante la preparación de 20 microlitros de mezclas de reacción de ligadura incluyendo la ligasa de ADN. Centrifuga brevemente el tubo durante 10 a 15 segundos.Incubar la ligadura a 16 grados centígrados durante la noche usando un ciclor térmico. Al día siguiente, realice la transformación añadiendo las mezclas de ligadura en el tubo que contiene células competentes. Toque suavemente el tubo y manténgalo sobre hielo durante 20 minutos.Transfiera rápida y suavemente el tubo a un bloque de calor a 42 grados Celsius durante 30 segundos a un minuto. Después de un choque de calor, coloque el tubo sobre hielo durante 20 minutos. Extienda las células competentes en una placa de agar LB.Cultivar células competentes en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, escoge una colonia individual y resuspend E.coli en uno de los tubos de 8 tiras que contienen agua ultrapura, y repite este paso para resuspender E.coli de cuatro a ocho colonias seleccionadas al azar. Transfiera 25 microlitros de suspensión E.coli a otro conjunto de tubos de 8 tiras.Realice la pcR de la colonia utilizando la suspensión E.coli. Prepare el ensayo de luciferasa en un plato de 24 pozos. Agregue de una a dos veces diez a las cuatro células en un medio de cultivo celular de 500 microlitrotros para cada pozo.Después de la incubación durante la noche, transfect 50 nanogramos de vectores de luciferasa en las células con imitación de control o un microARN específico imitando usando un reactivo de transfección. Al día siguiente, lave el interior de los pozos dos veces usando solución salina tamponada con fosfato. Aplicar 200 microlitros de reactivo de lelisis en los pozos y realizar suficientemente la lelisis celular antes de medir la actividad de la luciferasa.Mantenga la placa agitada durante al menos 15 minutos. Transfiera de cinco a 10 microlitros de celtuado en el nuevo tubo, y agregue 100 microlitros de reactivo uno y mezcle inmediatamente la solución por pipeteo. Luego lee la actividad de la luciferasa de la luciérnquea usando el iluminamínómetro durante 10 a 15 segundos.Añadir 100 microlitros de reactivo dos en el mismo tubo y luego mezclar por pipeteo dos veces. Por último, lea la actividad de renilla luciferasa durante 10 a 15 segundos utilizando el iluminamínómetro. RTPCR muestra una reducción significativa de las células microRNA-107 y PANC-1 y CAPAN-1 en comparación con las células HPNE.Los niveles de microRNA-301 fueron significativamente regulados en células PANC-1 y CAPAN-1, en comparación con las células HPNE. El ensayo SRB en este estudio demuestra claramente que la proliferación de células PANC-1 disminuyó después de una transfección imitada de microRNA-107. El cribado de 11 posibles dianas predichas de microRNA-107 muestra claramente que sólo la sinucleína gamma, o SNCG, un regulador positivo del crecimiento de células tumorales interactúa directamente con las células microRNA-107 y PANC-1, lo que indica que el microRNA-107 puede regular negativamente la proliferación de células PANC-1 modulando la expresión SNCG.Los ensayos de proliferación celular para adultos que utilizan la entidad basada en tetrahidleono y CFSE son aplicables para analizar el efecto de tales, como imitaciones de microARN, dependiendo de los tipos de células. Sobre la base de la función validada experimentalmente de los microRNAs, se requiere una revisión sistemática de la base de datos y el programa de predicción de objetivos para reducir la lista de objetivos candidatos antes de los ensayos de luciferasa. Para la evaluación de la eficiencia combinada de microARN con fármacos contra el cáncer, es ventajoso calcular los valores de IC ajustados basados en nuestro protocolo para la evaluación del índice de combinación.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

El análisis de la inducida por la materia particulada ambiental aberraciones cromosómicas El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Investigación

Genética

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Péptido derivado Método para el transporte de genes y proteínas a través de celular y Barreras Organellar en Plantas

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Entrega sistémica de microARN mediante Virus Adeno-asociado recombinante serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

El uso de células tumorales mamarias de ratón en un ensayo de invasión in vitro como medida del comportamiento de las células oncogénicas

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...