Name: an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

Denna studie stöddes av Basic Science Research program genom National Research Foundation of Korea (NRF) som finansieras av undervisningsministeriet (2017R1D1A3B03035662); och Hallym universitetets forskningsfond, 2017 (HRF-201703-003).

1. mogna MicroRNA (miRNA) uttrycks analys
<ol><li>
Mogen miRNA komplementär DNA (cDNA) syntes
	<ol>
<li>Tillsätt 254 ng av totalt RNA och 4,5 μl deoxyribonuclease i (DNase i) blandningar, och tillsätt sedan ultrarent vatten i PCR-bandrör för att göra upp till 18 μl (figur 2A). Bered reaktionen för varje totalt RNA-prov som renas från flera cellinjer med tillräckligt mycket DNase I-blandningar baserat på det totala antalet reaktioner. Anmärkning:</st...

<ol>
	<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells.">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs-103/107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy.">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li><li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li><li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis.">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li><li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs,+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells.">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li><li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+miR-155/FOXO3a+and+miR-222/PTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line.">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3.">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li><li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+miR-107,+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+(pHGGs).">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li><li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunting+of+targets:+challenge+in+miRNA+research.">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li><li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis:+not+all+kits+are+created+equal.">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents,+5-Aza-CdR+and+FK228,+in+Human+Gastric+Cancer+Cells.">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN.">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer.">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li><li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+(MTT)+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays.">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47 (2015).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202 (2010).</li><li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+me+count+the+ways:+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs.">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li><li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay.">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation.">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li><li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways.">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li><li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches.">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer.">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li><li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets.">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li><li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression.">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li><li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+B+(SRB)+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation.">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li><li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+hematological+malignancies.">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+anticancer+drugs.">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li><li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide.">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method.">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li><li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing.">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li></ol>

Strategier för bestämning av bona fide miRNA mål med funktioner av en miRNA av intresse är oumbärliga för förståelsen av flera roller miRNAs. Identifiering av miRNA-målgener kan vara en riktlinje för tolkning av cellsignalering-händelser som modulateras av miRNAs i en cell. En avtäckningen av funktionellt viktiga målgener av miRNAs kan ge grundläggande kunskaper för att utveckla en miRNA-baserad terapi i cancer.
Flera metoder såsom Microarrays, små RNA-bibliotek sekvensering, ...

MicroRNAs (miRNAs) är de små reglerande RNAs som huvudsakligen modulera processen för översättning och nedbrytning av Messenger RNAs (mRNAs) genom att reagera på 3 ' oöversatta regioner (3 ' UTR) i bona fide målgener1. Uttryck för miRNAs kan regleras genom transkriptionella och posttranskriptionella mekanismer. Obalansen i sådana regleringsmekanismer ger okontrollerade och distinkta miRNAs-uttrycksnivåer i många sjukdomar, inklusive cancer2. En enda miRNA kan ha flera interaktioner med olika mRNAs. På motsvarande sätt kan en individuell mRNA styras av olika miRNAs. Därför är intracellulära signal nätverk intrikat influerade av tydligt uttryckt mirnas genom vilka fysiologiska störningar och sjukdomar kan initieras och försämras2,3,4, ,5 , 6. även om det förändrade uttrycket av mirnas har observerats i olika typer av cancer, de molekylära mekanismer som modulera sätt cancerceller i samband med mirnas är fortfarande till stor del okända.
Ackumulerande bevis har visat att de onkogena eller tumör-suppressiva roller miRNAs beror på vilka typer av cancer. Till exempel, genom att rikta forkhead Box O3 (FOXO3), Mir-155 främjar cellproliferation, metastaser, och kemoresistens av kolorektal cancer7,8. Däremot är begränsningen av gliom cell invasion induceras av Mir-107 via regleringen av neurogena Locus notch homolog protein 2 (NOTCH2) uttryck9. Bedömningen av miRNA-målinteraktioner i samband med miRNA-funktioner är en oumbärlig del för att bättre förstå hur miRNAs reglerar olika biologiska processer i både friska och sjuka stater10. Dessutom kan upptäckten av bona fide Target (s) av miRNAs ytterligare ge en finjusterad strategi för en miRNA-baserad behandling med olika läkemedel mot cancer. Den största utmaningen inom området miRNAs är dock att identifiera de direkta målen för miRNAs. Här presenteras detaljerade metoder som reproducerbara experimentella metoder för att fastställa miRNA-målgen. Framgångsrik experimentell design för miRNA Target identifiering omfattar olika steg och överväganden (figur 1). Jämförelse av mogna miRNA nivåer i tumörceller och normala celler kan vara en av de vanligaste förfarandena för att välja en miRNA av intresse (figur 1a). Den funktionella studie av en utvald miRNA att upptäcka effekterna av en miRNA på cellproliferation är viktigt att begränsa listan över bästa potentiella kandidat mål av en miRNA av intresse (figur 1b). Baserat på miRNAs experimentellt validerade funktioner krävs en systematisk genomgång av litteratur och databas i sällskap med ett miRNA-målprediktionsprogram för att söka den mest relevanta informationen om gen funktioner (figur 1c). Identifieringen av verkliga målgener av en Mirna av intresse kan uppnås genom att genomföra experiment som luciferas analysen tillsammans med kloning av 3 ' utr av en gen, realtid PCR, och Western blotting (figur 1d). Målet med det nuvarande protokollet är att tillhandahålla omfattande metoder för viktiga experiment, den sond-baserade realtid polymeras kedjereaktion (PCR), sulforodamin B (SRB) assay efter en Mirna Mimic transfektion, dos-respons kurva generation, och luciferas-analysen tillsammans med kloningen av 3 ' utr av en gen. Det nuvarande protokollet kan vara användbart för en bättre förståelse av funktionerna hos enskilda miRNAs och implikationen av en miRNA i cancerterapi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading dye</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>RD006</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-cap strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010535</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010580</td>
			<td>For cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-1L</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose A</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bio basic Canada Inc</td>
			<td>AB0028</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx 96 tube strips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401493</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AriaMx real-time PCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G8830A</td>
			<td>qPCR amplification, detection, and data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsiSI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0630</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPAN-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LCB-1203B-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chambers with V-slash</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>650010</td>
			<td>Cells counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>10X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN30200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NIPPON Genetics EUROPE</td>
			<td>MWD1</td>
			<td>1 Kb ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>100 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>100 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIT competent cells</td>
			<td>Real Biotech Corporation(RBC)</td>
			<td>RH617</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPNE cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar broth</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD7003</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>Model: E5311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Infinite F50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA control mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464058</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-107 mimic</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4464066</td>
			<td>5 nmole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>50 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus (electrophoresis system)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td></td>
			<td>Model: AD110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo explorer program</td>
			<td>GeneLink</td>
			<td></td>
			<td>For primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8X Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td>For real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>500 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040117</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA miniprep S&#38; V kit</td>
			<td>Bionics</td>
			<td>DN10200</td>
			<td>200 prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R050A</td>
			<td>250 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td>Shaking platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Model: LSI-3016A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 14 software</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td></td>
			<td>For dose-response curve generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine B powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1402-5G</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green master mix</td>
			<td>Smobio</td>
			<td>TQ12001805401-3</td>
			<td>Binding fluorescent dye for dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td>25,000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>200 reactions, no AmpErase UNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
			<td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan miR RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C and 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661-100G</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>For amplification of DNA (or cDNA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro protocol for evaluating microrna levels, functions, and associated target genes in tumor cells

MicroRNAs (miRNAs) är små reglerande RNAs som är erkända för att modulera många intracellulära signalvägar i flera sjukdomar inklusive cancer. Dessa små reglerande RNAs samverkar främst med 3 ' oöversatta regioner (3 ' UTR) av deras mål Messenger RNAs (mRNAs) i slutändan resulterar i hämning av avkodnings processer av mRNAs och förstärkning av Target mRNA degradations. Baserat på uttrycks nivåer och intracellulära funktioner, miRNAs kan fungera som reglerande faktorer för onkogena och tumör-suppressiv mRNAs. Identifiering av bona fide målgener av en miRNA bland hundratals eller till och med tusentals beräkningsmässigt förutspådda mål är ett viktigt steg för att urskilja rollerna och grundläggande molekylära mekanismer för en miRNA av intresse. Olika miRNA mål förutsägelse program finns tillgängliga för att söka möjliga miRNA-mRNA interaktioner. Men den mest utmanande frågan är hur man validerar direkta målgener av en miRNA av intresse. Detta protokoll beskriver en reproducerbar strategi av viktiga metoder för hur man identifierar miRNA mål relaterade till funktionen av en miRNA. Detta protokoll presenterar en praktisk vägledning om steg-för-steg-procedurer för att avslöja Mirna-nivåer, funktioner och relaterade mål-mrnas med hjälp av sond-baserade realtid polymeras kedjereaktion (PCR), sulforodamin B (SRB) assay efter en Mirna Mimic transfektion , dos-respons kurva generation, och luciferas assay tillsammans med kloning av 3 ' utr av en gen, vilket är nödvändigt för att korrekt förstå rollerna för enskilda mirnas.

Framgångsrik och korrekt bekräftelse av miRNA-nivåer är viktigt för tolkningen av data genom vilka klassificeringen av miRNAs är möjlig baserat på de förväntade rollerna av miRNAs i utvecklingen och utvecklingen av en sjukdom. Nivåerna av miRNA-107 och miRNA-301 mättes i tre bukspottskörteln cellinjer med hjälp av sond-baserade kvantitativa PCR. Syntesen av cDNAs av både en specifik miRNA och en referens gen i samma reaktion kan öka reproducerbarheten av data. Panc-1 och Capan-1 är mänskliga bukspottsk?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells at JoVE.com

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Detta protokoll använder en sond-baserade realtid polymeras kedjereaktion (PCR), en sulforodamin B (SRB) assay, 3 ' oöversatta regioner (3 ' utr) kloning, och en luciferas analys för att kontrollera målgener av en Mirna av intresse och att förstå funktionerna i mirnas.

Ett in vitro-protokoll för utvärdering av mikroRNA nivåer, funktioner och associerade målgener i tumörceller

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

För att komma åt neurala microRNA mål interaktioner med MicroRNA funktioner är avgörande för att förstå hur MicroRNAs reglera olika biologiska processer i både friska och sjuka stater. Detta protokoll beskriver reproducera genom strategi för att identifiera microRNA mål och funktionella microRNAs som validering av direkt mål för microRNAs är utmanande. Vårt protokoll kan ge insikter om funktionen av enskilda microRNAs och innebörden av ett mikroRNA i cancerterapi.Beräkning av den halv-maximala hämmande koncentrationen är en viktig metod, inte bara för mikroRNA-studier utan för den effektiva utvärderingen av andra läkemedel mot cancer. Vårt protokoll kommer att vara till hjälp för nya forskare eftersom vi beskrev den grundläggande metoden för att förstå nivån på microRNAs i en cell. Börja protokollet genom att räkna cellerna med cellräknaren.Platta cellerna i en 96 brunnsplatta. Nästa dag, förbereda en uppsättning transfektion blandningar att transfekt cellerna i flera slutliga koncentrationer av microRNA kontroll härma, och microRNA-107 härma. Från ett lager av 25 mikromolar microRNA kontroll härma, eller microRNA-107 härma, späda ut och lägga kontroll härma eller microRNA-107 härma i den reducerade serum media tillsammans med transfektion reagens i mikrocentrifugrör.Blanda försiktigt de oligohaltiga blandningarna med hjälp av en mikropipette. Efter en 10 minuters inkubation i cellodlingshuven, blanda försiktigt de oligohaltiga blandningarna igen, och tillsätt sedan 50 mikroliter av blandningarna i varje brunn. Håll de transfekterade cellerna i en inkubator för cellodling.Aspirera försiktigt cellodlingsmedierna i varje brunn av plattan och snabbt fylla 100 mikroliter av 10%triklorättiksyra, eller TCA, i varje brunn. Håll plattan som innehåller 10% TCA vid fyra grader Celsius i en timme. Därefter tvätta plattan flera gånger genom att dränka den i ett badkar med kranvatten.Ta bort överflödigt vatten från insidan av brunnarna genom att knacka på plattan tills det inte finns något vatten kvar, och torka plattan. Pipett 50 mikroliter med 0,4%SRB lösning i varje brunn inklusive de tomma brunnarna. Skaka försiktigt plattan tills 0,4%SRB-lösningen jämnt täcker botten av brunnarna.Sedan, inkubera plattan i 40 till 60 minuter. Efter inkubationen, tvätta plattan med 1%ättiksyra tills det obundna färgämnet är helt tvättas bort. Pipett 100 mikroliter av 10 millimol Tris baslösning i motsvarande brunnar, inklusive blanka brunnar.Håll plattan på en shaker i 10 minuter. Mät absorbansen vid 492 nanometer. Beräkna procenten av genomsnittlig absorbans och standardavvikelsen för varje grupp med hjälp av absorbansvärden för SRB-analysen.Importera rådata inklusive behandlingskoncentrationer, genomsnittlig absorbans och standardavvikelse till programvaran genom att vertikalt anpassa data. Klicka på fliken Skapa graf och välj de enkla punktfelstaplarna. Markera kalkylbladskolumner som Symbolvärden och klicka på nästa.Välj X-Y-par på dataformatpanelen och klicka på nästa. Markera motsvarande datakolumner på panelen Markera data. Klicka på slutför för att skapa tomten.Dubbelklicka på X-axeln för att ändra typ av skala i skalning av axel. Ändra typ av skala från linjär till logg. Ändra start- och slutintervallsnumret till 0,01 respektive 200.Högerklicka på valfri scatter-plot, välj Kurvpassning och gå till underkategorin User Defined. Välj dos responskurva. Klicka på nästa knappar och sedan på Slutför.Gå till rapportfliken och kontrollera sedan värdena n, k och R. Kör PCR som detaljerat i det medföljande textprotokollet. Gå sedan vidare till dubbel-matsmältning genom att kombinera reaktionsblandningarna, inklusive restriktionsenzymerna Exo1 och Not1 en i ett rör.Inkubera blandningarna i tre till fyra timmar i ett 37 graders Celsius vattenbad. Kör de dubbelsmälta produkterna på en 1%agarosgel. Klipp sedan banden i UV-belysning.Rena de dubbelsmälta PCR-produkterna och luciferasvektorerna från de strukna banden. Fortsätt med ligation av PCR-produkterna in i luciferasvektorerna genom att förbereda 20 mikroliter av ligeringsreaktionsblandningar inklusive DNA-ligasen. Kort centrifugera röret i 10 till 15 sekunder.Inkubera ligering vid 16 grader Celsius över natten med hjälp av en termisk cycler. Nästa dag, utföra omvandling genom att lägga till ligering blandningarna i röret som innehåller kompetenta celler. Knacka försiktigt på tuben och håll det på is i 20 minuter.Snabbt och försiktigt överföra röret till en värmeblock på 42 grader Celsius i 30 sekunder till en minut. Efter värmechock placerar du röret på is i 20 minuter. Sprid kompetenta celler på en LB-agarplatta.Odla kompetenta celler i en inkubator vid 37 grader Celsius över natten. Följande dag, välj en enskild koloni och resuspend E.coli i en av de 8-bandsrör som innehåller ultrarent vatten, och upprepa detta steg för att återanvända E.coli från fyra till åtta slumpmässigt utvalda kolonier. Överför 25 mikroliter E.coli suspension till en annan uppsättning 8-bandsrör.Utför kolonin PCR med hjälp av E.coli-fjädringen. Förbered luciferasanalysen i en 24 brunnsplatta. Lägg till en till två gånger tio till de fyra cellerna i en 500 microliter cell kultur media för varje brunn.Efter inkubering över natten, transfekt 50 nanogram luciferas vektorer i cellerna med kontroll härma eller en specifik microRNA härma med hjälp av en transfektion reagens. Nästa dag, tvätta insidan av brunnarna två gånger med hjälp av fosfat buffrad saltlösning. Applicera 200 mikroliter av lysreagens i brunnarna och tillräckligt utföra celllys innan du mäter luciferasaktiviteten.Håll plattan skakande i minst 15 minuter. Överför fem till tio mikroliter cellers lysate i det nya röret, och tillsätt 100 mikroliter reagens en och blanda omedelbart lösningen genom pipettering. Läs sedan firefly luciferasaktiviteten med hjälp av illuminometer i 10 till 15 sekunder.Tillsätt 100 mikroliter reagens två i samma rör och blanda sedan genom pipettering två gånger. Slutligen, läs renilla luciferasaktiviteten i 10 till 15 sekunder med hjälp av illuminometer. RTPCR visar en signifikant minskning av microRNA-107 och PANC-1 och CAPAN-1 celler jämfört med HPNE celler.Nivåerna av mikroRNA-301 var betydligt upregulated i PANC-1 och CAPAN-1 celler, jämfört med HPNE celler. SRB-analysen i denna studie visar tydligt att spridningen av PANC-1-celler minskade efter en microRNA-107 mimic transfection. Screening av 11 potentiella förutspådde mål av microRNA-107 visar tydligt att endast synuclein gamma, eller SNCG, en positiv regulator av tumör celltillväxt direkt interagerar med microRNA-107 och PANC-1 celler, vilket tyder på att microRNA-107 kan negativt reglera spridningen av PANC-1 celler genom modulering av SNCG uttryck.Adult cell proliferation assays som använder den tetra hydroleum-baserade entiteten och CFSE är tillämpliga för att skärmen effekten av såsom microRNA härmar, beroende på celltyper. Baserat på experimentellt validerade funktion av microRNAs, en systematisk genomgång av databas och mål förutsägelse program krävs för att begränsa listan över kandidat mål innan luciferase analyser. För utvärdering av kombinationseffektivitet av mikroRNA med läkemedel mot cancer är det fördelaktigt att beräkna justerade IC-värden baserat på vårt protokoll för bedömning av kombinationsindex.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analys av omgivnings Partiklar-inducerad kromosomavvikelser Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptid-härledda metod för att transportgener och proteiner över Cellular och organeller hinder i växter

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemiska leverans av mikroRNA använda rekombinant Adeno-associerade Virus serotyp 9 neuromuskulära sjukdomar hos gnagare

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Mareld Assay att karakterisera dygnsrytmen i mjölkkörtlar epitelceller

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokoll för låg-överflöd embryonala prover

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Övergående uttryck av främmande gener i insekt celler (sf9) för Protein funktionell analys

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekvensering: Kompletterande DNA bibliotek förberedelse protokoll använder Formalin-fast Paraffin-inbäddat RNA exemplar

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering, karakterisering och mikroRNA-baserad genetisk modifiering av mänskliga dentala follikeln stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funktionell studie av sjukdomsassocierade sällsynta humana varianter med hjälp av Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Användningen av mus mammary tumörceller i en in vitro-invasion analys som ett mått på onkogena cell beteende

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...